全 文 ：书 ［收稿日期］ ２０１５－０９－１６；２０１６－０４－０２修回
［基金项目］ 福建省２０１１计划“福建省菌草生态产业协同创新中心”（ｋ８０ｎｄ８００２）；国家菌草工程技术研究中心组建项目（２０１１ＦＵ１２５Ｘ
１２）
［作者简介］ 李 晶（１９８５－），女，硕士，从事蔬菜学食用菌研究。Ｅ－ｍａｉｌ：１３９５９１９７１９５＠１６３．ｃｏｍ
＊通讯作者：林占熺（１９４３－），男，研究员，从事菌草栽培食药用菌技术研究。Ｅ－ｍａｉｌ：ｌｚｘｊｕｎｃａｏ＠１６３．ｃｏｍ
［文章编号］１００１－３６０１（２０１６）０４－０１６６－００８６－０６
ＰＥＧ－ＣａＣｌ２介导牛樟芝遗传转化体系的构建
李 晶１，２，林雄杰３，林冬梅１，２，鲁国东１，林占熺１，２＊
（１．国家菌草工程技术研究中心，福建 福州３５０００２；２．福建农林大学 菌草研究所，福建 福州３５０００２；
３．福建省农业科学研究院 果树研究所，福建 福州３５００１３）
［摘 要］为建立稳定的牛樟芝（Ａｎｔｒｏｄｉａ ｃｉｎｎａｍｏｍｅａ）遗传转化体系，同时筛选出适宜介导牛樟芝原
生质体转化的ＰＥＧ－ＣａＣｌ２浓度。利用潮霉素抗性、绿色荧光蛋白（Ｇｒｅｅｎ Ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｔ Ｐｒｏｔｅｉｎ，ＧＦＰ）标记和
ＰＣＲ扩增验证拟转化子。结果表明：新鲜的牛樟芝菌丝体在１０ｍｇ／ｍＬ溶壁酶溶液中，３０℃条件下酶解
４ｈ，原生质体的获得率为３．５５×１０５个／ｍＬ；菌丝体和原生质体在潮霉素Ｂ浓度分别为６０μｇ／ｍＬ和４０μｇ／
ｍＬ时不能生长，最终确定筛选拟转化子的潮霉素Ｂ浓度为６０μｇ／ｍＬ；浓度为２０％～４０％的ＰＥＧ均可介导
牛樟芝原生质体转化，且４０％的ＰＥＧ转化效率最高。
［关键词］牛樟芝；原生质体；聚乙二醇；潮霉素Ｂ；重组子
［中图分类号］Ｓ６４６．９；Ｑ９３９．５ ［文献标识码］Ａ
Ｅｓｔａｂｌｉｓｈｍｅｎｔ ｏｆ Ｇｅｎｅｔｉｃ Ｔｒａｎｓｆｏｒｍａｔｉｏｎ Ｓｙｓｔｅｍ ｏｆ Ａｎｔｒｏｄｉａ ｃｉｎｎａｍｏｍｅａ
Ｂａｓｅｄ ｏｎ ＰＥＧ－ＣａＣｌ２Ｍｅｄｉａｔｅｄ Ｍｅｔｈｏｄ
ＬＩ Ｊｉｎｇ１，２，ＬＩＮ Ｘｉｏｎｇｊｉｅ３，ＬＩＮ Ｄｏｎｇｍｅｉ １，２，ＬＵ Ｇｕｏｄｏｎｇ１，ＬＩＮ Ｚｈａｎｘｉ １，２＊
（１．Ｃｈｉｎａ Ｎａｔｉｏｎａｌ Ｊｕｎｃａｏ Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ Ｒｅｓｅａｒｃｈ Ｃｅｎｔｅｒ，Ｆｕｚｈｏｕ，Ｆｕｚｈｏｕ３５０００２；２．Ｊｕｎｃａｏ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ，Ｆｕ－
