全 文 ：第 6卷 第 1期 食品安全质量检测学报 Vol. 6 No. 1
2015年 1月 Journal of Food Safety and Quality Jan. , 2015


基金项目: 质检公益性行业科研专项(201310141)
Fund: Supported by the Special Scientific Research Fund of AQSIQ Public Welfare Profession of China (201310141)
*通讯作者: 曹际娟, 研究员, 主要研究方向为食品安全检测, E-mail: cjj0909@163.com
*Corresponding author: CAO Ji-Juan, Researcher, Liaoning Entry-Exit Inspection and Quarantine Bureau, No.60, Changjiang East Road,
Dalian 116001, China. E-mail: cjj0909@163.com

QuEChERS法联合高效液相色谱法快速检测扇贝
中的软骨藻酸
王 婵 1,2, 赵永拓 3, 彭心婷 4, 孙兴权 2, 刘慧颖 2, 张 彧 1, 曹际娟 2*
(1. 大连工业大学, 大连 116034; 2. 辽宁出入境检验检疫局, 大连 116001;
3. 鲅鱼圈出入境检验检疫局, 营口 115000; 4. 塔城出入境检验检疫局, 塔城 834700)
摘 要: 目的 利用 QuEChERS 样品制备结合高效液相色谱法建立测定扇贝中记忆缺失性贝类毒素—软骨藻
酸(domoic acid, DA)残留的检测方法。方法 QuEChERS样品制备法进行样品前处理, 即样品经甲醇:乙腈:水
=6:3:1(v:v:v)提取, C18粉末净化, 反相高效液相色谱分离, 242 nm波长下检测, 基质匹配校准曲线外标法定量。
结果 方法的检测低限(limit of quantitation, LOQ)为 1.8 μg/g, DA在 0.72~30.00 μg/mL浓度范围内线性良好(相
关系数 r=0.9998), 在 1.8~6.0 μg/g 添加浓度范围内, 平均回收率为 90%左右, 相对标准偏差(relative standard
deviation, RSD)小于 5%。结论 本实验建方法检测低限完全满足 DA 20 μg/g的限量要求, 且步骤简单、可操
作性强、节省时间、试剂用量少、准确度高、精密度好, 具有快速高效的特点。
关键词: 软骨藻酸; QuEChERS样品制备法; 高效液相色谱法; 快速检测
Rapid detection of domoic acid in scallops by QuEChERS method
coupled with high performance liquid chromatography
WANG Chan1,2, ZHAO Yong-Tuo3, PENG XIN-Ting4, SUN Xing-Quan2, LIU Hui-Ying2,
ZHANG Yu1, CAO Ji-Juan2*
(1. Dalian Polytechnic University, Dalian 116034, China; 2. Liaoning Entry-Exit Inspection and Quarantine Bureau, Dalian
116001, China; 3. Bayuquan Entry-Exit Inspection and Quarantine Bureau, Yingkou 115000, China; 4. Tacheng Entry-Exit
Inspection and QuarantineBureau, Tacheng 834700, China)
ABSTRACT: Objective To established a method to detect domoic acid residues in scallops by the sample
processing method of QuEChERS in combination with high performance liquid chromatography (HPLC).
Methods Samples were cleaned up by QuEChERS with extracting by methanol : acetonitrile : water = 6:3:1
(v:v:v), and purified by C18 powder, separated by reversed phase high performance liquid chromatography and
detected at wave length of 242 nm, and quantified by the matrix matching calibration curve external standard
method of matrix matching calibration curve at last. Results The limit of quantitative was 1.8 μg/g, working
curve correlation coefficient was 0.9998 at the linear range of 0.72~30.00 μg/mL, the recovery rate was higher
than 90% at the spiking concentration range of 1.8~6.0 μg/g, and relative standard deviation (RSD) was less
than 5%. Conclusion This method with a fast speed and a high sensitivity and exactitude can satisfy the limit
第 1期 王 婵, 等: QuEChERS法联合高效液相色谱法快速检测扇贝中的软骨藻酸 73





of detection of DA 20 μg/g.
KEY WORDS: domoic acid; QuEChERS extration; high performance liquid chromatography; rapid detection


