全 文 ：　 收稿日期：２０１４－０１－０７　　　修回日期：２０１４－０２－１７
基金项目：国家９７３计划（Ｎｏ．２０１０ＣＢ４２８７０４）；国家自然科学基金（Ｎｏ．４０８３１１６０５１９）；广东海洋经济发展区域示范项
目（Ｎｏ．ＧＤ２０１２－Ｄ０１－００１）
　＊通讯作者：高亚辉，男，教授，博士研究生导师，主要从事海洋硅藻研究．
第３０卷第３期
Ｖｏｌ．３０　Ｎｏ．３
分 析 科 学 学 报
ＪＯＵＲＮＡＬ　ＯＦ　ＡＮＡＬＹＴＩＣＡＬ　ＳＣＩＥＮＣＥ
２０１４年６月

Ｊｕｎ． ２０１４
ＤＯＩ：１０．１３５２６／ｊ．ｉｓｓｎ．１００６－６１４４．２０１４．０３．００５
高效液相色谱－串联质谱法测定人血浆和尿液中
记忆丧失性贝毒软骨藻酸
洪　专１，２，张怡评２，陈伟珠２，高亚辉＊１
（１．厦门大学生命科学学院，福建厦门３６１１０２；
２．国家海洋局第三海洋研究所，福建厦门３６１００５）
摘　要：建立了高效液相色谱－串联三重四极杆质谱法（ＨＰＬＣ－ＭＳ／ＭＳ）测定人血浆及
尿液中记忆丧失性贝毒软骨藻酸。人血浆及尿液样品加入６倍体积甲醇沉淀剂，涡旋
离心后，取上清液进样测定。色谱柱为Ｚｏｒｂａｘ　ＳＢ　Ｃ１８柱（１５０×４．６ｍｍ，５μｍ），柱温
３０℃；流动相为乙腈－０．１％甲酸水溶液（１３∶８７，Ｖ／Ｖ），流速为１．０ｍＬ／ｍｉｎ。该方法检
测血浆和尿液中软骨藻酸的线性范围均为１．８～１１５μｇ／Ｌ，相关系数ｒ＝０．９９９，检出限
为０．９μｇ／Ｌ，定量下限为１．８μｇ／Ｌ。该方法具有操作方便、专属性强、灵敏度高的特
点，适用于人体血浆及尿液中软骨藻酸的测定。
关键词：高效液相色谱－串联质谱法；软骨藻酸；血浆；尿液
中图分类号：Ｏ６５７．６３　　　文献标志码：Ａ　　　文章编号：１００６－６１４４（２０１４）０３－３１９－０４
软骨藻酸（Ｄｏｍｏｉｃ　Ａｃｉｄ，ＤＡ）是海洋中硅藻产生的一种生物毒素，它可在贝类中富集，并通过食物链
对人、海鸟和海洋哺乳动物产生毒害作用。现已建立的软骨藻酸检测分析方法有小鼠生物分析法［１］、高效
液相色谱法［２－５］、毛细管电泳法［６－７］、酶联免疫分析法［８］、胶体金免疫层析法［９］、气相色谱法［１０］、受体分析
法［１１］、薄层色谱法［１２］和生物传感器法［１３］等。基于高效液相色谱－质谱联用技术检测软骨藻酸的方法也得
到不断地改进，目前主要用于海水、水产品和浮游生物中软骨藻酸含量的检测［１４－１７］。准确测定人血浆和
尿液中微量软骨藻酸含量，是开展软骨藻酸中毒患者病因诊断及其代谢动力学研究的前提条件。
