全 文 ：24 1环境与职业医学 2 ( X万 年 6月 第 2卷第 3期 JE n v i, (h 叩 M闭 , unJ 岌X) 5 Vol
.
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.
3
文章编号 : 1《X拓一36 17( 2(X) 5 )03 一 14 一 中图分类号 : lR 巧 文献标识码 : A 【论著】
鲜淡菜中软骨藻酸的液相色谱紫外法研究
汪 国权 , , 柳 泳刚“ , A u lA ic 护
摘要 : 【目的〕根据美国 FD A 对软骨藻酸 ( d o m o i。 ac id) 的控制指标 ,建立一种简便的水产品中软骨藻酸液相色谱紫
外测定方法 。 〔方法〕采用含甲醇的水溶液 ,选择性地提取 鲜淡菜中软骨藻酸 , 经离心 、过滤等手段进行样品处理 , 在最
优化的条件下进行液相色谱检测 。 【结果 〕本研究方法的实际测定生物样品— 鲜淡菜 中软骨藻酸范围为 0 . 12 一 50m『 k g , 最低检测限达到 0 .田 7 n娜吨 , 并且在现有分离条件下无明显干扰物存在 ; 同时经与原分析方法比对 , 具有很好的
一 致性 。 〔结论 〕本方法建立 了生物样品鲜淡菜中软骨藻酸的液相色谱紫外测定方法 , 具有简便 、 快速的特点 , 能适合在
一般分析实验室开展此项检测工作 。
关键词 : 软骨藻酸 ; 液相 色语 ; 鲜淡菜
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软骨藻酸 ( d~
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ac id) 是一种由硅藻属中的 尸义于2“ 肠2面比义火么
所产生的氨基酸型神经类毒素 [ ’ l , 同时又是记忆缺失性贝类毒
素 (
~
is C s he ilf hs ot 泛n , 简称 ASp )的主要成分 。 当藻大量繁殖
时所产生的毒素 , 会在某些海洋生物 , 如淡菜 、蛤 、 文蛤 、扇贝 、
北美风尾鱼等中产生蓄积 , 再经海洋食物链影响相关的高等动
物 , 如海洋鸟类 、 海狮等 , 甚至人类 , 19 89 年在加拿大的 E昭 t
irP cn
e D lw耐 ls a n d 发生 了全球首起因食用受软骨藻酸污染的
淡菜( bl u e
~
l) 而导致 3 人死亡的事件 ,在此以后又发生多起
因海洋受软骨藻酸污染而导致群体性动物性死亡 [ ’ , 2」。 因此软
骨藻酸也就成为海洋环境污染监测和公共水产品安全监测的
一个重要指标 ,美国食品药品管理局 ( F DA )等就将其作为主要
监测的海洋生物毒素项 目 , 同时限定其在贝肉中的安全限量为
20 呵k g〔3 ] 。
目前对于水产品中软骨藻酸含量测定主要有生物测定法
和色谱测定法 。 生物测定法主要有小鼠生物检测方法 、细胞毒
性检测和生物受体结合放射检测技术的 I’e e ptO r ib idn gn a莹旧y 分
析方法 ; 色谱测定方法有液相色谱法 s[, 4〕、 液相色谱柱后衍生
法 :2[ 、液质联用法 5[, 6〕、 毛细管电泳法川等。 本文针对以往采用
双柱切换色谱法和衍生等复杂问题 , 探讨了采用常规液相色谱
紫外法检测淡菜中软骨藻酸含量的分析方法 。
作者简介 :
作者单位 :
汪国权 ( 196 7 一 ) , 男 ,学士 , 副主任技师 ,研究方向 : 复杂基质
下的微量有机化合物分析 , E 一二 1 : 1讯ua @刘 c . 由 . cn 。
1
.上海市疾病预防控制中心 , 上海 2X() 33;6 2 ` 美国加州卫生
与放射实验室 ; 3 .美国加州食品与药品实验室
1 材料与方法
1
.
1 试剂和仪器条件
标准品 : 软骨藻酸 ( D AC , I D , NR C 一 CN CR inst 而 et for M an ne
Bi osc i
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e s O切 a d a ) 。
色谱条件 : PH I 10 高效液相色谱系统 , 预柱 : u oB 服纽卿政 C N
125 (A 3
.