1 引 言
贝类毒素是贝类摄入毒性海澡或与藻类共生时,
由这些藻类合成并蓄积在贝类体内的多种毒素, 按
照毒性机制可分为麻痹性贝类毒素(paralytic shellfish
poison, PSP)、腹泻性贝类毒素 (diarrhetic shellfish
poisions, DSP)、神经性贝类毒素(neurotoxic shellfish
poisoning, NSP)和记忆丧失性贝类毒素 (amnesic
shellfish poisoning, ASP)4 种。其中 ASP的的主要成
分是软骨藻酸(domoic acid, DA)及其衍生物, 自 1987
年加拿大的中毒事件[1]后开始被认识。近年来, DA中
毒事件时有发生, 美国、加拿大、法国、英国、西班
牙、爱尔兰和葡萄牙均有报道[2-4]。贝类毒素危害具
有突发性和广泛性, 由于其毒性大、反应快、无适宜
解毒剂, 给防治带来了许多困难。
DA 是一种天然神经性非蛋白氨基酸, 主要由某
些拟菱形藻属和菱形藻属的海洋硅藻产生, 易溶于
水, 微溶于甲醇, 其结构如图 1 所示。DA 是谷氨酸
的一种同分异构体, 并能够与谷氨酸受体牢固结合
的一种兴奋性神经传递素, 其作用机制是通过与控
制细胞膜 Na+通道的神经递质谷氨酸结合, 开启细胞
膜的 Na+通道, 提高 Ca2+的通透性, 使得神经细胞长
时间处于兴奋状态, 最终导致细胞死亡, 也可能引起
部分中枢神经系统区域以及与记忆有关区域损伤 ,
进而导致记忆丧失[5]。欧盟对 DA 的限量标准为 20
μg/g, 我国尚未规定其限量标准[6]。