ｊｉａｎ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ ｏｆ Ａｇｒｉｃｕｌｔｕｒｅ ａｎｄ Ｆｏｒｅｓｔｒｙ，Ｆｕｚｈｏｕ，Ｆｕｚｈｏｕ３５０００２；３．Ｆｒｕｉｔ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ，Ｆｕｊｉａｎ Ａｃａｄｅｍｙ
ｏｆ Ａｇｒｉｃｕｌｔｕｒａｌ Ｓｃｉｅｎｃｅ，Ｆｕｚｈｏｕ，Ｆｕｚｈｏｕ３５００１３，Ｃｈｉｎａ）
Ａｂｓｔｒａｃｔ：Ｔｈｅ ｔｒａｎｓｆｏｒｍａｎｔｓ ｏｆ Ａｎｔｒｏｄｉａ ｃｉｎｎａｍｏｍｅａ ｍｙｃｅｌｉｕｍ ａｎｄ ｐｒｏｔｏｐｌａｓｔ ｗｅｒｅ ｖｅｒｉｆｉｅｄ ｂｙ
ｈｙｇｒｏｍｙｃｉｎ Ｂ ｒｅｓｉｓｔａｎｃｅ，ＧＦＰ ａｎｄ ＰＣＲ ｔｏ ｅｓｔａｂｌｉｓｈ ｔｈｅ ｓｔａｂｌｅ ｇｅｎｅｔｉｃ ｔｒａｎｓｆｏｒｍａｔｉｏｎ ｓｙｓｔｅｍ ｏｆ Ａｎｔｒｏｄｉａ
ｃｉｎｎａｍｏｍｅａ ａｎｄ ｓｃｒｅｅｎ ｔｈｅ ｓｕｉｔａｂｌｅ ＰＥＧ－ＣａＣｌ２ｃｏｎｃｅｎｔｒａｔｉｏｎ ｆｏｒ ｔｒａｎｓｆｏｒｍａｔｉｏｎ ｏｆ Ａｎｔｒｏｄｉａ ｃｉｎｎａｍｏｍｅａ
ｐｒｏｔｏｐｌａｓｔ．Ｒｅｓｕｌｔｓ：Ｔｈｅ ｐｒｏｔｏｐｌａｓｔ ｙｉｅｌｄ ｅｘｔｒａｃｔｅｄ ｆｒｏｍ ｆｒｅｓｈ Ａ．ｃｉｎｎａｍｏｍｅａ ｍｙｃｅｌｉｕｍ ｉｓ ３．５５×１０５／ｍＬ
ｕｎｄｅｒ ｔｈｅ ｃｏｎｄｉｔｉｏｎｓ ｏｆ １０ｍｇ／ｍＬ ｌｙｔｉｃａｓｅ，４ｈａｎｄ ３０℃．Ｔｈｅ ｍｙｃｅｌｉｕｍ ａｎｄ ｐｒｏｔｏｐｌａｓｔ ｏｆ Ａ．ｃｉｎｎａｍｏｍｅａ
ｃａｎ ｎｏｔ ｇｒｏｗ ｏｎ ４０μｇ／ｍＬ ｏｒ ６０μｇ／ｍＬ ｈｙｇｒｏｍｙｃｉｎ Ｂ ｍｅｄｉｕｍ．Ｔｈｅ ｓｕｉｔａｂｌｅ ｃｏｎｃｅｎｔｒａｔｉｏｎ ｏｆ ｈｙｇｒｏｍｙｃｉｎ
Ｂ ｔｏ ｓｃｒｅｅｎ Ａ．ｃｉｎｎａｍｏｍｅａｔｒａｎｓｆｏｒｍａｎｔｓ ｉｓ ６０μｇ／ｍＬ．２０％～４０％ ＰＥＧ ｃａｎ ｍｅｄｉａｔｅ ｔｒａｎｓｆｏｒｍａｔｉｏｎ ｏｆ
Ａ．ｃｉｎｎａｍｏｍｅａｐｒｏｔｏｐｌａｓｔ ａｎｄ ｔｈｅ ｏｐｔｉｍａｌ ＰＥＧ ｃｏｎｃｅｎｔｒａｔｉｏｎ ｉｓ ４０％．
