全 文 ：文章编号:1001 － 4829(2013)02 － 0718 － 05
收稿日期:2012 － 08 － 21
基金项目:辽宁省教育厅项目(L2010495) ;中国博士后科学基
金面上项目资助(20100471471) ;高等学校博士学科点专项科
研基金联合资助课题(20112103120005)
作者简介:陈丽静(1971 －) ，女，山东海阳人，副教授，博士，研
究方向:植物基因工程与细胞工程，Tel:024-88487164，E-mail:
chenlijing1997@ 126． com，* 为通讯作者，Tel:024-88487166，E-
mail:ltl@ syau． edu． cn。
细叶百合鳞片诱导与遗传转化组培体系的建立
陈丽静1，殷小娟1，李俊岚1，钟 鸣1，马 慧1，李浩戈1，李天来1* ，陶承光2
(1．沈阳农业大学 /辽宁省生物技术重点实验室 /设施园艺省部共建教育部重点实验室，辽宁 沈阳 110866;2．辽宁省农业科学院，
辽宁 沈阳 110161)
摘 要:为扩大细叶百合(Lilium pumilun)在生物技术领域的应用，本研究以细叶百合鳞片为外植体，MS培养基为基础培养基，附
加不同种类和浓度的植物生长调节物质(6-BA，NAA，IAA，IBA)诱导丛生芽及再生植株，对体系中外植体消毒时间及各阶段培养
基的激素配比进行了研究。结果表明:0． 1 %氯化汞溶液最佳灭菌时间为 8 min;最佳诱导培养基为 MS +6-BA 0． 5 mg /L + NAA 0．
1 mg /L;最佳继代培养基为 MS +6-BA 1． 0 mg /L + NAA 0． 1 mg /L;最佳增殖培养基为 MS + 6-BA 0． 1 mg /L + NAA 0． 5 mg /L;最佳
生根培养基为 1 /2 MS + IAA 0． 1 mg /L + IBA 0． 1 mg /L。
关键词:细叶百合;组织培养;灭菌时间;激素
中图分类号:S682． 2 + 9 文献标识码:A
Induction of Lilium pumilun Bulb and Establishment of
Genetic Transformation’s Tissue Culture System
CHEN Li-jing1，YIN Xiao-juan1，LI Jun-lan1，ZHONG Ming1，MA Hui1，LI Hao-ge1，LI Tian-lai1* ，TAO Cheng-guang2
(1． Shenyang Agriculture University /Bioscience and Technology Institute of Liaoning Province / Key Laboratory of Protected Horticulture
(Ministry of Education) ，Liaoning Shenyang 110866，China;2． The Liaoning Academy of Agricultural Sciences，Liaoning Shenyang
110161，China)
Abstract:In order to expand the adhibition of Lilium pumilum in biotechnology fields，the bulbs of Lilium pumilun were used as explants in
this study． MS medium applied with different concentration of hormone (6-BA，NAA，IAA，IBA)was examined to induce the cluster bud
and regeneration plant． And the sterilization time of explants and the ratio of different hormone were also analyzed in every phase of tissue
