全 文 ：文章编号:1001 － 4829(2016)09 － 2206 － 06 DOI:10． 16213 / j． cnki． scjas． 2016． 09． 033
收稿日期:2015 － 10 － 12
基金项目:福建省菌草生态产业协同创新中心(K80ND8002);
福建农林大学科技发展基金(KF2015111);国家菌草工程技术
研究中心组建项目(2011FU125X12)
作者简介:李 晶(1985 －)，女，湖北武汉人，博士，蔬菜学专业
食用菌方向，* 为通讯作者，E-mail:lzxjuncao@ 163． com。
牛樟芝菌丝体和子实体三萜含量测定
及 Se和 Mvd基因表达分析
李 晶1，3，林雄杰2，何静敏3，蔡 璨3，林占熺1，3*
(1． 国家菌草工程技术研究中心，福建 福州 350002;2． 福建省农业科学院果树研究所，福建 福州 350013;3．福建农林大学生
命科学学院，福建 福州 350002)
摘 要:为探讨牛樟芝子实体和不同培养时期的菌丝体中三萜含量及鲨烯环氧酶基因(Se)和甲羟戊酸焦磷酸脱羧酶基因(Mvd)
的表达情况，采用香草醛 －冰醋酸法测定菌丝体和子实体的三萜含量，并利用实时荧光定量 PCＲ(qＲT-PCＲ)分析甲羟戊酸途径
(MVA)中 Se和 Mvd基因表达水平。结果表明，随着培养时间的推移，当生长至 21 d时牛樟芝菌丝体干重逐渐趋于稳定。当培养
时间小于 28 d时，菌丝体中三萜含量随着培养时间的延长而逐渐增加，且 28 d时菌丝体的三萜含量最高，达(39． 192 ± 2． 025)mg /
g，仅次于牛樟芝子实体三萜含量(49． 391 ± 2． 675)mg /g，玉米芯栽培的牛樟芝子实体三萜含量最低，为(11． 530 ± 0． 733)mg /g，各
样品间三萜含量差异达到显著水平(P ＜ 0． 05)。qＲT-PCＲ分析结果表明，培养 7 d的菌丝体中 Se和 Mvd的表达量均为最高，但随
着培养时间的继续延长而呈现下降趋势;牛樟芝子实体中 Se和 Mvd的表达量均较低，与培养 28 ～ 42 d 的菌丝体表达量相当。本
研究结果表明牛樟芝的三萜含量可能与其合成途径中相关基因的表达量、培养条件和累积时间有关。
关键词:三萜;实时荧光定量 PCＲ;鲨烯环氧酶;甲羟戊酸焦磷酸脱羧酶
中图分类号:S567． 39 文献标识码:A
Determination of Triterpenoids and Expression Analysis of
Se and Mvd Gene in Mycelium and Fruiting Body of Antrodia cinnamomea
LI Jing1，3，LIN Xiong-jie2，HE Jing-min3，CAI Can3，LIN Zhan-xi1，3 *
(1． China National Engineering Ｒesearch Center of JUNCAO Technology，Fujian Fuzhou 350002，China;2． Fruit Ｒesearch Institute of Fu-
jian Academy of Agricultural Sciences，Fujian Fuzhou 350013，China;3． School of Life Science，Fujian Agriculture and Forestry Universi-
ty，Fujian Fuzhou 350002，China)
Abstract:The relationship between triterpenoids content and squalene synthase gene (Se)and mevalonate pyrophosphate decarboxylase gene
(Mvd)expression were analyzed during different culture stages of Antrodia cinnamomea (A． cinnamomea)mycelium and fruiting bodies of
A． cinnamomea (ACFB-CK)，which grew in the hay of C． kanehirae and the other one grew in corncob (ACFB-CC)． Triterpenoids content
of mycelium and fruiting bodies were detected by Vanillin-glacial acetic acid． The expressions of Se and Mvd genes were detected using the
quantitative Ｒeal-time PCＲ． The dry weight of A． cinnamomea mycelium was increased gradually as incubation time was stable in culture for