本研究建立了快速测定人体血浆和尿液中软骨藻酸的高效液相－串联四极杆质谱（ＨＰＬＣ－ＭＳ／ＭＳ）检
测方法。该方法操作简便，灵敏度高，重复性好，能够满足相关检测的需要。
１　实验部分
１．１　仪器、试剂与材料
ＨＰＬＣ－１２００高效液相色谱仪（美国，安捷伦公司）；ＡＢＩ　４０００ＱＴＲＡＰ质谱仪（美国，ＡＢ　Ｓｃｉｅｘ公司）；
ＣＰＡ２Ｐ百万分之一天平（德国，Ｓａｒｔｏｒｉｕｓ公司）；Ｍｉｌｉ－Ｑ超纯水机（德国，Ｍｉｌｉｐｏｒｅ公司）；Ｈ－１６５０高速离
心机（湖南湘仪）。
软骨藻酸标准品（Ｓｉｇｍａ公司）溶液：精密称取１．１５ｍｇ软骨藻酸标准品于１０ｍＬ容量瓶中，用甲醇
稀释至刻度，摇匀，即得质量浓度为１１５ｍｇ／Ｌ的储备液，标准工作液由甲醇稀释而成。甲醇（色谱纯，
Ｍｅｒｃｋ公司）；甲酸（色谱纯，Ｔｅｄｉａ公司）。
人体血浆由厦门市中心血站提供，尿液由健康自愿者提供。
９１３
第３期 洪　专 等：高效液相色谱－串联质谱法测定人血浆和尿液中记忆丧失性贝毒软骨藻酸 第３０卷
１．２　样品处理
１．２．１　血浆样品处理　精密移取１００μＬ人体血浆于１．５ｍＬ离心管中，加入２０μＬ软骨藻酸标准工作
液，涡旋混匀，加入６００μＬ的甲醇溶液，充分振荡３ｍｉｎ，１２　０００ｒ／ｍｉｎ离心１０ｍｉｎ，取上清液，用０．２２μｍ
的滤膜过滤后，进样分析。
１．２．２　尿液样品处理　精密移取１００μＬ人体尿液于１．５ｍＬ离心管中，加入２０μＬ软骨藻酸标准工作
液，涡旋混匀，加入６００μＬ的甲醇溶液，充分振荡３ｍｉｎ，１２　０００ｒ／ｍｉｎ离心１０ｍｉｎ，取上清液，用０．２２μｍ
的滤膜过滤后，进样分析。
１．３　液相色谱及质谱条件
色谱条件：Ｚｏｒｂａｘ　ＳＢ　Ｃ１８色谱柱（１５０×４．６ｍｍ，５μｍ），柱温３０℃；流动相为乙腈－０．１％甲酸水溶液
（１３∶８７，Ｖ／Ｖ），流速：１．０ｍＬ／ｍｉｎ，进样量：５μＬ。
质谱条件：采用ＥＳＩ源，正离子模式扫描，喷雾电压ＩＳ为５　５００Ｖ，雾化温度为５００℃、雾化气为６０Ｌ／ｈ，
气帘气ＣＵＲ为２０Ｌ／ｈ，离子去簇电压（ＤＰ）为６５Ｖ，聚焦电压（ＥＰ）为１０Ｖ，碰撞活化电压（ＣＥ）为８Ｖ。
２　结果与讨论
２．１　样品处理方法的选择
本实验分别考察了甲醇、乙腈和乙酸乙酯三种沉淀剂。结果发现，采用乙酸乙酯时，较易挥发，重复性
较差，且回收率较低，可能是因为乙酸乙酯的极性较小，对软骨藻酸的溶解性较差；用乙腈沉淀提取，血浆
样品沉淀成团状，造成提取不完全，重复性较差；而用甲醇沉淀时，其沉淀呈均匀絮状，重复性较好。同时，
