全 文 ：食品研究与开发2008年6月第29卷第6期
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licsfromBlackCurrantswithSulfuredWater[J].ArgricultureandFood
Chemistry,2002,50:5939-5946
收稿日期:2007-11-23
邵海艳,吉宏武*,章超桦,满思维
(广东海洋大学 食品科技学院,广东 湛江 524025)
总状蕨藻水溶性成分的提取及其
对羟自由基清除作用
摘 要:以清除Fenton反应产生的羟自由基能力为考察指标,采用单因素实验和正交优化实验研究了总状蕨藻水溶
性成分的提取工艺;以抗坏血酸(Vc)作阳性对照,测定了不同浓度水溶性成分对羟自由基(·OH)的清除作用。结果表
明,在温度60℃、料液比1:25、时间1h的条件下提取的水溶性成分清除羟自由基的能力最强,在此工艺条件下,水溶
性成分的得率为3.09%。当浓度为0.187g/L~0.75g/L时,总状蕨藻水溶性成分对羟自由基清除能力较VC强,且存在剂
量-效应关系,最大清除率为72.35%。总状蕨藻水溶性成分和VC的IC50分别为0.513g/L和0.665g/L。
关键词:总状蕨藻;水溶性成分;提取工艺;羟自由基
EXTRACTIONTECHNOLOGYOFWATER-SOLUBLECONSTITUENTSINCAULERPARACEMOSAANDTHEIR
SCAVENGINGACTIVITYONHYDROXYLRADICAL
SHAOHai-yan,JIHong-wu*,ZHANGChao-hua,MANSi-wei
(SchoolofFoodScienceandTechnology,GuangdongOceanUniversity,Zhanjiang524025,Guangdong,China)
Abstract: Withtheirscavengingactivityonhydroxylradicalasanindex,theextractiontechnologyofthewater-
solubleconstituentsinCaulerparacemosawasstudiedbyapplyingorthogonalexperimentdesign,andtheirscav-
enging activity on hydroxyl radical was also investigated by using vitamin C as a positive group. The result
showedthattheoptimumextractionparameterswereasfollows:Ratioofsolidtoliquidwas1:25,hydrolysistem-
perature60℃andthehydrolysistime1h.Underaboveconditions,theextractionratewas3.09%.Attheconcen-
trationfrom0.187g/Lto0.75g/L,scavengingcapacityofthewater-solubleconstituentsfromCaulerparacemosawas
strongerthanthatofvitaminC,havingdose-effect relationship, itshighest scavengingcapacitybeing72.35 %.
TheIC50ofthewater-solubleconstituentsandvitaminCwas0.513g/mLand0.665g/Lrespectively.
Keywords:Caulerparacemosa;water-solubleconstituents;extractiontechnology;hydroxylradical
基金项目:广东省自然科学基金团队项目[039213(2003)] ;广东省科技计划项目(2006B20401018)
作者简介:邵海艳(1976-) ,女(汉) ,助教,硕士,主要从事南海低值水产资源化学成分及其高值化应用研究。
*通讯作者:吉宏武(1962-) ,男,博士,教授,主要从事南海低值水产资源化学成分及其高值化应用研究。
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国内外研究结果表明,海藻含有硫酸多糖、超氧化
物歧化酶(SOD)、多酚和多不饱和脂肪酸等多种抗氧化
成分[1-3],对危害人体健康的自由基具有较好的清除作用。
总状蕨藻(Caulerparacemosa)是绿藻门,蕨藻属的
一种大型可食用绿藻,主要分布于热带与亚热带地区
海域中,长可达 1m以上,直立枝条,具有两列以上的
小枝,小枝末端膨胀,形成棍棒状或园球状,具有明显
的柄部。在日本,马来半岛和我国的海南、广东、台湾等
地广泛分布[4]。笔者前期对总状蕨藻化学成分及营养特
性、硫酸多糖的提取工艺及其抗肿瘤与免疫活性进行
了系统研究[5-7]。本文对总状蕨藻水溶性成分的提取工
艺与清除羟自由基能力进行了研究,以期为将其开发
成抗氧化功能保健食品提供依据。
1 材料与方法
1.1 材料与试剂
总状蕨藻(Caulerparacemosa):2005年 5月采于
湛江市徐闻县,淡水反复冲洗后,用蒸馏水洗涤 3次,
然后置于太阳下暴晒至干,50℃烘箱烘干后粉碎,干