21 days． The triterpenoids content of A． cinnamomea in mycelium was gradually increased along with the culture time as the incubation time
was less than 28 days，and it was the highest on the 28th day，which was (39． 192 ± 2． 025)mg /g． It was next to the triterpenoids content
of ACFB-CK (49． 391 ± 2． 675)mg /g． The triterpenoids content of ACFB-CC was the lowest，which was only (11． 530 ± 0． 733)mg /g．
There was significant difference (P ＜ 0． 05)between all the samples． It was showed in the qＲT-PCＲ results that the expression of Mvd and
Se genes was the highest in A． cinnamomea on the 7th day，and it showed a declining trend as it submerged culture from 7 to 42 days． The
expressions of Se and Mvd genes were the highest in mycelium of A． cinnamomea on the 7th day in submerged culture． While the triterpenoids
content in mycelium of A． cinnamomea on the 28th day in submerged culture was next to ACFB-CK． The triterpenoids content in ACFB-CC
was the lowest． The expressions of Se and Mvd genes in both ACFB-CK and ACFB-CC were low． They were almost the same as the expres-
sion of the mycelium which was in submerged culture for 28-42 days． The triterpenoids content was associated to the expression of the related
genes in synthesis pathway of triterpenoids，the culture condition
and accumulation time．
Key words:Triterpenoids;Quantitative Ｒeal-time PCＲ;Squa-
lene synthase;Mevalonate pyrophosphate decarboxylase
牛樟芝 (Antrodia cinnamomea，A． cinna-
momea)最早发现于我国台湾，是当地特有的珍稀
6022
西 南 农 业 学 报
Southwest China Journal of Agricultural Sciences
2016 年 29 卷 9 期
Vol. 29 No. 9
药用菌品种，属担子菌门(Basidiomycota)、多孔菌目
(Polyporales)、白肉迷孔菌科(Fomitopsidaceae)、薄
孔菌属(Antrodia)，野生牛樟芝子实体生长在腐烂空
心的牛樟树(Cinnamomum kanehirai)内壁［1］。牛樟
芝具有圆柱形的担孢子，菌丝呈棕黄色或至红色，子
实体呈棕红色，具有马蹄状或不规则状。研究发现
牛樟芝子实体、菌丝体和发酵液中都存在大量的三
萜类化合物，它对酒精肝损伤有保护作用［2 － 3］。三
萜类化合物(triterpenoids)是自然界中常见的一类
天然产物，在药用真菌、药用植物中大量存在［4 － 5］。
研究表明，三萜类化合物的生物合成途径主要有甲
羟戊酸途径(mevalonic pathway，MVA)和脱氧木糖
磷酸酯途径(1-deoxy-D-xylulose-5-phosphate path-
way，DXP)［6 － 7］。Lu 等［8］通过基因组和转录组测
序技术揭示了三萜类化合物生物合成的 MVA 途径
及各种酶在途径中的位置和作用，同时还发现牛樟