分别考察了４、６、８、１０倍量沉淀剂对软骨藻酸响应值的影响，结果表明随着沉淀剂量的增加，软骨藻酸信
号峰逐渐下降，从峰信号强弱以及沉淀是否完全考虑，选用６倍体积甲醇作为沉淀剂。
２．２　色谱条件的优化
参考文献［１４］中采用的色谱条件，当将流动相中水相改为０．１％甲酸水溶液时，色谱峰形较好。同
时，选用了乙腈－０．１％甲酸水溶液体积比为３０∶７０、２０∶８０、１３：８７和１０∶９０，考察流动相比例对样品峰的影
响。实验表明，当采用体积比１３∶８７的乙腈－０．１％甲酸水溶液时，其信噪比达到最大。以此比例，分别考
察流速为０．６、０．８和１．０ｍＬ／ｍｉｎ对样品出峰的影响，结果发现当流速为０．６ｍＬ／ｍｉｎ时，出峰时间较长、
峰较宽；当流速为０．８ｍＬ／ｍｉｍ时，峰形拖尾。因此流速选择１．０ｍＬ／ｍｉｎ。此外，还考察了进样量对样
品色谱峰信号的影响，结果表明，当进样量大于５μＬ时，色谱峰面积不再随进样量增加而明显增加。
２．３　方法的专属性
软骨藻酸母离子［Ｍ＋１］＋为ｍ／ｚ３１２．２，２个信号较强的碎片离子为ｍ／ｚ１６１．３、２６６．２，处理后样品进
行分离检测时，ｍ／ｚ２６６．２碎片离子丰度较高，因此，选择离子对ｍ／ｚ３１２．２／２６６．２作为定量峰。在上述色
谱条件下，血浆和尿液样品色谱分离良好，内源性物质不干扰软骨藻酸的测定，见图１、２。
图１　血浆中添加软骨藻酸的 ＭＲＭ色谱图
Ｆｉｇ．１　ＭＲＭ　ｃｈｒｏｍａｔｏｇｒａｍ　ｏｆ　ｐｌａｓｍ　ｓｐｉｋｅｄ　ｗｉｔｈ
ｄｏｍｏｉｃ　ａｃｉｄ
图２　尿液中添加软骨藻酸的 ＭＲＭ的色谱图
Ｆｉｇ．２　ＭＲＭ　ｃｈｒｏｍａｔｏｇｒａｍ　ｏｆ　ｕｒｉｎｅ　ｓｐｉｋｅｄ　ｗｉｔｈ
ｄｏｍｏｉｃ　ａｃｉｄ
２．４　血浆和尿液样品中软骨藻酸测定方法评价
２．４．１　线性范围　取０．１ｍＬ空白血浆或空白尿液，加入软骨藻酸对照品溶液，配制１．８、３．６、７．２、１４．４、
２８．８、５７．６和１１５μｇ／Ｌ系列标准溶液按１．２节方法沉淀提取，并进行质谱分析，记录软骨藻酸色谱峰面积，
以峰面积（Ｙ）对质量浓度（Ｘ）进行线性回归，血浆样品中标准曲线回归方程为：Ｙ＝６５．７Ｘ－３８６（ｒ＝０．９９９），
线性范围１．８～１１５μｇ／Ｌ；尿液样品中标准曲线为Ｙ＝１２４Ｘ－１３４（ｒ＝０．９９９），线性范围为１．８～１１５μｇ／Ｌ。
０２３
第３期 分 析 科 学 学 报 第３０卷
２．４．２　加标回收率实验　分别取含有软骨藻酸１８、７２和２８８μｇ／Ｌ的标准血浆样品和标准尿液样品，按
