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单 胞藻 液细 胞计数 的 比 色法
姚 南 瑜 高 侃
引 寺「翔
单胞藻的研究和生产 ( 如饵料 ) 中 , 细胞计数是 ·项经常必需进行 而又比较繁琐的
〔作 。 和 一般生物生长的规律一样 , 单胞藻的生 长亦表现 出 S 形的生 长大曲线 。 这就是
在人工培养单胞藻的过程中 (在静止 、 开放和具有限定的营养条件下 ) , 自接种后 , 一
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图 1 小新月趁形藻生长 曲线
般都经历延缓期 、 指数生长期 、 相对生长
卜降期 、 静止期乃至死亡数阶段 。 图 1 数
据取 l」我们 1 9 8 0年 5 月1 9日至 2 9日进行的
小新月菱形藻的培养试验。
在饵料生产中经常需要考虑的问题就
是要通过各项有效措施 (营养液的合理配
制 、 光照 、 温度的调节 , 通气的改善 , 选
取处于指数生长期的新鲜藻种以 及扩大接
种量等 ) ,加速藻类的培养以满足海珍品对
饵料的需要 。 因此 , 在工作中要随时掌握其
细胞增殖进程 , 即经常进行细胞计数。 过
去计数多是采用显微镜下读数的方法 (籍
助血球计数板 、 计数框或通过视野计数换
算的方法 ) 〔` J。 这样做 , 不容易使视野中
或计数格中细胞数均匀 。 但是 , 要在统计学上达到相对准确的结果 , 就必须重复测量多
次 , 费时太多。 特别当同时有许多试验处理需要测定时 , 效率太低 , 且 易 引 起眼睛疲
劳 , 造成视觉误差 , 影响测定的结果 。
考虑到对于大多数单胞藻 (无论是绿藻 、 金藻 、 硅藻等 ) 山 一 j几其载色体所含色素不
同 , 培养液都带有一定的色泽 。 在相同培养条件下 (特别是相同的光质 、 光 强 以 及温
度、 曹养条件下 ) , 浮游单胞藻藻液的色泽深浅和它们数量之间是存在一定关系的。 黎
尚豪等〔 z〕通过 自制的单种藻类生 一长浓度光电比色计 , 从微安培计的读数得出藻类相应的
重量浓度 ( m g八) 。 这种做法需要浓缩藻液 , 烘干 , 且所得数值乃藻类的于重 。 也有通
过叶绿素定量法〔`〕来计算藻类的数量 。 这样做要求每次抽提和测定样品的叶绿素含量 。
且不同类群藻类的叶绿素含量也远不相同 , 叶绿素含量又随细胞生理状态而不同 , 故统
计藻类的叶绿素法并未得到广泛应用 , 也不能代替计数法。 生产中还有采用目测藻液的
透明度法 , 对藻类生长量作一大致的估测。 以上这些方法 , 实质上都是建立在比色法的
基础上 。 本文是将光电比色和显微镜计数结合起来 , 通过藻液光密度的读取 , 以对照细
胞计数为基础 , 进行换算求得一种既快而又 可靠的计数方法。
试 验 材 料 和 方 法
我们选择了小新月菱形藻 ( N i , z s e h i a e l o s l e r i u m ) 、 微球藻 ( Ch l o r o c o e e u m o p . (
鞭金藻 ( D i e l a t e r i a s p . ) 、 亚心形扁藻 ( P l a t y m o n o s s 。 b e o r d i f o r m i s ) 等七天培养物 ,
、 叉
将
藻液稀释为原液的万 、万 、万 、荡 倍 , 然后用国产72 · 1型分光光度计进行比色 , 分别读取
原液和各稀释液的光密度值 . ( D i原液光密度 , D d稀释液的光密度 ) 。 用血球计数板对
原液进行计数 , 得到该液每毫升中细胞数 ( in ) .
升的细胞数 (n d ) 。
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结 果 和 讨 论
图 2 所示系不同稀释度的藻液浓度和光密度的关系 。 从图中可以看出藻液的光密度
和溶液稀释度之间的线性关系是十分明显的 。 我们再将用光密度换算出来的溶液中每毫
升细胞数和实际浓度 (按稀释度计算 ) 相比较 , 结果见表 I 。
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图 2 几种浮游单胞燕燕液浓度和光密度的关系
扁薄和微球藻用 660 ,洲波长 , 小新月菱形藻和义鞭金藻用 4 4” ” m 波长比色。
表 I 比色法测定细胞数目与实际计数之比较
名 }稀释度 { 光 密 度 {-
(桩毫升 )
小新月菱形藻
细 胞 数
实 际 计 数
0 1
.