芝子实体和菌丝体中的三萜成分并不相同，如
antrocamphins仅存在于菌丝体中，麦角甾烷类仅存
在于子实体中，而羊毛甾醇类在子实体和菌丝体中
均存在，并且牛樟芝中三萜合成途径与灵芝三萜合
成途径相似。早期研究者已成功克隆灵芝三萜合成
途径中多种关键酶、限速酶，包括 3-羟基-3-甲基戊
二酸单酰 CoA 还原酶(3-hydroxy-3-methylglutaryl-
CoA reductase，HMGＲ)［9］，法呢酯焦磷酸合酶
(famesyl diphosphate synthase，FPS)［10］，鲨烯合酶
(squalene synthase，SQS)［11］和甲羟戊酸焦磷酸脱羧
酶(Mevalonate pyrophosphate decarboxylase，MVD)
等［12 － 13］，并证实这些酶在三萜合成过程中起到关键
的作用。牛樟芝三萜合成途径中香叶基焦磷酸合
酶，(Geranyl diphosphate synthase，GPP)和法尼基焦
磷酸合成酶(Farnesyl diphosphate synthase，FPP)是
合成三萜类化合物的重要底物［8］，其中参与 GPP 合
成的催化酶为甲羟戊酸焦磷酸脱羧酶(Mevalonate
pyrophosphate decarboxylase，MVD);而鲨烯环氧酶
(squalene synthase，SE)则是牛樟芝三萜途径中最后
一步关键的限速酶，催化鲨烯(Squalene)合成 2，3-
氧化角鲨烯(2，3-oxido squalene)，从而合成羊毛甾
醇等物质。
牛樟芝子实体在人工和自然条件下生长极缓
慢，但牛樟芝中三萜类化合物显著的药理作用让其
在国内外受到消费者青睐，而液体发酵技术是较常
见的真菌培养技术［14 － 15］，因此利用液体培养牛樟芝
菌丝体逐渐成为解决牛樟芝市场产业化发展的主要
方法之一。为进一步探讨牛樟芝在液体发酵培养菌
丝体的不同时期三萜含量的变化和菌丝体中鲨烯环
氧酶基因(Se)和甲羟戊酸焦磷酸脱羧酶基因(Mvd)
表达量的关系，通过实时荧光定量 PCＲ(Quantitative
Ｒeal-time PCＲ，qＲT-PCＲ)检测不同培养时期的牛樟
芝菌丝体和子实体中 Se和 Mvd的表达情况，为探究
牛樟芝菌丝体中三萜合成的重要机制奠定基础。
1 材料与方法
1． 1 材料
牛樟芝菌株 AC001(GenBank NO．:KM925002)、牛
樟木栽培牛樟芝子实体(36 个月)(ACFB-CK)、玉
米芯栽培牛樟芝子实体(36 个月)(ACFB-CC)均由
台湾神农真菌生物技术有限公司惠赠，保存于国家
菌草工程技术研究中心。
1． 2 主要试剂及引物
TＲIzol试剂购于 Invitrogen 公司，Ｒeverse Trans-
feration试剂盒购于 TOYOBO公司，胶回收试剂盒购
于 OMEGA 公司，SYBＲ Premix Ex TaqTM、Easy dilu-
tion，E． coli DH5α 感受态细胞和 pMDTM18-T 载体购
于 Takara 公司，高保真酶 HiFiTaq Mix 购于 Genstar
公司，齐墩果酸购于福建省药品检验所，葡萄糖、冰
醋酸、香草醛、高氯酸等均为分析纯，购自国药集团。
参照已克隆的牛樟芝 Se (GenBank No．:
KT070558)和 Mvd(GenBank No．:KＲ364808)基因的
mＲNA保守区序列设计 qＲT-PCＲ 引物，所涉及引物
均由铂尚生物技术(上海)有限公司合成(表 1)。
1． 3 方法
1． 3． 1 牛樟芝菌丝体液体培养 挑取在 PDA 培养
基上活化好的牛樟芝菌种，将其切成 0． 5 cm × 0． 5
cm大小的菌块，接种至 100 mL 灭菌后的基础培养
基(葡萄糖 25 g /L，蛋白胨 5 g /L，麦芽糖 3 g /L)中
振荡培养 14 d后作为液体菌种，按 3 %的比例将其
接种到牛樟芝液体培养基 GPM 中，28 ℃，120 r /
min，黑暗培养 7、14、21、28、35 和 42 d后备用。
1． 3． 2 牛樟芝菌丝体及子实体三萜含量测定 收
集上述培养 7、14、21、28、35 和 42 d 的新鲜菌丝体
和 ACFB-CK、ACFB-CC新鲜子实体，分别在 55 ℃条
件下烘干至恒重，参考陆震鸣的三萜提取方法［15］，
分别称取粉碎好的牛樟芝菌丝体及子实体粉末 0． 5
表 1 qＲT-PCＲ引物
Table 1 Oligonucleotide primes for qＲT-PCＲ
引物
Primers
序列
Sequence(5’-3’)
SE-F ATGGGCCGGTGTTGTTATAC
SE-Ｒ CCGAAAGAATGAGGTCCTTGAG
MVD-F ACCCTTGACCAAGATCACTTTC
MVD-Ｒ GATATCTTCCTCGACGCCATTC
70229 期 李 晶等:牛樟芝菌丝体和子实体三萜含量测定及 Se和 Mvd基因表达分析