１．２节方法沉淀提取，测得软骨藻酸的峰面积，计算血浆和尿液中软骨藻酸的加标回收率和相对标准偏差
（ＲＳＤ），结果见表１。
表１　加标回收率
Ｔａｂｌｅ　１　Ｒｅｃｏｖｅｒｉｅｓ　ｏｆ　ｄｏｍｏｉｃ　ａｃｉｄ　ｉｎ　ｕｒｉｎｅ　ａｎｄ　ｐｌａｓｍａ
Ｐｌａｓｍａ　 Ｕｒｉｎｅ
Ａｄｄｅｄ（μｇ／Ｌ） Ｒｅｃｏｖｅｒｙ（％） ＲＳＤ（％） Ａｄｄｅｄ（μｇ／Ｌ） Ｒｅｃｏｖｅｒｙ（％） ＲＳＤ（％）
１８　 １１７　 １．７　 １８　 ９８．６　 ４．０
７２　 １０２．７　 ４．０　 ７２　 ９８．６　 ６．１
２８８　 １０２．２　 ２．３　 ２８８　 ９９．９　 ３．８
２．４．３　基质效应　取１００μＬ空白血浆或空白尿液，精密加入系列对照品溶液２０μＬ，分别配制成质量浓
度为１８、７２、２８８μｇ／Ｌ的系列标准血浆样品和尿液样品各５份，按照１．２节方法处理并进行分析；同法分
别用水代替血浆和空白尿液，按照上述方法处理。以每一种浓度的两种不同处理方法分析得到的峰面积
比值计算基质效应，见表２。由表内数据可知，血浆、尿液均对软骨藻酸基质效应不显著。
表２　基质效应
Ｔａｂｌｅ　２　Ｍａｔｒｉｘ　ｅｆｆｅｃｔ　ｏｆ　ｕｒｉｎｅ　ａｎｄ　ｐｌａｓｍａ
Ｐｌａｓｍａ　 Ｕｒｉｎｅ
Ｃｏｎｃｅｎｔｒａｔｉｏｎ（μｇ／Ｌ） Ｓｕｂ．Ｅｆｆ．（％） ＲＳＤ（％） Ｃｏｎｃｅｎｔｒａｔｉｏｎ（μｇ／Ｌ） Ｓｕｂ．Ｅｆｆ．（％） ＲＳＤ（％）
１８　 ９３．５　 １４．３　 １８　 ８６．６　 ８．４
７２　 ９７．７　 １０．２　 ７２　 ８４．４　 ６．８
２８８　 ８２．２　 ８．０　 ２８８　 ７９．２　 １．９
２．４．４　精密度实验　分别取含有软骨藻酸的低、中、高３种不同质量浓度的标准血浆样品与标准尿液样
品，分别测定５次，计算精密度。血浆与尿液中测定的ＲＳＤ均小于１０％（ｎ＝５）。可见分析方法的精密度
符合药物动力学研究要求。
２．４．５　稳定性实验　考察了软骨藻酸在不同贮存条件下的稳定性。配制含有软骨藻酸的低、中、高３种
不同质量浓度的标准血浆样品与标准尿液样品，并分别于－８０℃冻融３次。结果表明血浆样品和尿液样
品冻融３次后测得的浓度为初始溶度的８７．０％～１１９．３％，冻融对样品的稳定性没有影响，见表３。
表３　样品冻融３次的稳定性
Ｔａｂｌｅ　３　Ｓｔａｂｉｌｉｔｙ　ｏｆ　ｓａｍｐｌｅ　ａｆｔｅｒ　ｆｒｅｅｚｅ－ｔｈａｗ　ｕｎｄｅｒ　ｔｈｅ　ｃｏｎｄｉｔｉｏｎ－８０℃
Ｆｒｅｅｚｅ－ｔｈａｗ
ｔｉｍｅｓ
Ｐｌａｓｍａ　 Ｕｒｉｎｅ
