全 文 ：龙须菜藻红蛋白亚基基因的克隆及其在大肠杆菌中的表达①
隋正红② 　张学成③
(青岛海洋大学海洋生命学院　青岛 266003)
摘　要　用 PCR扩增方法得到真核红藻-龙须菜藻红蛋白亚基基因序列 ,与其它 6种已
知红藻相应序列比较 ,显示了很高的保守性。在 7株藻中 β亚基比α亚基保守 ,α亚基倾
向于小区域保守 ,而 β亚基倾向于大片段的保守。该蛋白必需氨基酸的含量较高 。藻红
蛋白亚基基因在大肠杆菌中达到了较高的表达量 ,诱导 4小时 ,特异表达产物占菌体可溶
性蛋白的 44%,表达产物呈溶解状态 ,而两亚基可能是分别翻译的 。
关键词　PCR , 龙须菜 , 藻红蛋白 , 基因表达
0　引言
龙须菜(Graci laria Lemanei form is GL)属红藻
门江蓠科江蓠属 ,藻体含胶达 20%～ 30%,它既是
提取琼胶的重要原料之一 ,又可以作为人类的绿色
保健食品和鲍鱼的良好饲料。琼胶广泛应用于工农
业和医药 ,作为微生物的培养基成分。据报道 ,龙须
菜提取的琼胶是江蓠属中最好的 ,经过碱改性的琼
胶可与石花菜媲美 ,而相比之下 ,龙须菜又易于培
养。目前对龙须菜的大规模养殖已经展开 。另外 ,
还可以从龙须菜中提取藻红蛋白 、藻蓝蛋白 、别藻蓝
蛋白等 ,因此龙须菜是优良的养殖品种 。
藻胆体是红藻 、蓝藻和部分隐藻的光合作用器 ,
连接蛋白与藻胆蛋白构成藻胆体。藻胆蛋白可以分
为 6 大类 , 分别是异藻蓝蛋白 B(allophycocyanin
APB)、异藻蓝蛋白(allophycocyanin APC)、藻蓝蛋白
(phycocyanin PC)、藻红蓝蛋白(phycoery thrincyanin
PEC)、藻红蛋白(phycoerythrin I PE Ⅰ)和蓝藻中含
藻尿胆素的藻红蛋白 Ⅱ(PE Ⅱ), 它们各有自己独
特的吸收光谱和荧光发射光谱 。PE 、PC 、APC 组成
藻胆体在藻体类囊体膜上顺序排列 ,高效率地捕获
光能并传递给光系统 Ⅱ , 光能传
递的方向为 PE ※PC ※APC ※
chla。藻红蛋白作为藻类光合作
用器的一部分 ,除了参与光合作
用 ,维持藻体正常生长外 ,更作为
光合生物的进化标记被一些学者
认同 ,通过分析 PE基因序列 ,提出了有关光合进化
的一些假设 ,如 Apt[ 1]提出根据 PE 基因序列分析 ,
蓝藻 Synechoccocus与红藻的亲源关系要高于它与
其它蓝藻的 ,鉴于 PE的保守性 ,该序列的研究有助
于说明含藻胆体生物的亲源关系 ,从而为光合进化
问题提供研究资料;另一方面 ,藻红蛋白作为荧光探
针已广泛应用于医药行业 ,另外还发现藻红蛋白的
结构与胰岛素的相似 ,并可进一步与胰岛素抗体结
合[ 2] ,预示了藻红蛋白的潜在应用前景。
到目前为止 ,只有少数的几个红藻 PE 基因序
列的研究报道 ,我们用 PCR技术克隆了龙须菜的
PEαβ亚基基因序列 ,并进行了该基因的表达 ,这是
该基因序列表达研究的首次报道 。
1　材料与方法
1.1　材料
龙须菜采自青岛湛山湾 。引物由上海生工合
成 ,正向序列为 Nphy:GGAGAG(AC)TCAATGCT
(AT)GA ,反向引物为 Pd:(CT)TANNNTAA(A T)
G(AC)(AG)(AT)T(AG)ATNA(AC)(AG)(AT)A ,
质粒 pBV220[ 3] 。
1.2　PCR反应条件
PCR扩增在 90AD温度循环仪上进行(中国科
学院遗传研究所产品)温度循环参数是:94℃, 80s ,
45℃,2min ,72℃,80s ,35个循环。
1.3　产物纯化及连接 、筛选
低融点琼胶糖法回收特异 PCR 产物 ,以 dT 载
—14—
高技术通讯　2001.7