culture． The results showed that the optimum sterilization time of 0． 1 % Mercuric chloride solution was 8 min;the MS medium with 6-BA
0． 5 mg /L + NAA 0． 1 mg /L was the optimum inductive medium;the MS medium with 6-BA 1． 0 mg /L + NAA 0． 1 mg /L was the optimum
subculture medium;the MS medium with 6-BA 0． 1 mg /L + NAA 0． 5 mg /L was the optimum multiplication medium and the optimum roo-
ting medium was 1 /2MS supplemented with IAA 0． 1 mg /L + IBA 0． 1 mg /L．
Key words:Lilium pumilun;Tissue culture;Sterilization time;Hormone
细叶百合(Lilium pumilun) ，别名山丹，是野生
百合的一种，具有良好的观赏性状及极强的抗病性、
抗旱性、耐寒性和耐盐碱能力，并且细叶百合对土壤
要求不严，是百合抗性育种的优良亲本［1］。随着现
代生物技术育种的快速发展，细叶百合的组织培养
在转基因生物技术领域的作用日益突出，而细叶百
合组培体系的建立是转基因技术发展的重要基础。
我国野生百合存在大量变异，并且遗传多样性
较丰富，到目前为止很多资源都没有得到有效利用，
且破坏流失严重，多样性逐渐降低，亟待保护。通过
组织培养手段诱导细叶百合鳞片，并建立其遗传转
化再生体系，不但可以得到大量的脱毒苗，降低成
本，保存品种本身的优良性状，也有助于目的基因顺
利进行遗传转化。另外，利用植物组织培养生产的
带性状优良的观赏植物，具有不受地区、季节和气候
限制，便于工厂化生产等优点，并且组织培养中的细
胞生长速度比植物正常生长速度快［2 ～ 3］，生产周期
短。细叶百合是百合抗性育种的重要亲本，有较高
817
西 南 农 业 学 报
Southwest China Journal of Agricultural Sciences
2013 年 26 卷 2 期
Vol. 26 No. 2
的抗性，具有抗镰刀菌、叶枯病及抗干旱，抗盐碱的
特性［4］，而当前对细叶百合的研究大多数集中在分
类学、生物学、无形繁殖、杂交育种等方面［5 ～ 10］，关
于细叶百合组织培养国内外虽然已有个别报
道［11 ～ 12］，但研究多不够深入且对细叶百合各组织培
养各阶段的阐述不够完整，为此，本研究以组织培养
为基础诱导细叶百合鳞片，建立完整的细叶百合遗
传转化组培体系，为进一步的细胞工程、基因工程及
诱变育种等研究的奠定基础。
1 材料与方法
1． 1 试验时间、地点
试验于 2009 年在辽宁省农业生物技术重点实
验室和设施园艺省部共建教育部重点实验室进行。
1． 2 试验材料
1． 2． 1 材料 细叶百合(Lilium pumilun)鳞茎。试
材鳞片保持完好，抱合紧密，健壮、无病斑、色泽光
亮、无机械损伤、鳞茎盘无损坏。
1． 2． 2 培养基 试验所用基本培养基为 MS 培养
基。附加蔗糖 30 g，琼脂 7 g，据试验需求添加其他
物质，pH 5． 8，121 ℃高压灭菌 25 min。接种后放到
培养室中培养，温度控制在 23 ℃左右，光照时间 12
～ 16 h，光照强度 2000 ～ 3000 lx。
1． 3 试验方法
1． 3． 1 最佳灭菌时间的筛选 剥取健康的鳞片，置
于小烧杯中，用纱布封口，自来水流水冲洗 2 h，放入
超净工作台，用 75 %酒精浸泡 30 s，无菌水冲洗 1
次，再用 0． 1 %氯化汞溶液分别设置 5、6、7、8、9、
10、11、12 min等 8 个时间梯度进行灭菌处理，无菌
水冲洗 5 ～ 6 次［13 ～ 14］，在灭菌滤纸上吸干表面水分，
接种于诱导分化培养基中。毎处理重复 30 次，每瓶
接种 1 个外植体。放入培养室中，25 d 后观察记录