Ｃｏｎｃｅｎｔｒａｔｉｏｎ
（μｇ／Ｌ）
Ｐｅｒｃｅｎｔａｇｅ
（％）
ＲＳＤ
（％）
Ｃｏｎｃｅｎｔｒａｔｉｏｎ
（μｇ／Ｌ）
Ｐｅｒｃｅｎｔａｇｅ
（％）
ＲＳＤ
（％）
Ｏｎｅ　 １８　 １０８．０　 ４．９　 １８　 １１９．３　 １．７
７２　 １０２．６　 ５．１　 ７２　 １０８．０　 ２．４
２８８　 １１０．０　 ５．５　 ２８８　 １０７．３　 ２．８
Ｔｗｉｃｅ　 １８　 １０９．０　 ４．２　 １８　 １１４．７　 ５．３
７２　 １０１．４　 ４．９　 ７２　 ９８．１　 ５．６
２８８　 １０４．３　 ６．８　 ２８８　 １０４．４　 ７．２
Ｔｈｉｒｄ　 １８　 ８７．０　 ２．０　 １８　 １０９．７　 ２．８
７２　 １０４．７　 ２．９　 ７２　 １０８．０　 ６．５
２８８　 １１７．０　 ６．４　 ２８８　 １０６．０　 ５．０
２．４．６　检出限与定量下限　以信噪比（Ｓ／Ｎ）为３作为检出限，以Ｓ／Ｎ比为５作为定量下限，经过不断稀
释样品并分析检测可得，血浆样品中软骨藻酸的检出限为０．９μｇ／Ｌ，定量限为１．８μｇ／Ｌ；尿液样品中软骨
藻酸的检出限为０．９μｇ／Ｌ，定量限为１．８μｇ／Ｌ。
３　 结论
本研究建立了人体血浆及尿液中记忆丧失性贝毒软骨藻酸（ＤＡ）的ＬＣ／ＭＳ／ＭＳ测定方法。该方法
１２３
第３期 洪　专 等：高效液相色谱－串联质谱法测定人血浆和尿液中记忆丧失性贝毒软骨藻酸 第３０卷
快速、准确，操作简单、选择性好、灵敏度高，可为软骨藻酸样品的药物动力学分析研究以及食物中毒诊断
提供可靠的检测方法。
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Ｄｅｔｅｒｍｉｎａｔｉｏｎ　ｏｆ　Ｄｏｍｏｉｃ　Ａｃｉｄ　ｉｎ　Ｈｕｍａｎ　Ｐｌａｓｍａ　ａｎｄ　Ｕｒｉｎｅ
ｂｙ　Ｈｉｇｈ　Ｐｅｒｆｏｒｍａｎｃｅ　Ｌｉｑｕｉｄ　Ｃｈｒｏｍａｔｏｇｒａｐｈｙ
Ｔａｎｄｅｍ　Ｍａｓｓ　Ｓｐｅｃｔｒｏｍｅｔｒｙ
ＨＯＮＧ　Ｚｈｕａｎ１，２，ＺＨＡＮＧ　Ｙｉ－ｐｉｎｇ２，ＣＨＥＮ　Ｗｅｉ－ｚｈｕ２，ＧＡＯ　Ｙａ－ｈｕｉ＊１
（１．Ｓｃｈｏｏｌ　ｏｆ　Ｌｉｆｅ　Ｓｃｉｅｎｃｅｓ，Ｘｉａｍｅｎ　Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ，Ｘｉａｍｅｎ３６１１０２；
