全 文 ：　　＊国家自然科学基金面上资助项目 , 40476059 、30170499、30250003、39890390 号;中国科学院知识创新重要方向性项
目 ,KZCX2-211 号;中国科学院海洋研究所知识创新方向性项目(No.2002—2005)和海洋 863 项目(No.2004AA603220)。庞
国兴 ,硕士 , E-mail:guoxingpang@sina.com
1)通讯作者:胡松年 ,教授 , E-mail:husn@genomics.org.cn
收稿日期:2004-05-19 ,收修改稿日期:2004-10-14
坛紫菜(Porphyra haitanensis)丝状孢子体
EST的获取及其生物信息学分析＊
庞国兴　王广策 　胡松年 1)　曾呈奎
(中国科学院海洋研究所　青岛　266071;中国科学院研究生院　北京　100039)
(中国科学院基因组中心　北京　101300)
(中国科学院海洋研究所　青岛　266071)
提要　　采用改进的一步法提取坛紫菜丝状孢子体的总 RNA ,构建了坛紫菜丝状孢子体的
cDNA文库 ,对测序得到的 EST 进行分析并与条斑紫菜的 EST 相比较。结果表明 , cDNA 文库
共包含 2.5×105个克隆 ,测序得到 490个 EST ,其中 275个与已知功能基因同源 ,占 56.1%,
260 个EST 与已知的条斑紫菜 EST 同源 ,占53.0%。使用GO(Gene Ontology)分类方法对275个
EST 进行分类 ,其中 226个可归属于细胞组分(Cellular component)、分子功能(Molecular function)
和生物学过程(Biological process)三个大类 ,而其余 49个则为未知功能的 EST。挑选出与条斑
紫菜同源性高的 28个 EST ,这些 EST所包括的密码子数为 3221个 ,发现密码子第三位的平均
GC含量远高于第一位的平均GC含量和第二位的平均GC含量。统计坛紫菜丝状孢子体 3221
个密码子的使用频率 ,发现同义密码子第三位碱基偏好使用G或 C。
关键词　　坛紫菜 ,EST ,GC含量 ,密码子
中图分类号　　Q93
　　紫菜是红藻门红毛菜科紫菜属(Porphyra)海
藻的总称 ,全世界有一百三十余种 ,广泛分布于寒
带到亚热带海域潮间带(Yoshida et al , 1997)。紫
菜生活史属于异型世代交替 ,包括配子体世代和
孢子体世代 。它的配子体是大型叶片状组织 ,是
可食用的部分;它的孢子体是较小的丝状体 ,在自
然条件下钻入贝壳生长。单倍叶状体产生雌雄配
子 、受精形成二倍果孢子 ,果孢子进一步萌发生长
成为丝状体 ,丝状体经过近半年的生长发育产生
单倍壳孢子 ,壳孢子萌发生长成紫菜叶状体(费修
绠等 , 1999)。目前 ,我国主要栽培品种有坛紫菜
(Porphyra haitanensis)和条斑紫菜(Porphyra yezoen-
sis)两种 。
坛紫菜产于我国南方海域 ,是我国特有的栽
培品种 ,它的栽培面积及产量都大于条斑紫菜 ,但
创造的经济价值却低于条斑紫菜。因此 ,需要加
强对坛紫菜的基础研究 ,以期将来可以改善坛紫
菜的品质并提高经济价值。
表达序列 标签(Expressed Sequence Tags ,
ESTs)来自 cDNA克隆的末端序列 ,代表生物体某
种组织某一时期的表达基因。EST 数据在基因作
图 、克隆基因 、新基因识别 、蛋白质组研究等许多
方面具有重要的用途(陈红歌等 , 2003;Adams et
al , 1991 ;王广策等 , 2002a;高政权等 , 2003)。目
前 ,条斑紫菜已进行了大规模的 EST 分析 , 在
GenBank的 dbEST 库中已存在 2万多个条斑紫菜
丝状孢子体和叶状配子体的 EST(Asamizu et al ,
2003;Nikaido et al , 2000;Lee et al , 2000;杨官品
第 36 卷　第 5期 海　洋　与　湖　沼 Vol.36 , No.5
2 0 0 5 年 9 月 OCEANOLOGIA ET LIMNOLOGIA SINICA Sep., 2 0 0 5　
等 , 2002)。然而 ,坛紫菜丝状孢子体和叶状配子
体的 EST目前还未见报道 。
作者以坛紫菜丝状孢子体为材料 , 构建了
cDNA文库 ,并进行 EST 测序及分析 ,这些工作对
坛紫菜的育苗及完善紫菜 EST 数据库都具有重要
的意义。
1　材料与方法
1.1　坛紫菜丝状孢子体的培养