各处理成活数量，通过对成活率的帅选确定最佳处
理时间。
1． 3． 2 最佳诱导培养基的筛选 以 MS 为基本培
养基，分别附加不同浓度的 6-BA和 NAA，每处理重
复 15 次，每瓶接种 1 个外植体鳞片，培养 25 d 后，
观察并记录分化鳞片数，通过比较其分化率，选出最
佳诱导分化的培养基。
1． 3． 3 最佳继代培养基的筛选 从初代培养生长
健壮的细叶百合试管苗中挑选出长势基本一致的幼
苗，将其进行切割后，进行继代培养。以 MS 培养基
为基本培养基，分别附加不同浓度的 6-BA 和 NAA，
毎个处理重复 20 次，培养 25 d后，观察并记录分化
数及分化芽的个数，并通过平均芽分化倍数筛选出
最适宜的继代培养基。
1． 3． 4 最佳增殖培养基的筛选 选择生长健壮，
长势基本一致的细叶百合丛生苗，进行切割后接种
在增殖培养基中进行增殖培养。以 MS 培养基为基
本培养基，分别附加不同浓度的 6-BA、NAA和 IAA，
毎个处理重复 40次，培养 25 d后，观察并记录增殖芽
数，并通过增殖系数来筛选出最适宜的增殖培养基。
1． 3． 5 最佳生根培养基的筛选 将生长健壮株高
约 2 ～ 3 cm的细叶百合不定芽由芽丛单个切下，挑
出长势基本一致的接种在不同激素浓度与配比的生
根培养基中。生根培养基分别以 MS、1 /2 MS 为基
本培养基，附加不同浓度的 IAA 和 IBA，每瓶接种 1
株单芽。培养 25 d后，统计并记录生根率、平均每株生
根条数及其生长状况，以筛选出最佳生根培养基。
2 结果与分析
2． 1 灭菌时间对灭菌效果的影响
从表 1 可以看出，在 5 ～ 8 min 内，随灭菌时间
的延长，细叶百合的成活率逐渐上升，直到灭菌时间
为 8 min时成活率最高，而在 8 ～ 12 min，随灭菌时
间继续延长，成活率下降。因此，灭菌时间与污染率
和成活瓶数有直接关系，时间短则污染率高，时间过
长对外植体细胞产生伤害，氯化汞处理细叶百合鳞片 8
min为适宜的灭菌时间。
2． 2 不同激素浓度对细叶百合鳞片诱导分化的影
响
由表 2 可以看出，细叶百合在 6-BA 0． 5 mg /L
和 NAA 0． 2 mg /L 时分化鳞片数最多，分化率最高
达到了 80 %。因此，以细叶百合鳞片为外植体时，
MS +6-BA 0． 5 mg /L + NAA 0． 2 mg /L 培养基为细
叶百合鳞片的最佳诱导分化培养基。
表 1 不同灭菌处理对细叶百合鳞片灭菌效果的影响
Table 1 The effects of different sterilization treatments on steriliza-
tion effect of Lilium pumilun scale explants
处理时间
(min)
处理数量
(瓶)
成活数量
(瓶)
成活率
(%)
5 30 8 26． 67
6 30 13 43． 33
7 30 22 73． 33
8 30 29 96． 67
9 30 26 86． 67
10 30 21 70． 00
11 30 15 50． 00
12 30 6 20． 00
9172 期 陈丽静等:细叶百合鳞片诱导与遗传转化组培体系的建立
2． 3 不同激素浓度对细叶百合继代培养的影响
从表 3 可以看出，各种培养基中的苗均分化，但
分化芽数量有差别。6-BA 浓度一定时，NAA 浓度
越高则平均芽分化倍数相对也较高。其中培养基中
6-BA为 1． 0 mg /L、NAA为 0． 1 mg /L时分化芽数最
多，平均芽分化倍数最高为 9． 65。因此，最适于细
叶百合继代培养的最佳培养基为 B5 配方，即 MS +
6-BA 1． 0 mg /L + NAA 0． 1 mg /L。
2． 4 不同激素种类与浓度对细叶百合增殖的影响
从表 4 看出，各配比培养基上的芽数都有所增
殖，但增殖数目有一定的差别。相同条件的培养基
中使用 NAA 的效果比使用 IAA 的效果好，增值系
数相对较高。当 6-BA 为 0． 1 mg /L、NAA 为 0． 5
mg /L时增殖芽数最多，增值率最高为 4． 45。因此，
C6 组合的培养基，即 MS + 6-BA 0． 1 mg /L + NAA