图 1 软骨藻酸结构图
Fig. 1 Structure of domoic acid

目前检测贝类中 DA 的方法主要有小鼠生物法、
毛细管电泳法[7]、酶联免疫吸附法[8,9]、高效液相色谱
法[10,11]、液相色谱串联质谱法[12,13]等。色谱技术检测
软骨藻酸一般用甲醇提取, 后经阴离子小柱净化后
上机[14-16], 但固相萃取柱一般价格较贵, 且操作时间
较长。QuEChERS(quick, eqsy, cheap, effective, rugged
and safe)法是近些年发展起来的一种样品制备方法,
因具有快速、简单、便宜、有效、耐用和安全可靠等
特点而被广泛应用于食品安全检测领域, 目前, 其在
贝类 DA检测分析中的应用尚未见报道。QuEChERS
法一般采用以乙腈或酸化乙腈为提取剂, 通过加入
氯化钠或乙酸钠等缓冲盐减少极性杂质的干扰。加入
无水硫酸镁在提取步骤中促进溶剂分配并提高样品
分布, 在净化步骤中可去除有机相中的多余水分, 加
入伯仲胺(primarysecondary amine, PSA)去除糖类和
脂肪酸、有机酸、脂类和一些色素等杂质。本实验利
用 QuEChERS 法作为前处理操作方法, 结合高效液
相色谱法来测定扇贝中的 DA, 尝试开发一种贝类样
品中 DA的快速检测方法。
2 材料和方法
2.1 仪器及试剂
高效液相色谱仪: Agilent 1260(美国 Agilent 公
司); 涡旋混合器(美国 Scientific insustries 公司); 电
子天平 (德国 Sartorius 公司); 高速冷冻离心机(美国
Thermo公司)。
软骨藻酸标准品(纯度＞90%, 美国 Sigma 公司);
乙腈、甲醇、丙酮(高效液相色谱纯, 德国Meker集团);
氯化钠、无水硫酸镁(纯度＞98%, 国药集团化学试剂
有限公司); C18吸附剂粉末(上海安普科学仪器有限公
司); 超纯水(Milli-Q超纯水仪制备得到); 0.22 μm滤膜
(美国Thermo公司); 提取剂: 甲醇:乙腈:水=6:3:1 (v:v:v)。
DA 标准储备溶液配制: 吸取一定量的 10%乙腈, 溶解
适量的DA标准品, 使其浓度为 1500 μg/mL; 基质校正
标准曲线工作液配制: 取 5 份空白试样, 分别加入适
量 DA标准溶液, 按本文“2.3.2”步骤处理, 制成 DA浓
度为 0.72、1.50、3.00、10.00、30.00 μg/mL的基质校
正标准系列工作液, 过 0.22 µm滤膜后备用。
2.2 色谱条件
色谱柱: Purospher STAR RP-18 (150 mm×4.6
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mm×3 μm, 德国 Merck公司); 柱温: 35 ℃; 流速: 1
mL/min; 检测波长: 242 nm; 进样量: 10 μL; 流动相:
0.1%乙酸:乙腈(87:13, v:v)。
2.3 实验方法
2.3.1 试样制备
洗净贝类样品外壳泥沙后, 开壳, 再清洗净内
部, 确保样品无海水和泥沙等异物。取贝类组织可食
部分, 沥干水分后经充分搅碎、均质, 分出不少于
100~150 g作为试样, 于18℃以下避光保存。
2.3.2 提取与净化
取 4 g样品于 50 mL具塞离心管中, 加入 10 mL
甲醇:乙腈:水=6:3:1(v:v:v)提取溶剂、2 g 无水硫酸镁
和 1 g氯化钠, 涡旋振荡 1 min, 超声提取 5 min, 以
10000 r/min于 4 ℃超高速离心 10 min, 取 4 mL上清
液, 加入 0.2 g C18粉末, 0.4 g无水硫酸镁, 涡旋振荡
1 min, 8000 r/min于 4 ℃超高速离心 10 min, 取 1 mL
上清液过 0.22 μm有机滤膜, 上机测定。
试样中被测物含量利用X=cV/m公式计算, 其中
X为试样中DA含量(μg/ g); c为从标准工作曲线得到
的DA浓度(μg/mL); V为试样溶液最终定容体积(mL);
m为试样溶液所代表试样的质量(g)。
3 结果与讨论
3.1 提取条件的选择
3.1.1 提取溶剂的优化
DA 为水溶性非蛋白质类氨基酸, 在以往 DA 的
检测方法中, 依据 DA 易溶于水, 微溶于甲醇的理化
性质, 多采用甲醇:水=1:1(v:v)为提取溶剂, 阴离子小
柱净化, 但固相萃取柱一般价格较贵, 且操作时间较
长, 耗费溶剂多。本实验也基于 DA的这一理化性质,
采用 QuEChERS 法进行样品提取与净化。在实际应
用中, QuEChERS 法具有很高的灵活性, 可以根据
实际需要采用不同提取剂、吸附剂组合进行样品处
理。在提取溶剂选择方面, 本实验分别研究了甲醇:
乙腈:水=8:1:1、7:2:1、6:3:1、5:4:1(v:v:v)、甲醇:水
=1:1(v:v)、甲醇:丙酮=9:1(v:v)、乙腈:水=17:83(v:v) 等
溶剂对样品进行提取, 实验结果如表 1 所示, 结果表
明在 1.8 μg/g 添加水平上, 甲醇与乙腈、水的组合回
收率较高, 其中甲醇:乙腈:水=6:3:1(v:v)的组合回收率
最高, 故本实验选取甲醇:乙腈:水=6:3:1(v:v:v)为提取
溶剂。0.72 μg/mL DA标准品谱图见图 2, 低浓度水平
(1.8 μg/g)添加谱图见图 3。

图 2 软骨藻酸标准品色谱图(0.72 μg/mL)
Fig. 2 Chromatography of domoic acid(0.72 μg/mL)