9 ~
、
20 ~ )
,分析色谱柱 : Vy面二 20 r rP 54 (4 . 6 ~ 、
25 0 nlI )
, 流动相 : A : 水 , B : 乙睛 ( AC N ) ; 每一流动相包含 230
沙哟磷酸 。 梯度洗脱 : o 而n 时 , 5 % ;B 4 而 n 时 , 5% B ; 13 而 n
时 , 2 . 8% B ; 13 . 5 而n 时 ,叨% B ; 16 . 5 im n 时 ,卯% B ; 17 im n 时 ,
5% ;B 流速 : 1 . O n刃~ , 柱温 : 30 ℃ , 检测器 : VU 抖 Z nm ;进样体
积 : or 川,运行时间 : 23 而no
1
.
2 样品处理
将 50 9鲜淡菜样品滴尽液体后 , 用粉碎机搅拌粉碎 ,粉碎
样品于 一 72 ℃低温冰箱中保存备用 。 冰冻样品解冻后 ,称取 4
g 于 50 耐 离心管中 , 加人含 50 % 甲醇的水溶液 20 耐 用均样器
于 or X( X〕 r/ 而 n 条件下匀浆提取 3 而 n 。 提取液于 3 5朋 r/ 而n 条
DOI : 10. 13213 /j . cnki . jeom. 2005. 03. 011
环境与职业医学 么刃5 年 6月 第 2 卷第 3期 J E ll访 , 。 , 二u p M司 , unJ Z以万 vol
.
2 No
·
2 15
.
件下离心分离 10 而 n 。 上清液分别依次经 0 . 45 脚 和 0 . 2 脚
过滤人自动进样瓶中 ,进样分析 。
翻O幼猫份
(一工và`剑燃邻斟众墩
2 结果
2
.
1 软骨藻酸色语保留
软骨藻酸在本文流动相条件下 , 酸电离受到抑制 。 当流动
相中有机相乙睛含量分别为 5 % 、 7 . 5% 、 10 % 、 巧% 、 加% 和 25 %
时 ,软骨藻酸的保留时间随有机相比例的增加而逐步减少 (见
图 1 ) , 尤其是大于 巧% 以后 ,软骨藻酸在色谱柱上基本无保留 ,
也难以达到分离检测的目的 ;同时当有机相浓度小于 5 % 以后 ,
软骨藻酸保留过强 , 对色谱峰的峰形和检测灵敏度有一定影
响 。 研究发现能有效控制软骨藻酸分离的流动相中乙睛含量
范围为 5% 一 巧% 区间 。 根据一般液相色谱分析要求色谱峰保
留时间大于 6 而 n 、小于 巧 而 n 的要求 ,对分离条件进行优化而
采用梯度洗脱方式 ,使软骨藻酸的保留时间控制在 12 而 n( 见图
2)
,这样既避免样品中其他成分 , 如早洗脱成分等对分析的影
响 , 同时也在一次分析过程中对样品中的强保留组分在软骨藻
酸峰后进行了洗脱 , 避免了相互可能的交叉影响 ;并且通过合
适的检测波长选择 , 进一步避免了生物样品中的其它成分 , 如
各类游离氨基酸对检测的影响 。
物组织样品中蛋白质的沉淀 ,使软骨藻酸被沉淀包裹 , 而不能
释放到提取液中 , 减低了 回收率 ; 同样发现用水提取则导致大
量水溶性杂质 , 如组织纤维 、 水溶蛋 白 、 饵料等进人水中 , 而根
本无法进一步直接测定 。 根据上述情况 , 在既能确保充分提取
软骨藻酸 , 又能减少其它杂质的引人条件下 , 选用了含 so % 甲
醇的水溶液进行提取 ,使样品提取过程仅采用离心方法 ,结合
不同孔径的过滤膜进行有效去除颗粒杂质 ,使分析过程快速 ,
干扰少 ,在样品中添加 8 n lg/ kg 条件下回收率均大于叨% 。 图 3
为实际样品和添加标准后分析的色谱图 。
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有机相比例 (O飞画 。 ph , ,% )软骨燕酸保留时间与流动相中乙助含 t 的关系
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色 i普保留时间 (m i n )
添加软骨藻酸标准后
图 3 实际样品 ( )A和添加软骨藻酸标准后 ( )B的色谱图
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色谱保留时间 (m i n )
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圈 2 软骨蕊酸的标准溶液色谱图
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2
.