0． 5 mg /L为细叶百合最适的增值培养基。
2． 5 不同激素浓度对细叶百合生根培养的影响
从表 5 可以看出，细叶百合试管苗在 MS 培养
基和 1 /2MS上不加任何生长素也能直接生根，所以
细叶百合生根相对较容易，所有组合都能生根，但生
长状况有差别。结合生根时间、生根率、根系长势，
可看出试验中 D7 为细叶百合最适的生根培养基，
即 1 /2MS + IAA 0． 1 mg /L + IBA 0． 1 mg /L。IAA和
IBA以此浓度配比最适合细叶百合生根，生根率达
90． 5 %。且根壮、叶绿、根多易分离，易生根毛，移
栽成活率高。
表 2 不同激素浓度对细叶百合鳞片诱导分化的影响
Table 2 The effects of different hormone concentration on differentiation of Lilium pumilun
序号 基础培养基
生长调节剂的组成(mg /L)
6-BA NAA
接种鳞片数(个) 分化鳞片数(个) 分化率(%)
A1 MS 0 0 15 5 33． 33
A2 MS 0． 1 0． 1 15 7 46． 67
A3 MS 0． 5 0． 1 15 7 46． 67
A4 MS 0． 1 0． 5 15 9 60． 00
A5 MS 0． 5 0． 2 15 12 80． 00
A6 MS 1． 0 0． 5 15 8 53． 33
表 3 不同激素浓度对细叶百合继代培养的影响
Table 3 The effects of different hormone concentration on subculture of Lilium pumilun
序号 基础培养基
生长调节剂的组成(mg /L)
6-BA NAA
接种数(个) 分化数(个) 分化芽(个) 平均芽分化倍数
B1 MS 0． 5 0 20 20 95 4． 75
B2 MS 0． 5 0． 05 20 20 103 5． 15
B3 MS 1． 0 0 20 20 118 5． 90
B4 MS 1． 0 0． 05 20 20 156 7． 80
B5 MS 1． 0 0． 10 20 20 193 9． 65
B6 MS 2． 0 0． 10 20 20 178 8． 90
表 4 不同激素种类与浓度对细叶百合增殖的影响
Table 4 The effects of different kinds and concentration of hormone on multiplication of Lilium pumilun
序号 基础培养基
生长调节剂的组成(mg /L)
6-BA NAA IAA
接种芽数(个) 增殖芽数(个) 增殖系数
C1 MS 0 0 0． 1 40 95 2． 38
C2 MS 0 0 0． 5 40 98 2． 45
C3 MS 0 0． 1 0 40 118 2． 95
C4 MS 0 0． 5 0 40 102 2． 55
C5 MS 0． 1 0． 1 0 40 156 3． 90
C6 MS 0． 1 0． 5 0 40 178 4． 45
C7 MS 0． 2 0． 1 0 40 134 3． 35
C8 MS 0． 2 0． 5 0 40 129 3． 23
027 西 南 农 业 学 报 26 卷
表 5 细叶百合试管苗在不同培养基中的生根率及生根状况
Table 5 The rooting percent and condition of Lilium pumilun test tube plantlet in different medium
序号 基础培养基
生长调节剂的组成(mg /L)
IAA IBA
总苗数(株) 生根苗数(株) 生根率(%) 平均每株
根数(条)
生长状况
D1 MS 0 0 58 26 45． 0 5 + +
D2 MS 0． 1 0 35 24 68． 5 7 + + +
D3 MS 0 0． 1 39 25 64． 0 8 + + +
D4 1 /2MS 0 0 30 22 73． 0 4 + +
D5 1 /2MS 0． 1 0 38 19 50． 0 3 +