g，按料液比 1∶ 40(w /v)的比例加入 80 %乙醇，作为
提取溶剂，70 ℃超声提取 1 h，重复提取 1 次，将 2
次的提取液合并，过滤，浓缩，离心后取上清液并定
容到 50 mL。
称取干燥至恒重的齐墩果酸标准品 10． 08 mg
于 25 mL容量瓶中，用 80 %乙醇溶解并定容，其终
浓度为 0． 4032 mg /mL。精确吸取齐墩果酸标准品
溶液 0． 00、0． 10、0． 20、0． 30、0． 40、0． 50、0． 60、0． 70、
0． 80 mL至刻度试管中，置于 50 ～ 60 ℃的水浴中，
待溶剂蒸干后分别加入 0． 3 mL 5 %香草醛 －冰醋
酸溶液和 1 mL的高氯酸，60 ℃水浴反应 20 min，冰
水冷却后加入 10 mL 冰醋酸，摇匀后，以空白为对
照，于 300 ～ 800 nm扫描确定最大吸光值，以齐墩果
酸浓度(mg /g)为横坐标，吸光值为纵坐标，绘制标
准曲线，得出回归方程。
取待测样品溶液 0． 5 mL 按上述操作方法测定
其吸光值，分别计算其三萜含量，ACFB-CK 设为对
照。
1． 3． 3 牛樟芝菌丝体及子实体 ＲNA 提取及 cDNA
合成 收集上述培养 7、14、21、28、35 和 42 d 的新
鲜菌丝，ACFB-CK 和 ACFB-CC 新鲜子实体，分别采
用 TＲIzol法提取 ＲNA［17］，经 1 %琼脂糖凝胶电泳
和 NanoDrop C2000 进行纯度和浓度测定合格后，按
Ｒeverse Transferation试剂盒使用说明进行 cDNA 的
合成，反应体系为 20 μl，每管含 ＲNA样品 500 ng。
1． 3． 4 重组质粒荧光定量 PCＲ标准曲线建立 利
用高保真 HiFiTaq Mix 从牛樟芝的 cDNA 分别扩增
Se和 Mvd基因，目的片段经 0． 8 %琼脂糖凝胶回
收，加 A 尾后进行 TA 克隆，挑取经菌液 PCＲ 验证
的单克隆扩大培养后提取重组质粒。将该质粒按
10 倍梯度稀释，共稀释 5 个浓度，再分别以稀释后
的质粒为模板，用表 1 的引物分别进行 qＲT-PCＲ扩
增，根据公式 Eq． 1 计算重组质粒 DNA中基因拷贝
数，以基因拷贝数的对数值(Log Starting quantity，
Log SQ)为横坐标(X)，以测定的 Cq 值为纵坐标
(Y)，绘制标准曲线。
目的基因拷贝数(copies /μl)= 6． 02 × 1023 ×
ＲNA浓度(ng /μl × 10 －9)/(目的 DNA 长度 × 660)
(Eq． 1)
1． 3． 5 牛樟芝中 Se 和 Mvd 基因表达分析 采用
SYBＲ 荧光染料法，分别检测牛樟芝菌丝体的不同
时期及子实体中 Se 和 Mvd 基因的表达情况。PCＲ
反应体系为 20 μl，包括 10 μl 2 × SYBＲ Premix Ex
TaqTM，1 μl cDNA 模板，上下游引物各 1 μl 和 7 μl
ddH2O。PCＲ反应条件为 95 ℃ 3 min，39 个循环 95
℃ 10 s，58． 2 /62． 5 ℃ 40 s。以 ddH2O 代替 cDNA
为模板的为空白对照，按标准曲线形成公式及 Eq． 1
计算基因拷贝数。
1． 3． 6 数据处理 每组样品设 3 个重复，采用
SPSS 20 和 Excel进行数据统计分析和作图。
2 结果与分析
2． 1 不同培养时期的牛樟芝菌丝体生物量比较
牛樟芝菌丝体在液体培养基中，28 ℃，120 r /
min，黑暗培养 4 ～ 5 d 后开始萌发，7 d 后菌丝呈淡
黄色的均匀圆球状，菌丝体干重(Dry weight，DW)仅
(0． 239 ± 0． 029)g /100 mL;培养 14 d后菌丝体呈乳
白色圆球状，菌丝体重(0． 550 ± 0． 074)g /100 mL
(DW);培养 21 d后菌丝体明显增多，培养液由淡黄
色转变成金黄色，菌丝体重(0． 840 ± 0． 059)g /100
mL(DW);培养 28 d 后，菌丝球不再继续生长，而是
在瓶壁上长出环状菌皮，培养液由金黄色逐渐变成
深黄色，菌丝体重(0． 826 ± 0． 098)g /100 mL(DW);
培养 35 d后培养液由深黄色到橘黄色，菌丝球几乎
停止生长，菌丝体重(0． 787 ± 0． 022)g /100 mL
(DW);当培养 42 d 后，菌丝体重(0． 658 ± 0． 074)
g /100 mL(DW)，培养液的颜色由淡黄色逐渐转为
棕红色(图 1 ～ 2)。
2． 2 牛樟芝子实体及不同生长时期菌丝体总三萜
含量
牛樟芝子实体及液体培养的菌丝体收集干燥后
进行总三萜的提取及含量测定。扫描结果表明，548
nm处为溶液最大吸收峰，牛樟芝菌丝体培养 7、14、
21、28、35 和 42 d后的总三萜含量分别为(15． 170 ±
1． 400)、(17． 574 ± 2． 015)、(26． 400 ± 2． 259)、(39．