2 样品提取方法
在样品提取过程中 ,选择合适的提取溶液既能提取出目标
化合物 , 又能消除一些不必要的干扰物 。 根据软骨藻酸的结构
特点 ,我们研究了不同的提取溶液 , 如纯甲醇 、水等对生物样品
— 鲜淡菜中软骨藻酸的提取影响 ,发现纯甲醇提取会导致生
2
.
3 最佳分析检测 范围
采用本分析方法测定淡菜中软骨藻酸含量 ,当其进样分析
检测的范围为 0 . 1 2 一 50 n娜吨 ,其峰面积与软骨藻酸浓度呈良
好的线性关系 ( r 二 0 .卿 ) , 回归方程为 y = 45 . x2 一 0 . 05 % , 方法
的最低检测限 ( M D公 )为 0 . 加7 11唱 / k g ( s/ N > 3 ) , 最低的报告限
(RL )为 0 .似 n塔 2吨 ,完全符合美国 F DA 的 20 n娜吨控制标准 。
回收率的测定中 ,分别在空白淡菜样品中添加 2 个浓度水
平 , 即 s n娜 k g 和 4O In 『吨 的加标回收试验 ( n 二 6) , 测得回收率
分别为 91 . 2 % 和 97 . 4% , BS D 分别为 2 . 1% 和 1 . 5% 。
·
21 6
. 环境与职业医学 2) (X5年 6月 第 2卷第 3期 JE ni v、 cOu c pM司 , Jun Z(x巧 Vol 2 No . 3
2
.
4 不 同 实验室间的方 法验证
为防止共提取物对检测的影响 , 在美国加州的州立食品药
品实验室 ( n 洲刘 an d lh 9 1遗止x 叮 a loyr , FDL ) 中 , 采用双柱切换法来
去掉样品的早洗脱物质 , 而导致单次分析时间大于 40 mY ;n 而美
国加州 的州立卫生和放射实验室 ( S田 l iiat on an 叹I R a d iiat on l目 j
B
~
h
,
S甩 J , )使用本文方法开展了样品检测 。 两实验室进行了
两种不同测定方法的比对 , 即 FD L 的双柱法和 S RL B单柱法 , 分
别测定同一种样品 , 结果表明两种方法测定结果数据基本相同
(见表 l ) 。 但相对而言 , 本文报告的单柱法具有快速 、 简单 、 成
本低的优势 。
表 1 不同实验室样品 比对测定软骨藻酸含t 《n艰 / gk )
口
r司 .l e I C ( )r n p ar t
l v尸
Re s u l t s ha twe
n di fe 哪 t lab s
样品序号 SRL B 单柱法 S RL B双柱法
SRL B测定 FD I 测定 SR L B 测定 FDL 测定
02
一
(川 )7 一0 1 4 ` 83 4 3 6 5 . 6 1 5 . 14
( )2
一
05 98
一
0 1 11
.
75 10 5 3 1 1
. 印 11 . 18
2
.
5 实际样品分析
作者在美国加州的州立卫生和放射实验室 ( 5 1孔B )对一些
美国加州海岸收集的不同时期淡菜样品 , 采用这一分析方法对
其中含有的软骨藻酸进行了测定 (见表 2 ) 。 数据表明 , 在加州
部分海岸淡菜中存在软骨藻酸的污染 , 最严重者 , 其软骨藻酸
含量达到 82 n娜k g 。 在特定时间段 , 须采取一定的监控措施来
保障水产品安全
则必须采用一些必要样品前处理手段来消除这些影响 , 如固相
离子交换萃取技术 。 采用固相离子交换萃取技术 , 主要是因为
软骨藻酸中有三个梭酸基团 , 在碱性条件下使软骨藻酸电离后
再与固相上的离子进行交换吸附 ,但在实验 中发现由于高 pH
的碱性水溶液提取 ,会导致蛋 白变异 ,产生高粘度的溶液而直
接影响了固相萃取 , 而难以实现稳定控制回收 。 本文根据 uQ 月-
ham 川所研究水产品中含有不同软骨藻酸的溶液提取方法 , 结
合软骨藻酸固有的一些化学物理性质 , 进行有选择的提取 , 既
减低了操作的复杂性 , 又实现了高回收率 。
3
.