图 3 扇贝中添加低浓度水平(1.8 μg/g)DA的高效液相色谱图
Fig. 3 Chromatography of domoic acid at the low spiking
concentration of 1.8 μg/g in scallops
表 1 不同提取溶剂对 DA 回收率的影响
Table 1 Effects of different extraction solvent on recovery of domoic acid
提取溶剂
甲醇:乙腈:水(v:v:v) 甲醇:水(v:v) 甲醇:丙酮(v:v) 乙腈:水(v:v)
8:1:1 7:2:1 6:3:1 5:4:1 1:1 9:1 17:83
回收率(%)
72.1 70.4 85.4 80.3 74.2 89.3 50.2
80.2 82.2 87.9 77.1 72.4 80.7 62.4
79.2 74.3 82.1 70.5 82.7 74.9 58.0
平均回收率(%) 77.1 75.6 85.1 75.9 76.4 81.6 56.9
相对标准偏差(%) 5.7 7.9 3.4 6.6 7.2 8.9 10.8

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3.1.2 超声时间的选择
考虑到实际样品中DA的提取效果, 本实验研究
了水浴超声提取 5、10、15 min对回收率的影响, 结
果表明超声时间长短对结果影响差异不大, 因此本
实验最终选择超声时间为 5 min, 具体实验结果见图
4(添加浓度为 1.8 μg/g)。
3.2 净化条件的选择
鉴于DA是一种酸性物质, 在净化步骤中本实验
未采用 QuEChERS 法常用的 PSA 粉末进行净化, 而
是利用 C18 粉末为净化剂以去除蛋白等杂质, 同时
结合低温高速离心的方式进行样品净化处理。
QuEChERS 法在净化方面与传统的固相萃取相比还
有一定的差距, 新净化体系和新净化材料还有待进
一步研究开发[17]。在利用 QuEChERS法净化处理后,
本实验的回收率可达 70%左右, 为减少由于净化不
足对检测分析的影响, 本实验在外标法定量时采用
了基质匹配标准曲线法, 进而使回收率达 90%左右,
结果如表 2所示。此外, 由于 DA在酸性条件下不稳
定, 整个样品处理和检测分析过程中还应注意样品
溶液的酸碱度不可为酸性, 以防 DA降解。
3.3 方法检测低限、线性范围、回收率、精密度
以 10 倍信噪比(S/N)确定 DA 的检测低限为 1.8
μg/g; 在 0.72~30.00 μg/mL的线性范围内, 相关系数
r为 0.9998。按 1.8、3.6、6.0 μg/g 3个浓度水平向扇
贝样品中添加DA, 用QuEChERS法进行样品提取和
净化, 每个样品重复 6 次, HPLC 检测, 回收率及相
对标准偏差统计结果见表 3。

图 4 超声时间对 DA回收率的影响
Fig. 4 Effects of different ultrasonic time on recovery of domoic acid
a: 5 min; b: 10 min; c: 15 min
表 2 基质匹配标准曲线法对 DA 回收率的影响
Table 2 Effects of matrix-matched calibration standard on recovery of domoic acid
基质匹配 回收率(%) 平均回收率(%) 相对标准偏差(%)
基质配标前 85.4 87.9 82.1 85.1 3.4
基质配标后 98.4 93.4 92.5 94.8 3.3
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表 3 扇贝中 DA 加标回收率和精密度(n=6)
Table 3 Recovery and precision of domoic acid spiking in scallops (n=6)
样品基质 添加浓度
(μg/g)
回收率(%) 平均回收
率(%)
相对标准
偏差(%) 1 2 3 4 5 6
扇贝
1.8 87.2 93.2 96.6 90.8 93.7 86.4 91.3 4.3
3.6 91.6 87.3 93.2 90.9 94.6 92.2 91.6 2.7
6.0 92.1 88.8 96.5 94.3 94.7 90.3 92.8 3.1

4 结 论
本实验采用改进的 QuEChERS 法与高效液相色
谱技术, 测定了扇贝样品中的 DA, 所建方法检测低
限完全满足 DA 20 μg/g的限量要求, 且步骤简单、可
操作性强、节省时间、试剂用量少、准确度高、精密
度好, 具有快速高效的特点, 是对日常贝类样品中的
DA检测方法的有益尝试和补充。
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(责任编辑: 张宏梁)
作者简介
王 婵, 硕士, 主要研究方向为食品
安全色谱检测。
E-mail: wangachan37@163.com
曹际娟, 研究员, 主要研究方向为食
品安全检测。
E-mail: cjj0909@163.com