7 x 106
5
。
3 5x 10
6
2
。
6 8 x 10。
1
。
3 4 x 10
6
0
。
6 8 x 10。
按光密度计算
10
。
7 x l 06
5
。
4 2x 0 1
6
2
。
8 4 x 10
6
l
。
4 9 8 x 106
0
.
7 1x 106
十 1。 3 帕
十 5. 9肠
+ 1
。
2肠
+ 6
。
O 帕
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1
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0
0
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5
K 1 0 6
x 1 0 6
x 1 0 6
0
.
2 5 x 1 0
8
0
.
1 3 x 1 0 8
2
.
0 x 1 0 6
0
.
9 x 1 0 6
0
.
5 6 x 1 0 6
0
。
3 1 x 1 0 .
0
。
1 5 x l 0 6
0
一 1 0帕
+ 1 2肠
+ 2 4帕
+ 1 5帕
微 球 藻 0
.
3 2
0
.
1 6
0
.
0 8 5
0
.
0 4
0
.
02
1 0
。
5 x 1 0。
5
.
2 5 义 1 0 6
2
.
6 3 x ] 0 6
1
.
3 1 5 又 1 0 e
0
。
6 6 x 1 0
8
1 0
.
5 x 1 0 6
5
.
2 5 x 1 0 e
2
.
7 8 x 1 0 6
1
.
3 1 x 1 0 .
0
。
6 6 x 1 0 .
0
0
+ 6呱
一 O。 2帕
0
令十去告一1于香资
义 鞭 金 藻
1
1
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6
.
5 x 1 0 .
3
.
5 1 x 1 0 .
1
.
6 9 又 1 0e
0
.
7 8 x 1 0 .
0
.
3 9 x 1 0 6
0
+ 8呱
+ 3
。
7帕
一 3 。 7帕
一 2 . 5怕
`入 从二 · ,·可以看出用光密度换算法计算出来的每毫升细胞数 ( dn 一群又 , ` ) 和实
际数依相比 , 小新月菱形藻 、 义鞭金藻和微球藻都比较相符 , 误差均在 8帕 以内 , 扁藻
误差较大。 我们在实际操作过程中发现 , 进行扁藻比色测定时 , 光电流变化很大 , 读数
不稳 , 原因是因为扁藻运动迅速 , 当光束通过藻液时 , 由于藻体的运动 , 引起透光度的
变动 , 使电流计指针来回移动 , 故我们认为这种方法用在运动十分活跃的单胞藻上是有
一定 问题的 , 但本法非常适用于运动性能较差的浮游单胞藻的测定 。 例如对于微球藻效
果很好 。 对那些已发生沉淀的陈旧藻液来说 , 如注意振荡均匀 , 快速进行测定 , 也还是
可以的 , 但效果不如新鲜培养液 。 我们在 “ 激素对小新月菱形藻生长影响” 的试验工作
中 (将有另文发表 ) , 就是采用比色法来进行细胞计数的 。 实践证明这种计数方法是可
靠和有效的。 但必须指出它只有相对测定的意义 , 也就是在每次测定时 , 我们都是以对
照的显微镜实测数来进行校准 。 事实证明 , 在不同时间测得的光密度和细胞数量之间没
有严格的比例关系 , 把不同时间和不同条 件 下 测 得 的 藻液光密度进行比较是不合适
的 。 (表 1 )
因此 , 不能通过绘制和查找标准曲线来读取换算。 因为单胞藻藻液的色泽 、 浊 !全受
各种内外因子的变化而变化 , 并不像在一种化学呈色反应中 , 产物数量和溶液颜色之间
有那样严格的定量关系 。 故为了消除 各次测定过程 「},所发生的系统误差 , 协次测定时必
须以一种材料的显微镜实测数作为基准 。 但即使如此 , 采用比色法 (辅之以 显 微 镜测
定 ) 还是大大提高了细胞计数效率 , 仍不失之为一项值得推广的快速和比较准确的细胞
计数方法 。
表 n 小新月趁形藻逐 日生长速度和光密度观察
5月1 9日 5月2 1 日 5月 2 2日 5月2 3日 5月2 4日 5月 2 6日
.2
5 !
.45
5 一 .74 8
.
8 1 1 1
.
0
i
` “ · ” 5
0
.
4 4 … 0 . 4 6 0 . 5 3
参 考 文 献
巴甫罗夫斯墓主编 1 9 6 2 淡水生物研究法 1 3 5 一 1 40 21 9一 2 20 科学出版于!
黎尚豪等 1 9 5 9 单细胞藻类的大量培养 水生生物学集刊 4 卷 5 65 页