Ｋｅｙ ｗｏｒｄｓ：Ａｎｔｒｏｄｉａ ｃｉｎｎａｍｏｍｅａ；ｐｒｏｔｏｐｌａｓｔ；ｐｏｌｙｅｔｈｙｌｅｎｅ ｇｌｙｃｏｌ；ｈｙｇｒｏｍｙｃｉｎ Ｂ；ｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔ
真菌是世界第二大类生物，主要分成微生物和
大型真菌（食、药用菌）两类［１］。牛樟芝（Ａｎｔｒｏｄｉａ
ｃｉｎｎａｍｏｍｅａ）是我国台湾特有的珍稀药用菌，属担
子菌门（Ｂａｓｉｄｉｏｍｙｃｏｔａ）、多孔菌目（Ｐｏｌｙｐｏｒａｌｅｓ）、
白肉迷孔菌科（Ｆｏｍｉｔｏｐｓｉｄａｃｅａｅ）、薄孔菌属（Ａｎｔ－
ｒｏｄｉａ），最早发现生长在腐烂的空心牛樟树（Ｃｉｎｎａ－
ｍｏｍｕｍ ｋａｎｅｈｉｒａｉ）内壁，长期以来，牛樟树被认为
是牛樟芝的唯一宿主［２－３］。牛樟芝味苦，含有大量的
三萜类、酚类和多糖类等物质［４］，对抗过敏、抗炎症、
抗氧化、抗肿瘤、保肝和提高免疫力等具有显著功
效［５－７］。
转化是将外源ＤＮＡ通过载体、媒介，以物理、
化学等方法导入受体细胞，并完整表达的过程［８］；食
药用菌属担子菌类，难以被转化。关于食药用菌转
化的研究始于２０世纪９０年代，利用电击和基因枪
等不同转化方法提高双孢蘑菇 （Ａｇａｒｉｃｕｓ ｂｉｓ－
ｐｏｒｕｓ）［９］和杨树菇（Ａｇｒｏｃｙｂｅ ａｅｇｅｒｉｔａ）［１０］原生质体
转化效率，但外源ＤＮＡ整合重组后活性较低，异源
启动子不能有效调控外源基因表达，易出现假阳性
等现象。但随着技术的不断发展，草菇［１１－１２］、香
菇［１３－１４］、灵芝［１５－１６］、平菇［１７］和猴头菇［１８］等经济菌类
通过改进转化技术均成功建立了遗传转化体系。绿
色荧光蛋白（Ｇｒｅｅｎ Ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｔ Ｐｒｏｔｅｉｎ，ＧＦＰ）最早
在水母中发现并分离，该蛋白在紫外光或蓝光激发
下发荧光，并发现其在无任何底物和辅助因子的情
况下也能在活细胞中发荧光［１９－２１］，故用于细胞和蛋
白质标记。在牛樟芝遗传转化体系中，利用ＧＦＰ标
记的载体转入牛樟芝原生质体中，能快速筛选并确
定转化子，具有高效、稳定等特征。
随着牛樟芝的分类和生物学特性研究的不断深
贵州农业科学 ２０１６，４４（４）：８６～９１
Ｇｕｉｚｈｏｕ Ａｇｒｉｃｕｌｔｕｒａｌ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ
入，陆续开展了其药理学、质量控制、栽培条件和分
子生物学等方面的研究［２２］，而牛樟芝分子生物学的
前提条件是必需建立稳定的遗传转化体系。目前，