坛紫菜(Porphyra haitanensis)叶状体取自福建
省坛紫菜养殖场 ,从叶状体上切取一块未分化的
营养细胞组织 ,经过镜检 、刷洗 、干燥处理 、离体组
织的隔离培养等步骤 ,获得丝状体细胞(费修绠
等 , 1999)。丝状体在合适条件下可以长时间保
存于实验室中。坛紫菜丝状孢子体的培养基为海
水加富培养基 ,培养条件为 17℃,充气培养 ,光强
约为 1800lx ,光暗周期为 12h∶12h ,每星期更换一
次培养基 。
1.2　总 RNA及mRNA的分离
采用改进的一步法提取总 RNA(Chomczynski
et al , 1987)。取 1.0g坛紫菜丝状孢子体 ,液氮中
充分研磨 ,将粉末转入盛有 9ml变性裂解液中的
50ml离心管中 ,加入 0.9ml (V∶V=1∶10)3mol/L
NaAc(pH=5),混匀后再加入 9ml (V∶V=1∶1)水
饱和酚 ,充分振荡 ,然后加入 3ml氯仿 ,振荡 ,冰浴
10min后离心(4℃,12000g , 10min),转移上清到另
一离心管中 , 缓慢加入无水乙醇至终浓度为
10%—20%以沉淀多糖(Lewinsohn et al , 1994)。
用氯仿抽提后加入二倍体积无水乙醇 , -70℃沉
淀至少 2h ,同样条件下离心 ,收集沉淀 ,加入 2ml
4mol/L LiCl ,混匀后置于 4℃冰箱 , 2h 后分装到
1.5ml管中 , 离心(4℃, 12000g , 10min)后各加入
400μl DEPC水 ,用酚仿抽提二次 ,取上清到另一新
1.5ml管 ,加入 40μl 3mol/L NaAc (pH=5)和二倍
体积无水乙醇 ,混匀 , -70℃沉淀 1h ,离心(4℃,
12000g ,15min)后弃上清 ,70%乙醇洗涤一次 ,自然
晾干后用 400μl纯水溶解 ,样品冻于-70℃冰箱 。
mRNA的分离采用 Oligotex mRNA Kits(QIAGEN),
操作按试剂盒的说明书进行。
1.3　cDNA文库的构建
以mRNA为模板 ,使用 SuperscriptⅡ-RT 逆转
录酶和 polyT 引物合成 cDNA 的第一条链 , polyT
引物 5′端引入 Xho Ⅰ酶切位点 , 序列为:5′>
GAGAGAGAGAGAGAGAGAGAACTAG TCTCGAGTT-
TTTTTTTTTTTTTT<3′。使用 DNA 聚合酶 Ⅰ合成
cDNA的第二条链 ,通过 T4 DNA聚合酶补平 cDNA
末端 、T4 DNA连接酶加 EcoR Ⅰ接头 、T4 PNK将双
链 cDNA 末端磷酸化 、Xho Ⅰ酶切双链 cDNA ,回
收大于 500bp 的片段 。使用 T4 DNA 连接酶连接
pBluescript Ⅱ SK(+)载体和插入片段 ,连接产物
纯化后 ,电转化感受态细胞DH10B ,电压为1 .8kV ,
电击时间为 5ms , 加入等倍体积的 30%甘油 ,
-70℃冻贮 。
1.4　EST的获取
在含有氨苄青霉素 、X-gal 和 IPTG的平板上
筛选重组子 ,挑取白色菌落于 96 孔板中 ,过夜培
养至 OD600达到0.6—0.8 ,提取质粒后电泳检测。
测序 PCR反应使用 ET 试剂盒(Pharmacia),操作
按试剂盒说明书进行。在 PCR仪里完成测序反
应 ,程序为:95℃ 15s 接 95℃ 15s 、50℃ 15s 、60℃
1.5min ,40个循环 ,反应完成后 ,用 70%乙醇纯化
反应产物 ,晾干后每孔加毛细管电泳上样缓冲液
8μl ,在 MegaBace1000上测序。
1.5　数据处理
使用 Cross match软件去掉 EST 中的低质量
序列 、载体序列 、重复序列等 ,使用 Phrap 序列拼
接软件将测序得到的 EST 拼接成叠连群(多拷贝
EST),将拼接得到的叠连群和单拷贝 EST(未能拼
接的 EST)与 GenBank 非冗余蛋白库比对并使用
GO(Gene Ontology)分类的方法做功能注释 。
GO分类是现在较常用的 EST 分类方法 ,其大
体步骤是先找到每个 EST 的 BlastX最佳匹配的注
释 ,然后将注释词汇在网站上搜索 ,结果一般会按
照三种方式(分子功能 、生物学过程 、细胞组分)给
出分类的梯形结构 ,下一级的分类属于上一级的
大类(Ashburner et al , 2000)。除此之外 , 还进行
GC含量 、密码子使用频率等分析。
2　结果
2.1　坛紫菜总 RNA和 mRNA的提取
取2μl总 RNA样品稀释 100倍 ,用分光光度计