3 过滤方式的选择
液相色谱分析中 ,使用样品直接提取时 , 为避免样品颗粒
对色谱柱造成的堵塞 ,一般采用一次过滤的方法 。 但我们在实
验中发现 , 如仅在离心后用 0 . 45 脚 过滤样品 , 并不能完全去除
一些纤维物质 ,在放置 l o h 后会产生少量的絮状沉淀 , 对样品
产生一定吸附而导致数据减低 or % 一 巧 % , 而同样采用 0 . 2
脚 过滤基本无沉淀产生及数据变化 。 但若仅单个使用 0 . 2 脚
过滤器非常容易导致大颗粒堵塞膜孔 , 只有极少量的样品溶液
能通过过滤器 ,难以达到完全分析的目的 。 因此本实验中 , 通
过使用一定浓度甲醇水溶液来选择性地提取软骨藻酸 , 同时在
离心去除较大颗粒的基础上 , 通过串联使用不同孔径的过滤膜
来过滤样品 , 达到简便操作 、稳定回收 、 延长柱寿的目的
本文针对水产品 , 如淡菜中的软骨藻酸 , 建立快速的分析
方法 , 其样品处理非常简单 ,分析干扰少 , 最低检测限远小于法
规所定 (20 m岁 k g ) , 能应用于各类一般分析实验室 , 并能完全满
足 日常对于环境监测和食品安全检测的需求
表 2 美国加州淡菜中软骨藻酸测定的部分结果
飞讨 ) l e Z 凡s己 t s o f 阴 n , e r,犯 s se l s i n C al i fo m i a , LSJ A
样品编号 软骨藻酸含量
( 口娜 kg ) 样品编号 软骨藻
酸含量
( m g / kg )
02
一
0 3 47
一
0 1 0
.
0 87 02
一
(只55一 0 1 9 . 1
02
一伪 18一 0 1 1 . 2 02 一05 15一 0 1 8 . 8
02
一
02 85
一
0 1 2 0 02
~
(叉又巧~ 0 1 11 . 0
02
一
0 36 2
一
0 1 3
,
1 02
-〔岭9 1一 0 1 16 . 0
02
~
(坤 ) 7一 0 1 4 . 4 02 一 (科74 一0 1 82 . 0
3 讨论
3
.
1 流动相酸性条件的选择
通常在软骨藻酸类中存在 6 种以上的异构体川 , 但在天然
条件下以软骨藻酸占绝大多数 , 一般分析中也以其作为检测指
标 软 骨 藻酸 为一 种 具有 三个 梭 基 的天 然 氨基 酸分 子
:(
15 H 2 , N( 飞 , M w 31 1) ,在一定酸度条件下 , 梭基电离将被抑制 ,
软骨藻酸基本能保持分子状态 . 而使其与非极性液相色谱柱填
料发生 以范德瓦力为主的吸附作用 , 其色谱峰的保留时间主要
由流动相中的有机溶剂含量决定 , 从而防止由于般基电离致二
次保留机理的出现 ,而使色谱峰拖尾 。
3
.
2 直接提取的选择
在各类水产品中测定软骨藻酸 , 由于样品基质的存在 , 而
必须对目标化合物进行有选择的溶解提取 ,避免如蛋白质 、 颗
粒 、组织纤维等对色谱柱的寿命 、分离等会产生一定的影响 , 否
参考文献 :
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M
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更玉s h by 11卿 d c ll r伽朋 t吧即卜y 杭 t h el ec t n犯 pasr ion iaz t i o n an’ l n l u lt : p l e t u 卜
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(收稿 日期 : 2以 )5一01 刁7)
(校对 : 」瑾瑜 )