192 ± 2． 025)、(28． 907 ± 0． 619)和(30． 074 ± 0．
684)mg /g。当培养时间小于 28 d时，菌丝体的总三
萜含量随着培养时间的增加而增加，而当培养时间
为 28 ～ 42 d时，菌丝体三萜含量随着培养时间的增
图 1 液体培养牛樟芝不同生长时期的菌丝形态
Fig． 1 Mycelium morphology of A． cinnamomea culture in surbmerge
medium during different stages
8022 西 南 农 业 学 报 29 卷
1.000
0.900
0.800
0.700
0.600
0.500
0.400
0.300
0.200
0.100
0生
物
量
（ g
/1
00
m
L,
D
W
）
Bi
om
as
s
of
A.
ci
nn
am
om
ea
m
yc
el
iu
m
7 14 21 28 35 42
生长时间（d)
Time
图 2 液体培养牛樟芝不同时期的菌丝体生物量(不同字
母代表 P ＜0． 05)
Fig． 2 Biomass of mycelium of A． cinnamomea in surbmerge medium
during different stages
三
萜
含
量
（ m
g/
g）
Tr
ite
rp
en
oi
ds
co
nc
en
tra
tio
n
7 d 14 d
样品名称
Samples
ACFB鄄
CK
ACFB鄄
CC
60
50
40
30
20
10
0
21 d 28 d 35 d 42 d
图 3 牛樟芝子实体及液体培养不同生长时期菌丝体的
总三萜含量(vs ACFB-CK“* ”表示差异显著，P
＜0． 05)
Fig． 3 Triterpeniods content of A． cinnamomea foodbody and myceli-
um in surbmerge medium during different stages
加而下降，但培养 42 d的牛樟芝菌丝体三萜含量略
高于 35 d。ACFB-CK和 ACFB-CC的总三萜含量的
测定结果表明，ACFB-CK 的总三萜含量显著高于
ACFB-CC 和菌丝体(P ＜ 0． 05)，达(49． 391 ± 2．
675)mg /g;而 ACFB-CC 的总三萜含量最低，仅为
(11． 530 ± 0． 733)mg /g。
2． 3 qＲT-PCＲ标准曲线制作
利用 PCＲ分别扩增 Se 和 Mvd 基因，纯化后连
到 pMDTM18-T载体上，经转化，筛选和验证后，用
Easy dilution 10 倍梯度稀释后，采用优化的实时荧
光定量 PCＲ 进行扩增，以测定的 Cq 值为纵坐标
(Y)，以样品拷贝数的对数值(Log Starting quantity)
(Log SQ)为横坐标(X)，绘制标准曲线，根据标准曲
线和 Eq． 1 计算待测样品的基因拷贝数。由图 4 可
知，2 条标准曲线均具有良好的线性关系，通过 Ex-
cel作图获得 Se 基因的标准曲线方程为 y = － 3．
4704x + 47． 231(Ｒ2 = 0． 994);Mvd 基因的标准曲线
方程为 y = － 3． 1854x + 43． 264(Ｒ2 = 0． 996)。
2． 4 qＲT-PCＲ扩增产物特异性
Se和 Mvd基因 PCＲ 扩增的产物经 1 %琼脂糖
凝胶电泳检测无引物二聚体及其它非特异性扩增条
带，溶解曲线为单峰，且峰值单一，产物特异性良好
(图 5)。
2． 5 不同生长时期牛樟芝菌丝体中 Se和 Mvd基因
表达量分析
通过 qＲT-PCＲ 测定并分析液体培养牛樟芝不
同生长阶段和三萜合成途径中 2 个重要的基因(Se
和 Mvd)的表达水平。由图 6 可知，牛樟芝体内 Se
基因表达量略高于 Mvd。液体培养 7 d 后的牛樟芝
菌丝体中 2 个基因的表达量最高，但随着培养时间
的推移，Se和 Mvd的基因表达量随着牛樟芝菌丝体
的生长发育不断下降;而 ACFB-CK 和 ACFB-CC 中
2 个基因的表达量均较低(图 6)。
3 讨论与结论
三萜类化合物结构复杂、种类多样，大部分由
30 个碳原子或 27 个碳原子组成的萜类物质，目前
所发现的品种有 200 余种［2，18］。牛樟芝的苦味主
要来自三萜类化合物，到目前牛樟芝子实体、菌丝
体、发酵液中分离到的泛醌衍生物、马来酸衍生物、
三萜类化合物、生育酚等物质 70 余种，其中三萜类
物质达30余种［19］，且被证实具有保肝［20］、抗氧
25
20
15
10
cq
20
18
16
14
12
10
8
cq
7 8 9 10 11
Log starting quantity
7 8 9 10 11
Log starting quantity
Standard curve Standard curve