检测:OD260 =0.324 , OD280 =0.172 , OD260/OD280=
1.874 ,样品浓度约为 1300μg/ml ,所得总 RNA 的量
约为 500μg。mRNA 的分离采用 Oligotex mRNA
Kits(QIAGEN),操作按试剂盒的说明书进行 ,取
3μl mRNA样品 ,稀释 13 倍 ,用分光光度计检测:
OD260=0.313 , OD280 =0.269 , OD260/OD280 =1.730 ,
得到mRNA约为 8μg。
5期 庞国兴等:坛紫菜(Porphyra haitanensis)丝状孢子体 EST 的获取及其生物信息学分析 453　
2.2　cDNA文库的构建
以mRNA 为模板 ,逆转录合成 cDNA 的第一
条链 ,进而合成双链 cDNA。 cDNA 两端连接 EcoR
Ⅰ接头 ,然后胶回收大于 500bp 的片段。连接载
体后 ,电转化感受态细胞 DH10B ,得到 2.5 ×105
个克隆 。随机挑选 8个克隆 ,用菌落 PCR方法检
测其插入片段的大小在 600—800bp之间。
2.3　EST的获取和分析
测序得到 1280个坛紫菜丝状孢子体 EST ,去
除低质量的序列和载体序列后 ,长度大于 100bp
的有 714 个 EST ,使用 phrap默认参数拼接 ,拼接
出的叠连群有 91 个 ,单拷贝 EST 有 399个 ,使用
BlastX软件和 GenBank 的非冗余蛋白库比对
(e-value<1 ×10-5), 490个叠连群和单拷贝 EST
一共有 275 个比对上 ,占 56.1%, 未能比对上的
EST 占43.9%。对 275 个叠连群和单拷贝 EST 做
GO分类 。275个叠连群和单拷贝EST中有226个
可归属于细胞组分(Cellular component)、分子功能
(Molecular function)和生物学过程(Biological pro-
cesss)三个大类 ,而其余49个叠连群和单拷贝 EST
则为未知功能的 EST。226 个 EST 的 GO 分类结
果见表 1。绝大部分 EST 与生理学过程 、细胞结
构 、酶活性及细胞过程有关 ,少数与转录调节活
性 、伴侣蛋白活性 、信号传导活性及防御/免疫蛋
白活性等功能有关 。
表 1　坛紫菜丝状孢子体 490 个叠连群和单拷贝 EST的 GO分类结果
Tab.1　GO classification of 490 contigs and singlets of filamentous sporophyte of P.haitanensis
功能分类　　 分类 　　　
分子功能 转录调节活性 　17
分子功能 结合活性 113
分子功能 伴侣蛋白活性 5
分子功能 信号传导活性 22
分子功能 运输活性 41
分子功能 翻译调节活性 15
分子功能 蛋白标记活性 2
分子功能 酶调节活性 2
分子功能 抗氧化活性 7
分子功能 防御/免疫蛋白活性 4
分子功能 结构分子活性 59
分子功能 酶活性 153
分子功能 细胞粘着分子活性 1
分子功能 传动活性 1
功能分类　　 分类　　　　
分子功能 不发育 　3
生物学过程 生理学过程 214
生物学过程 细胞过程 144
生物学过程 发育 21
生物学过程 病毒生命循环 51
生物学过程 未知生物学过程 3
生物学过程 不发育 6
细胞组成 毒粒 2
细胞组成 免疫球蛋白复合体 3
细胞组成 细胞结构 216
细胞组成 细胞外结构 28
细胞组成 未定位 2
细胞组成 不发育 1
　　将 490个坛紫菜丝状孢子体的叠连群和单
拷贝 EST 与 GenBank 中的 dbEST 中 2万多条条
斑紫菜 EST 进行比对 , 同源序列有 260 个 ,占
53.0 %。
为了比较坛紫菜和条斑紫菜的密码子使用
偏好性 ,在 BlastX的结果中挑选出与条斑紫菜同
源性高的序列(score>200 or P <1 .0 ×10-15),
共有 28个 ,这些 EST 中所包括密码子数为 3221
个 ,其中编码区的 GC 含量(59.4%)比 3′非转译
区的 GC 含量(57.1%)略高 。3221 个密码子第
三位平均 GC含量是 73.1%,密码子第二位平均
GC含量是 42 .0%,密码子第一位平均 GC 含量
是 58 .5%。
统计坛紫菜丝状孢子体 3221 个密码子的密
码子使用频率表 ,结果见表 2。从表中可以看出
同义密码子第三位碱基偏好使用G 或C 。