燥保存备用;牛血清白蛋白:国药集团化学试剂有限公
司;考玛斯亮蓝G-250:天津市科密欧化学试剂开发中
心;α-脱氧核糖:Fluka公司;2-硫代巴比妥酸:国药集
团化学试剂有限公司;其余试剂均为国产分析纯。
1.2 主要设备
FA2004电子分析天平:上海精科天平;SB-2000
旋转蒸发器:上海爱朗仪器有限公司;YLE-2000数显
式电热恒温水浴锅:上海跃进医疗器械厂;722S分光
光度计:上海精密科学仪器有限公司;TDL-40B离心
机:上海安亭科学仪器厂;501A型超级数显恒温水浴
锅:上海浦东荣丰科学仪器有限公司。
1.3 方法
1.3.1 水溶性成分提取工艺路线
原料预处理(洗涤、晒干、粉碎)→热水浸提→抽
滤→真空浓缩→冷冻干燥→水溶性成分
1.3.2 总糖的测定
蒽酮-硫酸法[8]
1.3.3 蛋白质的测定
考马斯亮蓝染色法[9]。
1.3.4·OH自由基清除率的测定
Fenton法[10]。
取0.2mL浓度为10mmol/L的FeSO4-EDTA混合
液于具塞试管中,加入0.5mL浓度为10mmol/L的 α-
脱氧核糖溶液,然后加 0.6mL样液,用 pH7.4磷酸盐
缓冲溶液定容至 1.8mL,再加入 10mmol/L的 0.2mL
H2O2(现用现配)混合后置于37℃恒温水浴中反应1h,
然后加入质量分数为 2.8%的三氯乙酸 1.00mL和质
量分数为1.0%的硫代巴比妥酸1.00mL,混匀,置沸水浴
反应15min,冷却后用722S分光光度计在波长532nm
处测吸光度As。
用蒸馏水代替样液,同上操作处理,测定其对比吸
光值Ac。用蒸馏水代替样液并且不在37℃和沸水水
浴中反应,其它处理同上,测定空白吸光值Ao。
样品的自由基清除能力 SA(%)可表示为:SA=[1-
(As-Ao)/(Ac-Ao)]×100%
2 结果与分析
2.1 总状蕨藻浸提工艺单因素实验
2.1.1 温度对浸提液羟自由基清除率、多糖和蛋白质
含量的影响
料液比为 1∶10,浸提时间为 2h,在不同温度下浸
提1次,根据提取液对羟自由基清除率的大小以选择
最佳浸提温度,同时检测不同温度条件下所得提取液
的多糖和蛋白质的含量,结果如图1所示。
由图1可知,总状蕨藻水溶性成分对羟自由基的
清除能力随温度提升相应升高,在50℃～60℃间升幅
较大,60℃后上升幅度平缓,因此选取60℃为最佳浸
提温度。另外,随着温度的升高,水溶性成分多糖含量
逐渐增大,并且温度从80℃上升至90℃时,多糖含量
快速提高;蛋白质含量随温度变化改变不大。根据三者
随温度的变化曲线分析,水溶性成分清除羟自由基的
能力大小可能与其多糖含量相关,而与其蛋白质含量
关系不大。
2.1.2 料液比对浸提液羟自由基清除率、多糖和蛋白
质含量的影响
浸提温度为 60℃,浸提时间为 2h,在不同的料
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液比下浸提1次,比较不同料液比浸提所得提取液对
羟自由基清除率的影响,以选择最佳料液比,结果如
图2所示。
由图2可知,随着料液比的增大,提取液的羟自由
基清除率、多糖和蛋白质含量均相应增高,考虑到在实
际生产过程中,过大的料液比会增加设备的体积,能量
的消耗,延长生产周期,综合考虑选取料液比为1∶20。
2.1.3 时间对浸提液羟自由基清除率、多糖和蛋白质
含量的影响
浸提温度为60℃,料液比为1∶20,在不同的时间下
浸提1次,比较不同时间浸提所得提取对羟自由基清除
率的影响,以选择最佳浸提时间。结果如图3所示。
由图 3可知,随着时间的延长,提取液多糖含
量不断增高;其蛋白质含量随时间延长改变不大;
在1h～7h范围内浸提液对羟自由基的清除能力随时
间延长略有增加,在7h后随时间的延长而有所降低,
综合考虑选取提取时间为3h。
2.1.4 浸提工艺的优化
在单因素实验结果的基础上,采用 L9(33)正交设
计试验对总状蕨藻水溶性成分的工艺参数进行优化,
正交实验因素水平及实验结果与分析分别见表1、表2
和表3。
由极差分析表的结果可知,在温度、时间、料液比
三因素中,料液比对羟自由基清除率的影响最大,其次
是温度,最后是时间。方差分析表中也显示料液比为显
著影响因素。最后得出正交优化条件为A2B1C3,即浸提
温度为 60℃,浸提时间为 1h,料液比为 1∶25,在此工
艺条件下获得提取液,经真空浓缩,冷冻干燥后,得到
黄褐色并具有特殊香味的质构疏松的水溶性成分,其
因素Factors
表1 正交实验因素水平表
Table1 Theorthogonaltableoffactorsandlevels
A温度/℃
Temperature/℃
50
60
70
B时间/h
Time/h
1
3
5
C料液比
Ratioofsolidtoliqilind
1:15
1:20
1:25
水平
Levels
1
2
3
表2 正交实验设计与结果
Table2 Designandresultsoforthogonalexperiment
羟自由基清除率/%
Scavengingactivity
ofhydroxylradical/%
29.89
32.78
36.57
35.20
39.61
30.96
37.94
29.29
34.90
多糖浓度/(g/L)
Concentrationof
polysaccharide/(g/L)
0.1764
0.3152
0.3483
0.1894
0.3237
0.1936
0.2249
0.1482
0.3491
试验号
No.
