全 文 ：第 34 卷第 2 期
2014 年 2 月
环 境 科 学 学 报
Acta Scientiae Circumstantiae
Vol． 34，No． 2
Feb．，2014
基金项目:海洋赤潮灾害立体监测技术与应用国家海洋局重点实验室开放研究基金(No． MATHAB20120101)
Supported by the Ｒeserch Foundation of Key Laboratoty of Tnterated Marine Monitoring and Applied Technologies for Harmful Algal Blooms(No．
MATHAB20120101)
作者简介:刘淑娟(1989— )，女，E-mail:xiaosanl3@ 126． com;* 通讯作者(责任作者)，E-mail:jpcheng@ sjtu． edu． cn
Biography:LIU Shujuan(1989—)，female，E-mail:xiaosanl3@ 126． com;* Corresponding author，E-mail:jpcheng@ sjtu． edu． cn
刘淑娟，赵晓祥，程金平，等． 2014．快速检测软骨藻酸的间接 ELISA方法［J］．环境科学学报，34(2):404-408
Liu S J，Zhao X X，Cheng J P，et al． 2014． Establishment of indirect ELISA to detect domoic acid［J］． Acta Scientiae Circumstantiae，34(2) :404-408
快速检测软骨藻酸的间接 ELISA方法
刘淑娟1，2，赵晓祥2，程金平1，* ，王茜1，王文华1
1． 上海交通大学 环境科学与工程学院，上海 200240
2． 东华大学 环境科学与工程学院，上海 201620
收稿日期:2013-06-29 修回日期:2013-09-02 录用日期:2013-09-03
摘要:分别对抗原、一抗、二抗的最佳稀释倍数、温育温度与时间、包被条件及其显色条件进行了优化，建立了一种快速检测软骨藻酸(Domoic
acid，DA)的酶联免疫分析法(ELISA)．结果表明:抗原、一抗和二抗(HＲP-IgG)最佳稀释度分别为1 ∶ 12800 倍、1 ∶ 400 倍和 1 ∶ 3000 倍;最佳包被
条件为 4 ℃包被 12 h;抗原抗体最佳反应温度为 37 ℃，反应时间为 60 min;二抗最佳反应温度为 43 ℃，反应时间为 30 min;最佳显色条件为室
温不避光显色 20 min．该方法的样品加标回收率高达 86． 8% ～103． 2%，其最低检测限(LOD)为 4． 86 ng·mL －1，光吸收值(OD值)的变异系数
(CV)在 2． 46% ～7． 08%之间．
关键词:软骨藻酸;间接竞争 ELISA法;快速检测
文章编号:0253-2468(2014)02-404-05 中图分类号:X131 文献标识码:A
Establishment of indirect ELISA to detect domoic acid
LIU Shujuan1，2，ZHAO Xiaoxiang2，CHENG Jinping1，* ，WANG Qian1，WANG Wenhua1
1． School of Environmental Science and Engineering，Shanghai Jiaotong University，Shanghai 200240
2． College of Environmental Science and Engineering，Donghua University，Shanghai 201620
Ｒeceived 29 June 2013; received in revised form 2 September 2013; accepted 3 September 2013
Abstract:An enzyme-linked immunosorbent assay (ELISA)was developed for rapid detecting domoic acid． The indirect competitive ELISA conditions，