454　 海　　洋　　与　　湖　　沼 36 卷
表 2　坛紫菜丝状孢子体 3221个密码子的使用频率
Tab.2　Usage frequency of 3221 codons of filamentous sporophyte of P.haitanensis
氨基酸 密码子 数量(个) /1000 使用频率
Gly GGG 38 11.80 0.154
Gly GGA 26 8.07 0.105
Gly GGT 62 19.25 0.251
Gly GGC 121 37.57 0.490
Glu GAG 107 33.22 0.733
Glu GAA 39 12.11 0.267
Asp GAT 56 17.39 0.320
Asp GAC 119 36.95 0.680
Val GTG 122 37.88 0.473
Val GTA 21 6.52 0.081
Val GTT 47 14.59 0.182
Val GTC 68 21.11 0.264
Ala GCG 80 24.84 0.339
Ala GCA 33 10.25 0.140
Ala GCT 32 9.93 0.136
Ala GCC 91 28.25 0.386
Arg AGG 9 2.79 0.039
Arg AGA 32 9.93 0.140
Ser AGT 6 1.86 0.030
Ser AGC 35 10.87 0.174
Lys AAG 174 54.02 0.821
Lys AAA 38 11.80 0.179
Asn AAT 20 6.21 0.194
Asn AAC 83 25.77 0.806
Met ATG 98 30.43 1.000
Ile ATA 15 4.66 0.082
Ile ATT 50 15.52 0.273
Ile ATC 118 36.63 0.645
Thr ACG 87 27.01 0.414
Thr ACA 13 4.04 0.062
Thr ACT 27 8.38 0.129
Thr ACC 83 25.77 0.395
氨基酸 密码子 数量(个) /1000 使用频率
Trp TGG 28 8.69 1.000
End TGA 0 0 0
Cys TGT 9 2.79 0.209
Cys TGC 34 10.56 0.791
End TAG 0 0 0
End TAA 0 0 0
Tyr TAT 18 5.59 0.222
Tyr TAC 63 19.56 0.778
Leu TTG 15 4.66 0.052
Leu TTA 20 6.21 0.070
Phe TTT 42 13.04 0.393
Phe TTC 65 20.18 0.607
Ser TCG 67 20.80 0.333
Ser TCA 25 7.76 0.124
Ser TCT 25 7.76 0.124
Ser TCC 43 13.35 0.214
Arg CGG 37 11.49 0.162
Arg CGA 21 6.52 0.092
Arg CGT 36 11.18 0.158
Arg CGC 93 28.87 0.408
Gln CAG 83 25.77 0.722
Gln CAA 32 9.93 0.278
His CAT 34 10.56 0.321
His CAC 72 22.35 0.679
Leu CTG 122 37.88 0.425
Leu CTA 11 3.42 0.038
Leu CTT 50 15.52 0.174
Leu CTC 69 21.42 0.240
Pro CCG 61 18.94 0.389
Pro CCA 30 9.31 0.191
Pro CCT 20 6.21 0.127
Pro CCC 46 14.28 0.293
5期 庞国兴等:坛紫菜(Porphyra haitanensis)丝状孢子体 EST 的获取及其生物信息学分析 455　
3　讨论
坛紫菜富含多糖等物质 ,而多糖的理化性质
与 RNA相似 ,在去除多糖的同时也去除了 RNA ,
造成总 RNA产量的减少 。使用普通一步法所提
取的总 RNA并不能去除多糖的污染 ,而使用试剂
盒提取坛紫菜丝状孢子体总 RNA时 ,RNA的质量
不高且产量较低 。采用改进的一步法获得了质量
较高的总 RNA ,终浓度 10%—20%的无水乙醇可
以使多糖沉淀下来而 RNA 仍保留于溶液中 ,另外
通过高浓度LiCl(4mol/L)沉淀 RNA也可以去掉部
分多糖(王广策等 ,2002b)。
坛紫菜丝状孢子体 EST 在 MegaBace1000上