①②③ 联系人。(收稿日期:2001-04-09;修订日期:2001-05-22)
女 , 1969年生 ,博士 ,讲师;研究方向:藻类分子生物学。国家自然科学基金(39670405及 30000126)资助项目。
体法[ 4]连接 PCR产物 ,酶切鉴定重组子 ,见金冬燕
等[ 5] ,筛选得到的重组质粒为 pG L。
1.4　序列分析
序列分析在 PE-ABI377 DNA 分析仪上进行 ,
序列分析软件为 DNASIS (ver 5.0)。
1.5　藻红蛋白基因的亚克隆及在大肠杆菌中的表
达
将已克隆在载体 pGEM5Zf(+)中的藻红蛋白
基因定向插入到表达载体 pBV220SalI位点之后 ,最
终得到的重组质粒为 pBGL。
按文献[ 3] ,将重组菌经 1h 、4h , 42℃诱导表达 ,
诱导表达样品以 50μl 裂解液(溶菌酶 100μg/ml;
Tris-HCl pH8.0 50mmol/L;EDTA 2mmol/L)混
匀 ,30℃裂解 15mim ,取上清与等体积 2X上样缓冲
液(100mmol/L Tris-HCl pH6.8;200mmol/L DTT ;
4%SDS;0.2%溴酚兰;20%甘油)混合 , 100℃水浴
3 ～ 5min ,点入 12%不连续梯度分离胶 ,进行 SDS-
PAGE电泳 ,电泳后以考马斯兰染色。
1.6　表达产物的免疫学测定(Western 印迹)
采用电转移装置 ,将蛋白转到 NC膜上 ,经一抗
(小鼠抗红藻 PE)、碱性磷酸酶标记的山羊抗鼠 IgG
温育 2h ,加显色液显色 ,蒸馏水冲洗终止反应[ 5] 。
2　结果
2.1　龙须菜 PE基因的克隆和分析
龙须菜 PE 亚基基因核苷酸 、氨基酸序列及与
其它已知红藻的相应序列对比见图 1 和图 2 ,这几
种红藻分别来源于红藻的不同纲 、目或科属 ,它们是
Rhodella v iolacea(RV)、Polysiphonia boldi i(PB)、
Aglaothamnion neglectum(AN)、Gri f f i thsia mono-
lis(GM), Porphyra tenera(PT)和 Porphyra yezoen-
sis(PY),它们的分类地位见表 1。
表 1　进行基因序列比较的红藻藻株分类地位
藻株 纲 目 科 属
Aglaothamnion
neglectum
Florideophycidea　 Ceramiales　 Ceramiaceae　 Aglaothamnion　
Grif f ithsia
monolis
Florideophycidea　 Ceramiales　 Ceramiaceae Grif f ithsia　
Polysiphonia
boldii
Florideophycidea　 Ceramiales　 Rhodomelaceae　 Porphyra　
Porphyra
Purpurea
Bangiophycideae　 Bangiales　 Bangiaceae　 Porphyra　
Porphyra
tenera
Bangiophycideae　 Bangiales　 Bangiaceae　 Porphyra　
Rhodella
violacea
Bangiophycideae　 Porphyridiales　 Porphyridiaceae　 Rhodella　
　　PCR 扩增获得的龙须菜 PE 亚基基因含有
1094个核苷酸 ,其中 534 个核苷酸编码 β 亚基的
177个氨基酸 ,496个核苷酸编码α亚基的 164个氨
基酸 。由图 1 、2可见 PE 基因有很高的保守性 , GL
与 RV 、AN 、PB 、GM 、PT 、PY 间核苷酸的相似性分
别为 77.6%、77.9%、79.0%、79.1%、80.6%和 80.