including the optimal dilution ratios of antigen，antibody and HＲP-IgG，incubation and packets conditions as well as the color coating conditions，were
optimized． The results showed that the optimal dilution ratios of the antigen，antibody and HＲP-IgG were 1 ∶ 12800，1 ∶ 400 and 1 ∶ 3000，respectively;the
best packets condition was 12 h at 4 ℃，incubating 60 min at 37 ℃ after the antibody added，incubating 30 min at 43 ℃ after HＲP-IgG added，and the
best color condition was 20 min at room temperature． The detection limit was 4． 68 ng·mL －1，with the coefficient of variation (CV)of OD of 2． 46% ～
7． 08% ． The recoveries of this method was 86． 8% ～103． 2% ．
Keywords:domoic acid;indirect competitive ELISA;rapid detection
1 引言(Introduction)
软骨藻酸是赤潮毒素的一种，由海洋硅藻产生
的兴奋性神经毒素氨基酸，可在贝类中富集，因最
早从红藻属的树枝软骨藻(Chondria armata)中分离
出来并确定其结构被命名为软骨藻酸(Fire et al．，
2009)，人类和海洋哺乳动物误食含有 DA的鱼虾贝
类后会引起中毒，主要表现在干扰中枢神经系统，
发生暂时性失去记忆甚至死亡(Smith et al．，2006;
Costa et al．，2010;Jeffery et al．，2004;Mafra et al．，
2009)．在免疫学的基础上得到快速发展的酶联免
疫分析法，以其特异性高、灵敏度高、操作简便、检
测迅速和分析成本低的优点被广泛应用于环境中
污染物的分析(刘仁沿等，2009;Yu et al．，2009)．间
接竞争 ELISA法是检测抗体常用的方法，其优点是
只要变换包被抗原就可利用同一酶标抗体建立检
测相应的抗体(Guo et al．，2010)．
目前，国内还没有开发出成熟的 ELISA 试剂
盒，国外已经有商品化的 ELISA 检测试剂盒，但价
格昂贵．由于以 ELISA 为基础的免疫学检测方法具
DOI:10.13671/j.hjkxxb.2014.02.003
2 期 刘淑娟等:快速检测软骨藻酸的间接 ELISA方法
有快速、简便、灵敏与经济的特点，适用于大批样品
的筛查，因而越来越受到人们的青睐和重视． 本实
验在课题组对软骨藻酸快速检测技术研究的基础
上(王茜等，2012;高利利，2011;刘元嫄等，2011)，
进一步优化和建立了利用单抗快速检测 DA 的间接
竞争 ELISA方法，并对其线性检测范围、检测限、回
收率及稳定性等参数进行了研究． 同时也利用该方
法对部分贝类实际样品进行了初步检测，为最终形
成商品化的检测试剂盒奠定了良好基础．
2 材料和方法(Materials and methods)
2． 1 试剂与仪器
辣根过氧化物酶标记的羊抗鼠(酶标二抗，
HＲP-IgG)购于上海生工，软骨藻酸单克隆抗体为本
实验室自制． 常用化学试剂购自中国国药集团，分
析纯．其它实验所用仪器和试剂均与文献(王茜，
2012)相同．
2． 2 试验方法
2． 2． 1 包被抗原的制备 采用碳化二亚胺法合成
包被抗原 DA-BSA，反应完成后取少量混合物稀释，
用紫外可见分光光度计在 200 ～ 400 nm 进行扫描，
用以判断 DA是否与载体蛋白 BSA偶联成功．
2． 2． 2 抗原及单抗最佳稀释度的选择 采用方阵
滴定的方法:将包被抗原 DA-BSA 用碳酸盐缓冲液
(pH 为 9． 6)做 1 ∶ 200、1 ∶ 400、1 ∶ 800、1 ∶ 1600、
1 ∶ 3200、1 ∶ 6400、1 ∶ 12800、1 ∶ 25600 倍稀释，每孔
100 μL，4 ℃包被 12 h;用 PBST 洗涤 3 次，每次 3