测序时成功率较低 ,仅为 50%左右 ,可能原因是
坛紫菜丝状孢子体 EST 的GC含量较高 ,高GC含
量的模板在测序过程中形成较复杂的二级结构 ,
使测序酶不能通过 ,这可能是导致测序成功率低
的主要原因 。坛紫菜丝状孢子体 490个叠连群和
单拷贝 EST 平均GC 含量为 58.9 %,而条斑紫菜
叶状体3267条叠连群和单拷贝EST 的平均GC含
量为 65.2%(Nikaido et al , 2000),这说明坛紫菜
丝状孢子体中一些高 GC含量的 EST 在测序过程
中有可能没有测出来 ,导致坛紫菜丝状孢子体
EST的GC 含量低于条斑紫菜叶状体 EST 的 GC
含量 。加入甜菜碱至终浓度 0.2—2.5mol/L ,测序
成功率显著提高 。甜菜碱(Betain)化学名为甘氨
酸三甲内盐 ,可以降低双螺旋 DNA的稳定性 ,使
二级结构易打开 ,从而促进高 GC 含量基因的扩
增(白雪源等 , 2000)。
使用 BlastX软件和GenBank非冗余蛋白库比
对(e-value <1 ×10-5), 未能比对上的 EST 占
43.9%,其可能原因是在 GenBank 中红藻和紫菜
的数据较少。490个坛紫菜丝状孢子体的 EST 与
dbEST中 2万多条条斑紫菜叶状体和丝状体 EST
进行比对 ,未比对上的 EST 占 47.0%,这说明坛
紫菜和条斑紫菜表达的基因有可能存在一些
差异 。
挑选出与条斑紫菜同源性高的 28 个 EST
(score>200 or P<1.0×10-15),这些 EST 所包括密
码子数为 3221个 。3221个密码子第三位平均 GC
含量是 73.1%, 密码子第一位平均 GC 含量是
58.5%,密码子第二位平均GC含量是42.0%,与条
斑紫菜叶状体的 EST(Nikaido et al , 2000)密码子
GC 含量的比较结果见表 3。从表中看出二种紫菜
EST的密码子第三位的平均GC含量远高于第一位
的平均GC含量和第二位的平均GC含量 。
表 3　坛紫菜丝状孢子体与条斑紫菜叶
状体密码子 GC含量(%)的比较
Tab.3　Comparison of GC content(%)of codons between
filamentous sporophyte of P.haitanensis and
Leafy gametophyte of P.yezoensis
项　　目 坛紫菜丝状孢子体 条斑紫菜
EST平均 GC 含量 58.9 65.2
密码子第三位平均 GC 含量 73.1 79.4
密码子第二位平均 GC 含量 42.0 45.0
密码子第一位平均 GC 含量 58.5 62.2
表 1中GO分类后的数据多于 226个 ,这是因
为基因编码的蛋白可能具有多种不同的功能 ,所
以来源于基因的 EST 在GO分类中可以同时属于
多个类群。在已知功能的 226个 EST 中 ,有 4个
和防御/免疫蛋白活性相关 ,21个与发育相关 ,153
个与酶相关 ,通过这些 EST 可以得到一些重要功
能的基因 ,这对于将来指导坛紫菜育苗和提高坛
紫菜的品质具有重要意义。
由表 2可以看到 ,编码同一个氨基酸的同义
密码子的第三位碱基偏好使用G 或 C。这一性质
与条斑紫菜叶状体的 EST 的密码子使用频率十分
相似(Nikaido et al , 2000),类似的现象在其它的
红藻中也有发现 ,这种特性对寻找坛紫菜蛋白质
在基因组中的编码区域具有重要的指导意义。研
究结果表明:虽然坛紫菜丝状孢子体与条斑紫菜
叶状体生长环境不同 ,而且属于不同的种和不同
的世代 ,但二者 EST 的GC含量 、密码子使用便好
性非常相似。
参　考　文　献
王广策 ,孙海宝 , 曾呈奎 , 2002a.三角褐指藻磷酸甘油酸
变位酶基因可能侧翼序列的筛选 、克隆以及序列测
定.海洋与湖沼 , 33(3):259—264[ Wang G C , Sun H B ,
Zeng C K , 2002.Screening , cloning and sequencing for the
putative flanking region of gene encoding for phosphoglycer-
ate mutase of phaeodactylum tricornutum.Oceanologia et
Limnologia Sinica , 33(3):259—264]
王广策 ,曾呈奎 , 2002b.两性绵霉线粒体中存在丙酮酸激
酶;另一种丙酮酸激酶基因(pyk)的克隆及序列分析.