２．Ｔｈｅ　Ｔｈｉｒｄ　Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ　ｏｆ　Ｏｃｅａｎｏｇｒａｐｈｙ，ｔｈｅ　Ｓｔａｔｅ　Ｏｃｅａｎｉｃ　Ａｄｍｉｎｉｓｔｒａｔｉｏｎ，Ｘｉａｍｅｎ３６１００５）
Ａｂｓｔｒａｃｔ：Ｈｉｇｈ　ｐｅｒｆｏｒｍａｎｃｅ　ｌｉｑｕｉｄ　ｃｈｒｏｍａｔｏｇｒａｐｈｙ（ＨＰＬＣ）ｃｏｍｂｉｎｅｄ　ｗｉｔｈ　ｔａｎｄｅｍ　ｍａｓｓ　ｓｐｅｃｔｒｏｍｅｔｒｙ
（ＬＣ／ＭＳ／ＭＳ）ｈａｓ　ｂｅｅｎ　ｄｅｖｅｌｏｐｅｄ　ｆｏｒ　ｔｈｅ　ｄｅｔｅｒｍｉｎａｔｉｏｎ　ｏｆ　ｄｏｍｏｉｃ　ａｃｉｄ　ｉｎ　ｈｕｍａｎ　ｐｌａｓｍａ　ａｎｄ　ｕｒｉｎｅ．６
ｔｉｍｅｓ　ｖｏｌｕｍｅ　ｏｆ　ｍｅｔｈａｎｏｌ　ｗａｓ　ａｄｄｅｄ　ｔｏ　ｔｈｅ　ｓａｍｐｌｅ　ｆｏｒ　ｐｒｏｔｅｉｎ　ｐｒｅｃｉｐｉｐａｔｉｏｎ；ａｆｔｅｒ　ｖｏｒｔｅｘ－ｃｅｎｔｒｉｆｕｇｉｎｇ，
ｔｈｅ　ｆｌｏａｔｅｄ　ｓｕｐｅｒｎａｔａｎｔ　ｗａｓ　ｉｎｊｅｃｔｅｄ　ｉｎｔｏ　ｔｈｅ　ＨＰＬＣ－ＭＳ　ｓｙｓｔｅｍ．Ｔｈｅ　ｓｅｐａｒａｔｉｏｎ　ｗａｓ　ｐｅｒｆｏｒｍｅｄ　ｏｎ　ａ
Ｚｏｒｂａｘ　ＳＢ　Ｃ１８（１５０×４．６ｍｍ，５μｍ），ｕｓｉｎｇ　ａｃｅｔｏｎｉｔｒｉｌｅ　ａｎｄ　０．１％ｆｏｒｍｉｃ　ａｃｉｄ　ｉｎ　ｗａｔｅｒ（１３∶８７，Ｖ／Ｖ）ａｓ
ｔｈｅ　ｍｏｂｉｌｅ　ｐｈａｓｅ　ｗｉｔｈ　ｔｈｅ　ｆｌｏｗｒａｔｅ　ｏｆ　１．０ｍＬ／ｍｉｎ．Ｉｔ　ｗａｓ　ｆｏｕｎｄ　ｔｈａｔ　ｌｉｎｅａｒ　ｒａｎｇｅｓ　ｉｎ　ｂｏｔｈ　ｐｌａｓｍａ　ａｎｄ
ｕｒｉｎｅ　ｓａｍｐｌｅｓ　ｗｅｒｅ　１．８－１１５μｇ／Ｌ　ｗｉｔｈ　ｔｈｅ　ｃｏｒｒｅｌａｔｉｏｎ　ｃｏｅｆｆｉｃｉｅｎｔｓ　ｏｆ　０．９９９．Ｔｈｅ　ｌｉｍｉｔ　ｏｆ　ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ（ＬＯＤ）
ｗａｓ　０．９μｇ／Ｌ　ａｎｄ　ｔｈｅ　ｌｉｍｉｔ　ｏｆ　ｑｕａｎｔｉｔａｔｉｏｎ（ＬＯＱ）ｗａｓ　１．８μｇ／Ｌ．Ｔｈｅ　ｍｅｔｈｏｄ　ｉｓ　ｓｉｍｐｌｅ，ｓｅｌｅｃｔｉｖｅ　ａｎｄ
ｓｅｎｓｉｔｉｖｅ　ｆｏｒ　ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ　ｏｆ　ｄｏｍｏｉｃ　ａｃｉｄ　ｉｎ　ｈｕｍａｎ　ｐｌａｓｍａ　ａｎｄ　ｕｒｉｎｅ．
Ｋｅｙｗｏｒｄｓ：ＨＰＬＣ－ＭＳ／ＭＳ；Ｄｏｍｏｉｃ　ａｃｉｄ；Ｐｌａｓｍａ；Ｕｒｉｎｅ
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