D6 1 /2MS 0 0． 1 48 37 77． 0 10 + + +
D7 1 /2MS 0． 1 0． 1 42 38 90． 5 12 + + + +
注:+ 苗黄，长势不好;+ + 分生多，不易分开，分开后根易脱落，苗弱、根;+ + + 根壮、苗绿、长势好;+ + + + 叶绿、根壮、根数多、
有一、二极侧根、易生根毛、长势好。
3 讨论与结论
无菌外植体在组织培养中是取得成功的根本前
提和基本保证。在组织培养中，对外植体的灭菌处
理是重要环节之一，合适的灭菌时间既能充分灭菌
又不致将外植体材料杀死，这是降低污染的有效办
法。氯化汞(也称升汞)是一种植物组织培养中常
用的外植体消毒剂，消毒时间对外植体有很大的影
响。过短的消毒时间，达不到抑菌效果;消毒时间过
长，会对外植体造成一定的伤害。
激素是诱导芽分化的关键物质，是影响植物组
织培养的重要因素。培养基中加入不同量的 6-BA
和 NAA 组合对细叶百合鳞片外植体不定芽的分化
率及分化鳞片数具有明显的差异。因此，合适的生
长调节物质组合能有效的诱导百合鳞片的分化。6-
BA是细胞分裂素，它的生理作用主要是促进植物细
胞的分裂与扩大，使细胞数目增多，同时诱导芽的分
化，促进测压的萌发生长，抑制衰老。NAA 属于生
长素类，它能促进细胞的伸长和生长，使植物产生愈
伤组织，促进植物生根。细胞分裂素与生长素比例
不同，细胞的分化结果不同，6-BA /NAA 大于 1 时，
有利于芽的增殖;小于 1 时，有利于根的生长和植株
的增高［15］。NAA 与 IAA 均为生长素类，它促进细
胞的伸长与增长，NAA 的强度是 IAA 的 10 倍［16］。
因此，在最佳诱导培养基、继代培养基的筛选时，选
用分裂素类 6-BA，生长素类 NAA，两者之间的比例
有所不同，两者影响细胞的分化结果也不同，6-BA
可以提高增殖系数，NAA 能促进分化芽［17］，控制两
者比例是很关键的环节。最佳增殖培养基的筛选中
可看出使用 NAA效果比 IAA效果要好。
在此试验中一些培养基上生长的细叶百合会出
现苗黄，长势不好分生多，不易分开，分开后根易脱
落，苗弱、根弱等状况。最佳生根培养基生长的细叶
百合应以叶绿、根壮、根数多、有一、二极侧根、易生
根毛、长势好为标准。生根培养基的筛选时选用激
素为:IAA 0． 1 mg /L、IBA 0． 1 mg /L 时生根效果最
好。
对于细叶百合影响其分化的因素是多方面的，
百合鳞片状况、培养基中激素种类及用量均与组培
效果有密切关系。组织培养的方法能够克服鳞茎球
繁殖方法繁殖速度缓慢的缺点，可使细叶百合工厂
化成为现实。并且利用细叶百合鳞片诱导并建立遗
传转化组培体系，在百合无性繁殖中，不但能够解决
多年连续营养繁殖引起的退化现象，而且还可以解
决百合的脱毒和扩大繁殖问题;在生物工程方面，细
叶百合无菌苗可用作转基因研究中的转化受体，为
进一步的研究提供无菌苗或愈伤组织材料。
试验从细叶百合组织培养的各阶段入手进行研
究，结果表明，细叶百合鳞片为外植体时，最佳灭菌
时间为 8min左右;细叶百合最佳诱导培养基为 MS
+6-BA 0． 5 mg /L + NAA 0． 1 mg /L;最佳继代培养
基为 MS +6-BA 1． 0 mg /L + NAA0． 1 mg /L;最佳增
殖培养基为 MS +6-BA 0． 1 mg /L + NAA 0． 5 mg /L;
最佳生根培养基为 1 /2 MS + IAA 0． 1 mg /L + IBA
0． 1 mg /L。
组织培养再生体系的建立是植物基因转化成功
的首要条件。本研究在于建立一整套适于细叶百合
的组织培养及植株再生体系，并在此基础上确立其
遗传转化的基础体系。为以后目的外源基因的转入
奠定基础，为成功的获得转基因植株做好准备。本
研究对于细叶百合转基因技术的研究以及生物技术
在细叶百合上的应用也具有重要的现实意义。
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( 责任编辑 李 洁)
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