Se Mvd
Se Mvd
图 4 qＲT-PCＲ标准曲线
Fig． 4 Standard curve obtained by plotting the starting copy numbers of recombinant plasmid against the cycle numbers
90229 期 李 晶等:牛樟芝菌丝体和子实体三萜含量测定及 Se和 Mvd基因表达分析
4000
3500
3000
2500
2000
1500
1000
500
0
-500
350
300
250
200
150
100
50
0
-50
350
300
250
200
150
100
50
0
-50
4000
3500
3000
2500
2000
1500
1000
500
0
-500
RF
U
温度(℃)Temperature
RF
U
-d
(R
fU
)/d
T
-d
(R
fU
)/d
T
Se Mvd
温度(℃)Temperature
60 65 70 75 80 85 90 95 60 65 70 75 80 85 90 95
图 5 实时荧光定量溶解曲线
Fig． 5 Melting curves obtained by plotting fluorescence data against the cycle numbers
6000000
5000000
4000000
3000000
2000000
1000000
0
7 d
样品名称
Samples
ACFB鄄
CK
ACFB鄄
CC
70000000
60000000
50000000
40000000
30000000
20000000
10000000
0
Mvd
Se
M
vd
基
因
拷
贝
数
(c
op
ie
s·
μ
l-1
)
M
vd
ge
ne
co
pi
es
Se
基
因
拷
贝
数
(c
op
ie
s·
μ
l-1
)
Se
ge
ne
co
pi
es
14 d 28 d 35 d 42 d21 d
图 6 不同培养时间的牛樟芝菌丝体中 Se 和 Mvd 基因
拷贝数(vs ACFB-CK“* ”和“＊＊”表示差异显
著，P ＜0． 05)
Fig． 6 Se and Mvd gene copy numbers in A． cinnamomea mycelium
under different culture time
化［21］等显著效果，因此，提高三萜类化合物的合成
效率和研究其形成的通路逐渐受到关注。
牛樟芝中三萜合成途径复杂，SE 和 MVD 是已
被证实在牛樟芝三萜合成途径中是重要的催化
酶［7］。Lu等［7］研究表明 MVD 催化甲羟戊酸-5-焦
磷酸(Mevalonate-5PP)合成 3-异戊烯基焦磷酸(Iso-
pentenyl-PP)，是合成单萜化合物的底物。Se是三萜
合成途径中的关键酶，它催化鲨烯(Squalene)合成
2，3-氧化角鲨烯(2，3-oxido squalene)，作为合成羊
毛甾醇的主要底物。研究还表明，MVD催化的反应
发生在 SE 催化反应之前，通过 MVD 催化形成的
Isopentenyl-PP 可分别经 IDI 和 FPPS 催化形成
DMAPP 和 Farnesyl-PP，只有后者可通过鲨烯合酶
(SQS)和 SE进一步催化形成羊毛甾醇类三萜化合
物，从而进一步证实 MVD 和 SE 所在酶促反应是羊
毛甾醇类三萜化合物形成途径中的关键反应，而 Se
和 Mvd 基因表达量的直接影响这两个反应的进行，
从而进一步影响羊毛甾醇类三萜化合物的含量。
通过对牛樟芝不同时期 Se 和 Mvd 两个基因的
表达量分析，结果表明培养 7 d 后的牛樟芝菌丝体
中两个基因都表现出较高的活性;而在菌丝体生长
7 ～ 42 d时主要是合成 MVD，从而大量积累 Isopen-
tenyl-PP用于生成单萜类化合物，所形成的单萜化
合物可进一步经辅酶 Q(CoQ)等催化形成安卓奎诺
尔(Antroquinonol)和泛醌等化合物;而 Isopentenyl-
PP亦可通过 SE 的催化形成羊毛甾醇，羊毛甾醇是
合成众多三萜类化合物的重要底物，并通过细胞色
素 P450 作用催化合成麦角甾烷类和羊毛甾醇类的
三萜化合物。三萜类化合物种类繁多，在植物、真菌
生长不同阶段能大量产生和积累，培养 7 d 的牛樟
芝菌丝体，细胞各方面活性较旺盛，Se 和 Mvd 基因
的表达量也相对最高;而 ACFB-CK 和 ACFB-CC 中
的细胞生理活性上不如培养 7 d 的牛樟芝菌丝体，
Se和 Mvd 表达量显著低于培养 7 d 的菌丝体，但随
着生长时间的推移，ACFB-CK中三萜含量的积累却
远高于其他时期，但随着液体培养时间的延长，牛樟
芝菌丝体中的三萜含量呈下降趋势，其原因还有待
研究。
研究还发现不同培养时间的牛樟芝菌丝体和牛
樟芝子实体中 Se和 Mvd 两个基因的表达量与其三
萜含量的变化趋势并不一致。在菌丝体生长 7 ～ 42