3%。在七株藻中完全相同的核苷酸在 β 亚基有
136个 ,在α亚基中有 123个 ,分别占 25.5%和 24.
8%。而氨基酸的相似性 GL 与 RV 间为 85%, GL
与 AN间 81.8%,GL 与 PB 间 85.6%,GL 与 GM
间83.6%,GL 与 PT 间 88.6%, GL 与 PY 间 88.
3%。
龙须菜 PE 的氨基酸组成及与 FAO标准的对
比见表 2。由表 2可见 ,龙须菜 PE 中的必需氨基酸
含量较高 ,在 8 种必需氨基酸中 ,有 4种(Val、Leu 、
Ile、Thr)在两亚基中的含量均远远超出了 FAO 标
准 ,另外的 4 种(Met 、Lys、Phe、Trp)的含量与 FAO
标准接近或略高于之。值得注意的是该蛋白的α多
肽含色氨酸 ,而且含量远远高于 FAO 标准 ,这是在
一般的食品中缺乏的。
2.2　PE基因在大肠杆菌中的表达
亚克隆重组体在 42℃诱导后 ,进行 SDS-PAGE
电泳 ,结果见图 3 , 这是重组体(pBG L)和空载体
(pBV220)分别在 42(C 温度诱导 1h和 4h的表达产
物分析 。由图 3可见 ,含 PE基因的重组体(pBGL-
道 2 , 4)与不含该基因的空载体(pBV220-道 1 , 3)相
比在约 17KD处有特异的表达带 ,诱导 1h后便有了
表达产物 ,经凝胶扫描及图象分析表明 , 诱导 4h时
—15—
隋正红等:龙须菜藻红蛋白亚基基因的克隆及其在大肠杆菌中的表达
图 1　龙须菜与其它红藻 PE 亚基基因对比图
缩写所代表藻株:GL(Graci larial lemaneiformis)龙须菜 , RV(Rhodella violacea), PB(Polysiphonia boldii), AN(Aglaothamnion neg lectum),
GM(Gr i f f ithsia monolis), PT(Porphyra tenera), PY(Porphyra yezoensis);星号表示七株藻中完全一致的核苷酸 ,结构基因以大写字母表示 , 小
写字母表示基因间隔区
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高技术通讯　2001.7
图 2　龙须菜与其它红藻 PE 基因氨基酸序列对比图
缩写所代表藻株:GL(Gracilar ia lemanei formis)龙须菜 , RV(Rhodel la violacea), PB(Polysiphonia bold ii), AN(Aglaothamn ion neg lectum),
GM(Gr i f f i thsia monol is), PT(Porphyra tenera), PY(Porphyra yezoensis), ! 表示龙须菜中与其它红藻完全不同的氨基酸残基 ,带下标残基为龙
须菜中变异的氨基酸 ,其它符号均为保守性氨基酸;其中星号 、+、-表示在两亚基中均保守的氨基酸 ,带下标星号的是极端保守氨基酸 , 表示
在 alfa或 beta亚基中保守的氨基酸 ,两亚基间以间隔符间隔
表 2　龙须菜 PE 氨基酸组成与 FAO 标准比较
氨基酸 各亚基重量百分比 FAO标准
α β
Gly
A la
Val＊
Leu＊
Ile＊
Ser
Thr＊
Cys
Met＊
Asp
Asn
G lu
G ln
A rg
Lys＊
His
Phe
＊
Ty r
T rp＊
Pro
3.55
10.44
6.72
7.67
5.75
5.90
3.43
1.75
2.22
6.50
4.51
8.02
2.90
8.82
5.06
1.54
4.15
7.37
1.05
2.74
17.7
3.70
8.84
8.04