min，拍干;用 1% PVA-PBS 做封闭液，37 ℃封闭 2
h;一抗用 0． 1% BSA-PBS 做 1 ∶ 200、1 ∶ 400、1 ∶ 800、
1 ∶ 1600、1 ∶ 3200、1 ∶ 6400 倍稀释，每孔 100 μL，每块
板同时设有空白和阴性对照，37 ℃温育 1 h;用
PBST洗涤、拍干;将酶标二抗用 0． 1% BSA-PBS 稀
释至1 ∶ 3000，每孔 100 μL，37 ℃温育 1 h;洗涤、拍
干;每孔加 TMB底物液 100 μL，室温显色 15 min，用
2 mol·L －1的浓硫酸每孔 50 μL终止反应;在 450 nm
及 630 nm处测定 OD值，实际值为 OD450 － OD630，依
据 OD值和 P /N值筛选抗原和一抗最佳稀释倍数．
2． 2． 3 酶标二抗最适稀释度的选择 在确定的最
佳包被抗原和单抗稀释度下，酶标二抗做 1 ∶ 2000、
1 ∶ 3000、1 ∶ 4000、1 ∶ 5000 和 1 ∶ 6000 倍稀释，进行
ELISA测定，依据 OD 值和 P /N 值筛选最佳酶标二
抗稀释度．
2． 2． 4 最佳抗原包被条件的选择 以包被抗原最
佳稀释度包被，设置 37 ℃包被 1 h后转入 4 ℃包被
12 h、37 ℃包被 2 h转入后 4 ℃包被 12 h、37 ℃包被
3 h后转入 4 ℃包被 12 h、4 ℃包被 12 h、37 ℃包被
1 h、37 ℃包被 2 h 和 37 ℃包被 3 h 等 7 个包被条
件，进行 ELISA 测定，依据其 OD 值和 P /N 值筛选
最佳包被条件．
2． 2． 5 抗原、单抗最佳作用时间和温度的选择 在
上述最佳条件下，选择在 25 ℃、37 ℃和 43 ℃ 3 个
温育温度，抗原和一抗作用 30 min、45 min、60 min、
90 min，进行 ELISA测定，依据其 OD值和 P /N值筛
选抗原、单抗最佳作用温度和时间．
2． 2． 6 酶标二抗最佳作用时间和温度的选择 在
上述最佳条件下，选择在 25 ℃、37 ℃和 43 ℃ 3 个
温育温度，二抗温育 30 min、45 min、60 min、90 min，
进行 ELISA测定，依据其 OD 值和 P /N 值筛选酶标
二抗最佳作用时间和温度．
2． 2． 7 最佳显色条件的选择 在上述最佳条件下
进行 ELISA测定，于室温和 37 ℃条件下，避光和不
避光显色 5 min、10 min、15 min、20 min、30 min，依据
其 OD值和 P /N值筛选最佳显色条件．
2． 2． 8 标准曲线的制作 利用上述建立的最佳条
件包被抗原，洗涤;一抗稀释至最佳稀释度，每孔加入
50 μL;将 DA用 PBS配成 100 ng·mL －1、50 ng·mL －1、
20 ng·mL －1、10 ng·mL －1、4 ng·mL －1、2 ng·mL －1、0
ng·mL －1系列浓度，每孔加入 50 μL．按之前建立的
最佳条件进行 ELISA测定．
2． 2． 9 重复性试验 将 DA稀释为 0、20、50 和 100
ng·mL －1 4 个不同浓度，按上述建立的间接竞争
ELISA 法操作步骤，同一浓度在同一板内、不同时
间、相同条件下重复检测 5 次，同一浓度在不同板
内、同一时间、相同条件下重复 5 次计算板内精密度
和板间精密度．
2． 2． 10 加标回收率的测定 在阴性样品中分别添
加 10、20 和 50 ng·mL －1的 DA，按照本文建立的间
接竞争 ELISA 方法测定，计算加标回收率．
3 结果与讨论(Ｒesults and discussion)
3． 1 包被抗原的制备与鉴定
软骨藻酸为小分子化合物，属于半抗原类物质，
可以与抗体发生反应，具有抗原性，但是无法与有机
体产生免疫应答反应．为使软骨藻酸具有免疫原性，
需将它与大分子载体偶联形成包被抗原．本研究选择
载体蛋白 BSA对 DA进行偶联．反应完成后，将合成
504
环 境 科 学 学 报 34 卷
完的偶联物 DA-BSA和 DA、BSA稀释，用紫外光谱仪
进行扫描，所获得的紫外吸收谱如图 1所示．
图 1 DA、BSA、DA-BSA紫外吸收图谱
Fig． 1 UV absorption spectrums of DA，BSA and DA-BSA
由图 1 可以看出，DA 的 UV 特征吸收峰在 242