李刚［２３］建立灵芝原生质体转化体系，并连续培养５
代以上仍可以稳定表达潮霉素抗性；张新涛等［２４］建
立了我国传统药用菌灵芝的遗传转化体系，但国内
外对牛樟芝遗传转化体系的研究鲜见报道，笔者利
用ＰＥＧ－ＣａＣｌ２介导建立的牛樟芝遗传转化体系，并
通过ＧＦＰ标记对其进行验证，为深入开展分子生物
学研究奠定基础。
１ 材料与方法
１．１ 材料
１．１．１ 供试菌株及质粒 台湾牛樟芝菌株 ＡＣ
００１（Ｇｅｎｂａｎｋ Ａｃｃｅｓｓｉｏｎ ＮＯ．：ＫＭ９２５００２），由台湾
神农真菌生物技术有限公司惠赠，保存于福建农林
大学菌草研究所；ｐＣＸ６２为含抗潮霉素抗性标记质
粒载体，ｐＣＴ７４为含抗潮霉素抗性和 ＧＦＰ标记质
粒载体［２５］均由福建农林大学功能基因组学研究中
心提供。
１．１．２ 培养基及常用溶液 牛樟芝液体培养基：
葡萄糖２５ｇ，蛋白胨５ｇ，麦芽糖３ｇ，酵母提取物
３ｇ，ＫＨ２ＰＯ４１ｇ，ＭｇＳＯ４·７Ｈ２Ｏ １ｇ，维生素Ｂ１
１ｇ，蒸馏水定容至１Ｌ，ｐＨ ５．５；牛樟芝固体培养
基：葡萄糖２５ｇ，蛋白胨５ｇ，麦芽糖３ｇ，酵母提取物
３ｇ，ＫＨ２ＰＯ４１ｇ，ＭｇＳＯ４·７Ｈ２Ｏ １ｇ，维生素Ｂ１
１ｇ，琼脂２０～２５ｇ，蒸馏水定容至１Ｌ，ｐＨ ５．５；马
铃薯培养基（ＰＤＡ）：马铃薯２００ｇ（去皮切块加水煮
３０ｍｉｎ，用纱布过滤取滤液），葡萄糖２０ｇ，琼脂
２０ｇ，蒸馏水定容至１Ｌ；ＴＢ３再生培养基：酸水解
酪蛋白３ｇ，酵母提取物３ｇ，蔗糖２００ｇ，蒸馏水定容
到１Ｌ，配制固体培养基时加入琼脂粉 １０ｇ。
０．６ｍｏｌ／Ｌ甘露醇：１０９．３０２ｇ甘露醇，溶于适量去
离子水中，定容到１Ｌ；ＭＴＣ缓冲液：１０ｍｍｏｌ／Ｌ
Ｔｒｉｓ－ＨＣｌ（ｐＨ ７．５），１０ｍｍｏｌ／Ｌ ＣａＣｌ２，０．６ｍｏｌ／Ｌ
甘露醇；ＰＥＧ 溶液：取适量 ＰＥＧ４０００，溶于适量
ｄｄ Ｈ２Ｏ，定容到１００ｍＬ，现配现用；ＰＥＧ－ＣａＣｌ２溶
液：适宜比例 ＰＥＧ 溶液，１０ ｍｍｏｌ／Ｌ Ｔｒｉｓ－ＨＣｌ，
５０ｍｍｏｌ／Ｌ ＣａＣｌ２，现配现用；溶壁酶溶液（北京索
莱宝生物科技有限公司）：适量溶壁酶用０．６ｍｏｌ／Ｌ
甘露醇配置，现配现用；以上溶液均过滤除菌。
１．２ 原生质体的制备与再生
１．２．１ 原生质体的制备 在ＰＤＡ上活化后的牛
樟芝菌种接种至牛樟芝液体培养基中，２８℃，１２０ｒ／
ｍｉｎ，黑暗培养１４ｄ后在无菌条件下过滤收集菌丝
体，研磨成匀浆状，取１ｍＬ装入５０ｍＬ离心管中，用
无菌水洗涤后７０００ｒ／ｍｉｎ，离心１０ｍｉｎ，弃上清；其