8.56
7.34
10.35
4.37
4.46
3.55
6.84
6.17
4.19
1.39
8.44
4.16
0
2.39
5.29
0
2.10
18.5
4.2
4.8
4.2
2.8
2.2
　
4.2
2.8
0.2　
分子量(KD)
　　＊必需氨基酸
该基因的表达量占菌体可溶性蛋白总量的 44%。
接着对表达产物进行了免疫学测定 ,结果见图
4。由图 4可见 ,重组体(对应于 pBGL 温度诱导 1
及 4h)表达产物电泳的 17KD 处与 PE抗体有血清
学反应 ,证实该条带的确是 PE蛋白 。
图 3　蛋白质 SDS-PAGE电泳
M:蛋白分子量标准;1 、3:空载体 pBV220 42℃温度诱导 1及
4h;2 、4:重组体 pBGL 42℃温度诱导 1及 4h
3　讨论
本实验结果证实 PE 基因在红藻间非常保守 ,
而相比之下 ,红藻与蓝藻间的亲缘关系则远的多 ,龙
—17—
隋正红等:龙须菜藻红蛋白亚基基因的克隆及其在大肠杆菌中的表达
须菜与蓝藻 Synechococcus sp间 PE 基因的相似性
仅达到 59%,而 Kim[ 6]也报道紫菜与红藻的亲源关
系比之与蓝藻间的关系要近得多。
据Apt[ 1]报道 ,在所有已知的藻胆蛋白中一些
位点的氨基酸具有保守性 ,这些氨基酸残基可分成
三类:一类是在各种藻胆蛋白如 PE 、PC 、APC 、及末
端能量受体(terminal energy accepto r TEA ,一般是
连接蛋白的一部分)中均维持不变 ,它们一般负责光
能吸收和传递;第二类在除 TEA 外所有藻胆蛋白中
均保守的氨基酸 ,它们负责αβ亚基间相互作用及亚
基自身的三级结构 ,以形成聚合物 ,而即使在 TEA
中也是同类型氨基酸替代;第三类只在α或 β 亚基
中保守 ,它们有的在藻胆蛋白聚合体聚合时起稳定
作用 ,有的与色基作用 ,有的则与连接蛋白作用;另
外还有一类残基总维持氨基酸类群保守性 ,但具体
功能未知 ,可归为第四类。与藻胆蛋白功能密切相
关的保守性氨基酸在GL 的 PE基因中也是保守的 ,
说明这些氨基酸的对藻胆蛋白功能的重要性及 PE
的保守性 。PE 氨基酸序列的保守性高于核苷酸的
说明大多数的碱基替代发生在 3′位上 ,所以这些变
化对氨基酸序列和蛋白质结构的影响不大 ,这对维
持光合作用器的稳定性是很重要的 。
图 4　Western-Blot
M:蛋白分子量标准;1 、3:空载体 pBV220 42℃温度诱导 1及
4h;2 、4:重组体 pBGL 42℃温度诱导 1及 4h
很早以来 ,人们就认识到在不同的藻胆蛋白间
存在着很大的相似性 ,因此推断不同的藻胆蛋白亚
基属于从同一个古老的蛋白演化而来的蛋白家
族[ 7] ,而 βα亚基又是从不同的演化体系而来[ 1] 。从
我们的结果来看 ,在七株藻中 β亚基比α亚基保守 ,
这与其他学者的结果是一致的[ 8] 。PE基因 βα亚基
在七株藻中的氨基酸保守区段见图 5 。由图 5 可
见 ,α倾向于小区域保守 ,而 β亚基倾向于大片段的
保守 ,如在该亚基中 ,甚至有连续 20 个氨基酸的保
守区段。在 GL 中接近α亚基碳末端的位置发生了
从氨基天冬氨酸到谷氨酸(D到 E)的替代 ,该氨基
酸负责与 135位精氨酸相互作用 ,考虑到天冬氨酸
与谷氨酸同属极性氨基酸 ,可以推断这一替代对蛋
白质的影响不大 。这对维持藻胆体结构 、功能的稳
定性也是很重要的 。
图 5　龙须菜藻红蛋白亚基氨酸保守性区域分布
而两亚基间的基因间隔序列无论从核苷酸还是
从长度来讲都表现了很大的变异 ,如在 GL 中间隔
碱基是 55个 ,AN有 108个 。GL 该基因的 GC 含量
是 35.8%,比其它几株藻的稍低 ,如 RV 的是 37.