nm处，载体蛋白 BSA 在 215 nm 和 278 nm 处各有
一个吸收峰，而合成的偶联物的紫外吸收图谱与
DA和 BSA 图谱的峰型及最大吸收峰有明显的区
别，因此推断 DA成功偶联到 BSA上，成功制得包被
抗原 DA-BSA．
3． 2 包被抗原和一抗的最佳稀释度的确定
试验采用方阵滴定法，筛选出抗原和一抗最佳
稀释度，从而使抗体与抗原充分结合，提高了反应
的灵敏度．由表 1 可见:随着一抗稀释倍数的增加
OD逐渐降低． 当抗原稀释 12800 倍、一抗稀释 400
倍数时，OD值为 1． 031，P /N值为 21． 6．因此确定抗
原和一抗的最佳稀释度为 1 ∶ 12800 倍和1 ∶ 400 倍．
表 1 包被抗原和一抗最佳稀释度的确定
Table 1 Optimization of the coating antigen and antibody concentrations
包被抗原
稀释倍数
OD值
抗体稀释倍数
200 400 800 1600 3200 6400
空白 阴性
400 0． 997 0． 558 0． 291 0． 164 0． 140 0． 088 0． 080 0． 163
800 1． 044 0． 520 0． 309 0． 185 0． 137 0． 115 0． 104 0． 246
1600 1． 279 0． 691 0． 375 0． 226 0． 191 0． 109 0． 092 0． 207
3200 1． 359 0． 894 0． 541 0． 323 0． 204 0． 136 0． 113 0． 254
6400 1． 307 0． 963 0． 581 0． 398 0． 256 0． 174 0． 153 0． 184
12800 1． 259 1． 031 0． 653 0． 422 0． 278 0． 171 0． 166 0． 206
25600 1． 232 1． 091 0． 716 0． 468 0． 310 0． 218 0． 314 0． 322
3． 3 酶标羊抗小鼠二抗最佳使用浓度的确定
将酶标羊抗小鼠二抗分别稀释 2000、3000、
4000、5000 和 6000 倍，分别测其 OD 值并计算出
P /N值，结果如表 2 所示．
表 2 二抗使用浓度与 P /N值变化
Table 2 Variations between P /N value and HＲP-IgG concentration
二抗稀释倍数 OD值 P /N值
2000 1． 286 7． 3
3000 1． 006 17． 9
4000 0． 752 9． 5
5000 0． 654 7． 9
6000 0． 522 5． 7
当酶标二抗稀释度为 1 ∶ 3000 时，OD 值为
1. 006，P /N值为 17． 9，故酶标二抗最佳稀释度为
1 ∶ 3000倍．
3． 4 抗原包被条件的确定
将最佳稀释度的抗原在不同包被条件下进行
ELISA测定，结果如表 3 所示．当抗原在 4 ℃包被 12
h时 OD值为 0． 9820，P /N最大，故最佳包被条件为
4 ℃包被 12 h．
表 3 抗原最适包被条件的确定
Table 3 Conditional optimization of antigen coating
包被条件 OD值 P /N值
37 ℃包被 1 h 0． 6854 10． 7
37 ℃包被 2 h 0． 6045 5． 4
37 ℃包被 3 h 0． 6016 3． 1
4 ℃包被 12 h 0． 9820 16． 5
37 ℃包被 1 h后 4 ℃包被 12 h 0． 7159 10． 8
37 ℃包被 2 h后 4 ℃包被 12 h 0． 6249 6． 9
37 ℃包被 3 h后 4 ℃包被 12 h 0． 6858 5． 3
604
2 期 刘淑娟等:快速检测软骨藻酸的间接 ELISA方法
3． 5 抗原、抗体最佳作用时间和温度的确定
分别选择 25 ℃、37 ℃和 43 ℃为反应温度，抗
原和一抗作用 30 min、45 min、60 min、90 min． 研究
结果显示:在 37 ℃反应 60 min 时 OD 值为 0． 987，
P /N值为 16． 8，因此抗原抗体最佳反应温度为 37
℃，反应时间 60 min．
3． 6 酶标二抗最佳作用时间和温度的确定
分别选择 25 ℃、37 ℃和 43 ℃为反应温度，二