d时，Se 的表达量始终高于 Mvd 可进一步推定 SE
催化反应发生在牛樟芝菌丝体形成的初期;而 MVD
催化的反应产物不仅用于合成三萜类化合物，同时
还可生成 Antroquinonol 和泛醌等重要化合物质。
对灵芝中 MVD的研究发现其培养时间为 12 d 时，
灵芝甲羟戊酸焦磷酸脱羧酶(Gl-mvd)的表达量最
高，随着时间的推移也逐渐下降，它与牛樟芝菌丝体
中的研究结果相一致［13］。Han 等［22］利用 ＲNAi 技
术对人参中 PgSE1 和 PgSE2 进行沉默发现，人参三
萜皂苷含量急剧下降，但 PgSE2 含量上调，甾醇含
量增加，表明 Se对甾醇和三萜皂苷的合成起到关键
作用。
SE和 MVD作为牛樟芝三萜合成途径中 2 种重
要的酶在不同的反应阶段对三萜类化合物的合成起
着重要的作用，而 Se和 Mvd基因的表达量与 2 种酶
的活性直接相关，通过对不同培养时期的牛樟芝菌
丝体中 Se和 Mvd基因的表达量的研究，进一步明确
0122 西 南 农 业 学 报 29 卷
合成三萜类物质的影响因素，从而为促进牛樟芝菌
丝体内三萜类化合物的合成奠定良好基础。
参考文献:
［1］Chang T，Chou W． Antrodia cinnamomea sp． nov． on Cinnamomum
kanehirai in Taiwan［J］． Mycological Ｒesearch，1995，99(6):756
－ 758．
［2］Shi L S，Chao C H，Shen D Y，et al． Biologically active constituents
from the fruiting body of Taiwanofungus camphoratus［J］． Bioorganic
＆ Medicinal Chemistry，2011，19(1) :677 － 683．
［3］Kumar K J，Chu F H，Hsieh H W，et al． Antroquinonol from ethan-
olic extract of mycelium of Antrodia cinnamomea protects hepatic
cells from ethanol-induced oxidative stress through Nrf-2 activation
［J］． J Ethnopharmacol，2011，136(1) :168 － 177．
［4］Bishayee A，Ahmed S，Brankov N，et al． Triterpenoids as potential
agents for the chemoprevention and therapy of breast cancer［J］．
Front Biosci (Landmark Ed) ，2011，16:980 － 996．
［5］游 昕，熊大国，郭志斌，等．茯苓多种化学成分及药理作用的研
究进展［J］．安徽农业科学，2014，43(35):12782 － 12785．
［6］王 莉，史玲玲，张艳霞． 植物次生代谢物途径及其研究进展
［J］． 武汉植物学研究，2007(25):500 － 508．
［7］Goodwin T． Biosynthesis of carotenoids and plant triterpenes［J］． Bi-
ochemical Journal，1971，123(3) :293．
［8］Lu M Y J，Fan W L，Wang W F，et al． Genomic and transcriptomic
analyses of the medicinal fungus Antrodia cinnamomea for its metabo-
lite biosynthesis and sexual development［J］． Proceedings of the Na-
tional Academy of Sciences，2014，111(44) :E4743 － E4752．
［9］Shang C H，Zhu F，Li N，et al． Cloning and characterization of a
gene encoding HMG-CoA reductase from Ganoderma lucidum and its
functional identification in yeast［J］． Bioscience，Biotechnology，and
Biochemistry，2008，72(5) :1333 － 1339．
［10］Ding YX，Ou-Yang X，Shang C H． Molecular cloning，character-
ization，and differentialexpression of a farnesyl-diphosphate synthase