1
2
3
4
5
6
7
8
9
K1
K2
K3
k1
k2
k3
R
蛋白质浓度/(g/L)
Concentrationof
protein/(g/L)
0.0201
0.0233
0.0285
0.0246
0.0269
0.0243
0.0258
0.0226
0.0253
A
1
1
1
2
2
2
3
3
3
99.24
105.77
102.13
33.08
35.26
34.04
2.18
B
1
2
3
1
2
3
1
2
3
103.03
101.68
102.43
34.34
33.89
34.14
0.45
C
1
2
3
2
3
1
3
1
2
90.14
102.88
114.12
30.05
34.29
38.04
7.99
偏差平方和(SS)
Deriationsquaresum
7.138
0.305
95.965
2.10
自由度(DF)
Degreeoffreedom
2
2
2
2
F比
Fratio
3.393
0.415
45.611
F临界值
Criticalvalve
19.000
19.000
19.000
显著性
Signficance
*
方差来源
Sourceofvariance
A
B
C
误差Eror
表3 正交实验方差分析表
Table3 Theanalysisvarianceoforthogonalexperiment
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得率为3.09%,其中多糖质量百分比为18.1%,蛋白质
质量百分比为2.34%。
2.1.5水溶性成分的浓度对羟自由基清除率的影响
测定不同浓度总状蕨藻提取物在 Fenton体系中
对羟自由基的清除作用,并以VC作为阳性对照。实验
结果见表4。
由表4可知,总状蕨藻水浸提物对羟自由基的清
除能力与浓度相关。当其浓度为1.5g/L时,羟自由基
清除率最强,达到72.35%,此后随着浓度增大,对羟自
由基的清除能力有减弱的趋势。这提示我们总状蕨藻
水溶性成分在具有抗氧化作用的同时,还可能有促氧
化的作用。这一点与一些强抗氧化剂相似,如 VA、VC、
β-胡萝卜素等都具有抗氧化和促氧化的能力,它们都
是在大剂量下供给的情况下会引起许多生命物质,如
脂质、蛋白质和DNA等的氧化损害[11-13]。与VC溶液相
比,在浓度小于0.75g/L时,总状蕨藻水溶性成分对羟
自由基的清除能力较VC强。总状蕨藻浸提物和VC的
IC50分别为0.513g/L和0.665g/L。可见,总状蕨藻水溶
性成分对羟自由基具有显著的清除效果。
3 结果
1)通过单因素实验和正交优化试验确定总状蕨
藻清除羟自由基的活性物质最佳提取条件:浸提温度
为60℃,浸提时间为1h,浸提料水比为1∶25,在此工艺
条件下,得到总状蕨藻水溶性成分得率为3.09%,其多
糖质量百分比为18.1%,蛋白质质量百分比为2.34%。
2)总状蕨藻水溶性成分清除羟自由基的实验结果
表明:总状蕨藻水溶性成分对羟自由基具有显著的清
除效果,在浓度小于0.75g/L时,总状蕨藻水溶性成分
对羟自由基的清除能力较 VC强。总状蕨藻浸提物和
VC的IC50分别为0.513g/L和0.665g/L。
3)单因素实验结果表明,总状蕨藻提取物清除自
由基能力的大小可能与总状蕨藻多糖含量有关,含量
过高或过低,对羟自由基的清除能力都会减弱,其具体
原因有待进一步研究。
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收稿日期:2007-10-18
表4 总状蕨藻水浸提物对羟自由基的清除作用
Table4 Scavengingactivityofwater-solubleconstituentsfrom
Caulerparacemosaonhydroxylradical
体系浓度/(g/L)
Concentration/(g/L)
0.1875
0.375
0.75
1.5
3
6
总状蕨藻水提取物
WatersolubeconstitueutsofCoulerparacemsa
27.48
43.38
61.59
72.35
70.86
60.26
清除率/%
Scavengingactivity/%
14.19
36.99
61.66
77.87
87.84
88.85
VC
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