中国生物化学与分子生物学报.18(6):720—727
456　 海　　洋　　与　　湖　　沼 36 卷
5期 庞国兴等:坛紫菜(Porphyra haitanensis)丝状孢子体 EST 的获取及其生物信息学分析 457　
ACQUIREMENT AND ANALYSIS OF EXPRESSED SEQUENCE TAGS OF
FILAMENTOUS SPOROPHYTE OF PORPHYRA HAITANENSIS
PANG Guo-Xing , WANG Guang-Ce , HU Song-Nian ,ZENG Cheng-Kui (C.K .Tseng)
(Key Laboratory of Experimental Marine Biology , Institute of Oceanology , Chinese Academy of Sciences ,
Qingdao , 266071;Graduate School , Chinese Academy of Sciences , Beijing , 100039)
(Genome Center , Chinese Academy of Sciences , Beijing , 101300)
(Key Laboratory of Experimental Marine Biology , Institute of Oceanology , Chinese Academy of Sciences ,
Qingdao , 266071)
Abstract　　Porphyra haitanensis is only cultured in south China.The yield of P.haitanensis is much larger than
that of P .yezoensis , but the economic value of P.haitanensis is much less than that of P.yezoensis.Therefore ,
it is important and helpful to study on P.haitanensis in order to improve the quality and economic value of P.
haitanensis.
Polysaccharide is abundantly contained in P .haitanensis.Because physical and chemical characters of
polysaccharide are similar to those of RNA , it is difficult to extract RNA from P.haitanensis.In this paper , RNA
was extracted by improved one-step method.Ethanol was slowly added to the aqueous phase until the concentration
of ethanol reached 10%—20%.After centrifugation , polysaccharide was precipitated and RNA remained in the so-
lution .In addition , high concentration of LiCl solution could also remove some polysaccharide.mRNA was separat-
ed by Oligotex mRNA Kits (QIAGEN).
cDNA library of filamentous sporophyte of P .haitanensis was constructed .Recons from cDNA library were
taken out on Petri dish which contained penicillin , X-gal and IPTG.White colonies were taken to 96-well plates and
cultured over night until OD600 reached 0.6—0.8.Plasmids were extracted and examined by electrophoresis.ET
kits (Pharmacia)were used in the reactions for sequencing and the products of reactions were precipitated and puri-
fied.Dissolved with 8μl loading buffer (Pharmacia), the products were sequenced onMegaBace1000.
Low quality sequences , vector sequences and repeated sequences of ESTs were removed by Cross match and
ESTs were clustered into contigs by Phrap.91 contigs and 399 singlets were obtained.
Each sequence from the 490 contigs and singlets was subjected to similarity search against the NCBI-provided
non-redundant protein database , nr , using the BlastX program.275(56.1%)of the 490 clustered ESTs showed se-
quence similarity to genes registered in the public databases (e-value <1 ×10-5)and new sequences occupied
43.9%.275 contigs and singlets were classified via GO (Gene Ontology)method , among which 226 contigs and
singlets could be classified into three sorts:cellular component , molecular function and biological process.The
function of the other 49 contigs and singlets were unknown .
Similarity search against over 20 000 ESTs of P.yezoensis showed that 260 (53.0%)of the 490 clustered
ESTs showed sequence similarity to ESTs registered in the GenBank.28 ESTs showed sequence similarity with the
ESTs of P.yezoensis were selected and 3221 codons were contained in these ESTs.The average GC content of the
third letter in the codons (73.1%)is much higher than that of the first letter (42.0%)and the second letter
(58 .5%).Frequency of usage of 3221 codons was analyzed.Research results shows that the GC content and usage
frequency of ESTs from P.haitanensis and P.yezoensis are quite homological though they live in different environ-
ment and belong to different genus.
Key words　　Porphyra haitanensis , EST , GC content , Codons
458　 海　　洋　　与　　湖　　沼 36 卷