gene from the basidiomycetous fungus Ganoderma lucidum［J］． Bio-
science，Biotechnology，and Biochemistry，2008，72(6) :1571 －
1579．
［11］Zhao M W，Liang W Q，Zhang D B． Cloning and characterization
of squalene synthase (SQS)gene from Ganoderma lucidnm［J］． Jour-
nal of Microbiology and Biotechnology，2007，17(7) :1106．
［12］秦 磊． 灵芝甲羟戊酸焦磷酸脱羧酶基因的克隆及表达特性研
究［D］． 南京:南京农业大学硕士论文，2009:15 － 28．
［13］Shi L，Qin L，Xu Y，et al． Molecular cloning，characterization，
and function analysis of a mevalonate pyrophosphate decarboxylase
gene from Ganoderma lucidum［J］． Molecular biology reports，2012，
39(5):6149 － 6159．
［14］Kapich A，Prior B，Botha A，et al． Effect of lignocellulose-contai-
ning substrates on production of ligninolytic peroxidases in submerged
cultures of Phanerochaete chrysosporium ME-446［J］． Enzyme and
Microbial Technology，2004，34(2) :187 － 195．
［15］Jordaan J． Isolation and Characterization of a Novel Thermostable
and Catalytically Efficient Laccase from Peniophora sp［J］． Strain
UD4． Doctor Thesis of Philosophy of Ｒhodes University，2005．
［16］陆震鸣． 樟芝深层液态发酵及其三萜类化合物的研究［D］． 无
锡:江南大学博士学位论文，2009:70 － 87．
［17］Chrostek E，Teixeira L． Mutualism Breakdown by Amplification of
Wolbachia Genes［J］． PLoS biology，2015，13(2):e1002065．
［18］Xu Ｒ，Fazio G C，Matsuda S P． On the origins of triterpenoid skel-
etal diversity［J］． Phytochemistry，2004，65(3) :261 － 291．
［19］Lu M C，El-Shazly M，Wu T Y，et al． Ｒecent research and devel-
opment of Antrodia cinnamomea［J］． Pharmacol Ther，2013，139
(2) :124 － 156．
［20］Lin W C，Kuo S C，Lin W L，et al． Filtrate of fermented mycelia
from Antrodia camphorata reduces liver fibrosis induced by carbon
tetrachloride in rats［J］． World journal of gastroenterology:WJG，
2006，12(15) :2369 － 2374．
［21］Huang S J，Mau J L． Antioxidant properties of methanolic extracts
from Antrodia camphorata with various doses of γ-irradiation［J］．
Food chemistry，2007，105(4) :1702 － 1710．
［22］Han J Y，In J G，Kwon Y S，et al． Ｒegulation of ginsenoside and
phytosterol biosynthesis by ＲNA interferences of squalene epoxidase
gene in Panax ginseng［J］． Phytochemistry，2010，71(1) :36 －
46．
(责任编辑 李 洁)
11229 期 李 晶等:牛樟芝菌丝体和子实体三萜含量测定及 Se和 Mvd基因表达分析