6%,AN 是 36.7%, PB 是 36.6%;密码子 3′位的
GC%为 14.4%,显示了很强的偏倚性 ,这一性质与
其它质体基因的特性是一致的[ 9] ,而核基因组编码
基因则呈现密码子 3′位 GC 含量高的特性[ 10] 。虽
然密码子偏倚性的一致对基因的表达有很大的影
响 ,但C rutti等[ 11]的工作表明 ,密码子的使用倾向
不会成为基因在另一生物体中表达的决定因素 。
在龙须菜 PE 基因的氨基酸组成中 ,大多数必
需氨基酸的含量都比 FAO 的标准高 ,有的甚至高出
2 ～ 3 倍 ,显示了该蛋白良好的营养组成 ,也预示了
该蛋白的潜在应用价值 。有报道培养高 PE 含量藻
株 Porphyridium cruentum 以制备藻红蛋白[ 12] ,既
可以应用于医药 ,又具有优质蛋白的应用价值。
藻红蛋白基因在大肠杆菌中达到了较高的表达
量 ,诱导 4h ,基因的表达占菌体可溶性蛋白的 44%。
pBV220载体是一种高效的比较方便进行非融合型
基因表达的载体 ,克隆基因的表达只需温度诱导 ,外
源基因在该载体的表达可以是溶解状态[ 13] ,也有呈
包涵体的[ 3] ,图 3所得的电泳结果是由诱导菌体裂
解液的上清来的 ,可见该基因的表达产物没有形成
—18—
高技术通讯　2001.7
包涵体 ,而呈可溶状态存在于胞浆中 ,这对于以后的
纯化及蛋白活性的维持是有利的。
根据 PE基因序列推算 ,其 βα每个亚基分子量
应在 17KD左右 ,而从图 3可见 ,重组体的表达相比
对照 ,仅在 17KD 处有不同的蛋白条带 ,推测其 βα
亚基是以单个多肽的形式存在;考虑到大肠杆菌内
不存在基因表达的后加工机制 ,可以推测在大肠杆
菌中 βα亚基基因可能是分别转录 ,这与该操纵子表
达的天然状态不同 ,在自然状态下 βα亚基操纵子是
一同转录的[ 6] 。大肠杆菌表达 PE基因实验也说明
该真核红藻基因可以在原核体系中表达 。
目前天然状态的藻胆蛋白的获得只有通过藻类
培养的方法 ,但又存在藻种选育和大规模培养 、采收
的问题 ,因而导致天然藻胆蛋白极高的市场价格 。
若能在体外体系中生产该蛋白 ,则会产生巨大的经
济效益 。藻胆蛋白只有结合了色基才具有光学活
性 ,从而可以应用于肿瘤的光动力学治疗及应用于
诊断 、免疫等医学研究。但天然状态藻胆蛋白的形
成涉及许多方面 ,除了脱辅基蛋白外 ,还有色基等一
系列关键成分。Cornejo[ 14]克隆了藻胆素合成基因 ,
并在大肠杆菌中表达了该基因 ,加入底物中性血红
素(mesoheme)生成了藻胆素前体物质中性胆绿素
IXα(mesobiliverdin IX alpha),Beale 等[ 15] 用从红藻
中得到的无细胞提取物在体外合成了色基前体 ,为
体外合成具光学活性的藻胆蛋白解决了一个方面的
问题。但我们必须看到 ,对藻胆蛋白的研究还很不
够 ,如目前已知色基连接到脱辅基蛋白的过程可能
是一个酶促反应[ 16] ,色基与脱辅基蛋白的结合还会
引起蛋白构型的改变[ 17] ,但涉及的具体过程并不清
楚。Toole[ 18]用定点诱变技术构建了不能结合色基
的 PC 基因 ,结果发现这种 PC 不能正常地形成蛋白
聚合体 ,说明藻胆素对蛋白组装也有作用 。所以要
想在大肠杆菌或其它表达体系中像生产其它已产业
化的生化因子一样生产天然状态的藻胆蛋白还有一
定的距离 , 但这是藻类遗传操作的一个重要内
容[ 19] ,应该在未来取得突破性进展 ,要实现这一目
标还需要许多学者的共同努力。
参考文献:[ 1] Apt K E , Collier J K , Grossman A R.J Mol Biol , 1995 ,
248:79[ 2] 曾繁杰 ,杨紫萱 , 刘蕙平等.中国科学 , 1986 , 4:364[ 3] 张智清 ,姚立红 , 侯云德.病毒学报 , 1990 , 6(2):111[ 4] Marchuk D.Nucl Acids Res , 1990 , 17:3319
[ 5] J.萨姆布鲁克等著 , 金冬燕 , 黎孟枫等译.分子克隆.北
京:科学出版社 , 1992 , 2[ 6] Kim B K , Fujita Y.Phycol Res , 1997c, 45(4):217
[ 7] Glazer A N.The Evolution of Protein Structure anf Func-
tion.New Yo rk:Academic Press , 1980[ 8] Qin S , Hiroyuki Ko jima , Yoshikaqzu Kaw ata.China J O-