抗反应 30 min、45 min、60 min 和 90 min． 研究结果
显示:在 43 ℃反应 30 min 时 OD 值为 0． 963，P /N
值为 49． 6，因此酶标二抗最佳反应温度为 43 ℃，反
应时间 30 min．
3． 7 最佳显色条件的选择与确定
以避光和不避光为反应条件，分别在室温和 37
℃反应 5 min、10 min、15 min、20 min和 30 min．结果
显示:在室温不避光条件下，反应 20 min时 OD值为
0． 977，P /N值为 8． 8，因此最佳显色条件为室温不
避光显色 20 min．
3． 8 标准曲线的绘制
以不同浓度标准品的对数值为横坐标，以 B /B0
值为纵坐标绘制标准曲线，计算曲线的回归方程和
可决系数，B / B0 = 1 ． 2时对应的DA浓度值即为最
低检测限．所获标准曲线如图 2 所示，曲线方程为
y = － 0． 0896x + 0． 975，Ｒ2 = 0． 9943．利用回归方程
计算出该间接 ELISA 法的最低检测限为 4． 86
ng·mL －1 ．
图 2 间接竞争 ELISA标准工作曲线
Fig． 2 Standard working curve of ic-ELISA
3． 9 重复性试验
间接竞争 ELISA 标准曲线的孔间差异如表 4
所示．间接竞争 ELISA 标准曲线的板间差异如表 5
所示．由表 4 和表 5 计算出 OD 值的孔间变异系数
为2． 81% ～ 7． 08%，板间变异系数为 2． 46% ～
5. 96%，均小于 15． 00%，表明本方法具有良好的重
现性．
表 4 间接竞争 ELISA标准曲线的孔间差异
Table 4 The variation among holes in standard curve of ic-ELISA
DA浓度 /(ng·mL －1) OD450 － OD630值 CV
0 1． 057 1． 011 0． 982 0． 968 0． 973 3． 69%
20 0． 732 0． 603 0． 698 0． 662 0． 675 7． 08%
50 0． 603 0． 594 0． 569 0． 612 0． 583 2． 84%
100 0． 535 0． 507 0． 542 0． 513 0． 521 2． 81%
表 5 间接竞争 ELISA标准曲线的板间差异
Table 5 The variation between-assay in standard curve of ic-ELISA
DA浓度 /(ng·mL －1) OD450 － OD630值 CV
0 1． 036 1． 041 0． 996 0． 973 1． 114 5． 21%
20 0． 721 0． 621 0． 673 0． 654 0． 677 5． 45%
50 0． 611 0． 536 0． 594 0． 627 0． 576 5． 96%
100 0． 527 0． 538 0． 504 0． 529 0． 518 2． 46%
3． 10 加标回收率的测定
取阴性样本添加一定浓度的 DA，其回收率如
表 6 所示．可以看出，该法的添加回收率在 85% ～
115%范围内，可见本研究建立的间接竞争 ELISA
法能够满足一般检测要求．
表 6 间接竞争 ELISA加标回收率
Table 6 Sample recovery ofic-ELISA
样品添加浓度 /
(ng·mL －1)
样品数 /
个
OD450 － OD630平均值 /
(ng·mL －1)
加标
回收率
10 10 0． 736 86． 80%
20 10 0． 662 98． 20%
50 10 0． 594 103． 20%
704
环 境 科 学 学 报 34 卷
4 结论(Conclusions)
本文建立的间接竞争 ELISA 法快速、灵敏、重
现性好．不仅能满足国际规定的 20 ng·mL －1 DA 安
全限值的测定要求，而且也适合应用于现场对大批
量样本的检测．
责任作者简介:程金平，男，博士，研究员，研究领域为环境化
学，先后作为项目负责人或主要参与人，承担国家自然科学
基金、国家“863”、国家“973”、上海科委科技攻关在内的科
研项目 20 余项;2012 年入选教育部新世纪优秀人才．
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