ceanol L imnol , 1998 , 16(supplement):6
[ 9] Apt K E , Grossman A R.J Phycol , 1993 , 29:716[ 10] Apt K E , Hoffman N E , Grossman A R.TheJournal of
Biological Chemistry , 1993 , 268(22):16208
[ 11] Crutti H , Johnson A M , Gillham N W , et al.Genetics ,
1997 , 145:97[ 12] Fabregas J , Garcia D , Morales E D , et al.Cryptogamie
Algologie , 1999 , 20(2):89
[ 13] 高音 ,杨志伟 ,华振玲等.生物工程学报 , 1999 , 15(3):
349[ 14] Cornejo J , Willows R D , Beale S I.Plant J , 1998 , 15
(1):99[ 15] Beale S I , Co rnejo J.J Biol Chem , 1991 , 266(33):
22328[ 16] Glazer A N , Fairchild C D , From Light to Biospherem ,
Dordrecht/ Boston/ London:Kluwer Academic , 1995[ 17] Park C M , Shim J Y , Yang S S , et al.Biochemistry ,
2000 , 39(21):6349
[ 18] Toole CM , Plank T L , Grossman A R , et al.Molecular
Microbiology , 1998 , 30(3):475[ 19] Subhash C M.World Aquaculture.1999 , 57:29
Cloning of Subunit Genes of Phycoerythrin of Gracilaria lemaneiformis
and Its Expression in E.coli
Sui Zhenghong , Zhang Xuecheng
(College of M arine Life Sciences , Ocean University of Qingdao , Qingdao 266003)
Abstract
PCR amplification w as employed to get the subunit genes of phycoerythrin of a red algae-Gracilaria le-
manei formis.High rate of conservation w as revealed by aligning the sequence w ith the known o thers of red al-
gal.The result show ed that the β subunit is mo re conserved than the αsubunit while αtrends to keep wi thin
small f ragments and β large ones.The protein w as estimated to contain high level of essence amino acids.Large-
scale expression w as observed when the phycoery thrin genes were expressed in E .coli.The expression products
w as resolved and accounted for 44%of the to tal resolved protein of the o rganism af ter 4 hours temperature in-
ducing.It w as suggested that the subunits w ere translated respectively .
Key words:PCR , Gracilaria lemaneiformis , Phycoerythrin , Gene expression
—19—
隋正红等:龙须菜藻红蛋白亚基基因的克隆及其在大肠杆菌中的表达