沉淀用０．６ｍｏｌ／Ｌ甘露醇洗涤，７０００ｒ／ｍｉｎ，离心
１０ｍｉｎ，弃上清，１次重复；沉淀重悬于１０ｍＬ（浓度
为１０ ｍｇ／ｍＬ）的溶壁酶溶液中［２６－２７］，于 ３０℃，
８０ｒ／ｍｉｎ酶解，２ｈ后用血球计数板对酶解程度进行
镜检，直至大多数酶解为原生质体，确定最佳酶解时
间。
将酶解产物过滤，除去未被酶解的菌丝体，滤液
于７０００ｒ／ｍｉｎ离心机，离心２０ｍｉｎ，弃上清液，沉淀
用０．６ｍｏｌ／Ｌ甘露醇和 ＭＴＣ缓冲液各洗涤１次后
离心，弃上清；沉淀重悬于２ｍＬ含７％二甲基亚砜
的０．６ｍｏｌ／Ｌ甘露醇中，每管２００μＬ分装后置于
－８０℃超低温冰箱保存备用。
１．２．２ 原生质体的再生 取上述制备的新鲜原生
质悬浮液１００μＬ，涂布在ＴＢ３再生培养基平板上，
于２８℃恒温培养箱中黑暗倒置培养，１４ｄ后按公式
计算再生率：再生率＝再生菌落总数／涂板原生质体
总数×１００％。
１．３ 牛樟芝菌丝体及原生质体对潮霉素Ｂ的敏感
性测定
１．３．１ 牛樟芝菌丝体 将牛樟芝菌株分别接种到
含潮霉素Ｂ浓度为２０μｇ／ｍＬ、４０μｇ／ｍＬ、６０μｇ／
ｍＬ、８０μｇ／ｍＬ、１００μｇ／ｍＬ和１２０μｇ／ｍＬ的固体
培养基中央，每个浓度３次重复，以不加潮霉素Ｂ
的平板作为对照；接种后置于２８℃恒温培养箱黑暗
培养１４ｄ，观察并记录生长情况，筛选最适合的潮霉
素浓度。
１．３．２ 牛樟芝原生质体 牛樟芝原生质体悬浮液
１００μＬ分别涂布于含潮霉素Ｂ浓度为２０μｇ／ｍＬ、
４０μｇ／ｍＬ、６０μｇ／ｍＬ、８０μｇ／ｍＬ、１００μｇ／ｍＬ 和
１２０μｇ／ｍＬ固体培养基中，每个浓度３次重复，以不
加潮霉素Ｂ的平板作为对照；接种后在２８℃、黑暗
条件下培养１４ｄ，观察并记录生长情况，筛选最适合
的潮霉素Ｂ浓度。
１．４ 质粒提取
质粒提取方法按照 ＯＭＥＡＧ质粒提取试剂盒
说明操作。
１．５ ＰＥＧ－ＣａＣｌ２介导的原生质体转化
参照李刚［１６］、刘莉［１８］的方法，略加改进。取２
管原生质体（２００μＬ／管），向其中一管加入５０μｇ质
粒，另外一管加入等体积的０．６ｍｏｌ／Ｌ甘露醇作对
照，分别加入１００μＬ ０．６ｍｏｌ／Ｌ甘露醇，轻微混匀
后置冰上预冷５ｍｉｎ；再逐滴加入１ｍＬ ２０％、３０％、
４０％、５０％和６０％的ＰＥＧ－ＣａＣｌ２溶液，轻微混匀后
于冰上放置６０ｍｉｎ，逐滴加入０．５ｍＬ ＰＥＧ－ＣａＣｌ２
溶液，室温放置３０ｍｉｎ，再加入１ｍＬ ＭＴＣ缓冲液
·７８·
李 晶 等 ＰＥＧ－ＣａＣｌ２介导牛樟芝遗传转化体系的构建
ＬＩ Ｊｉｎｇ ｅｔ ａｌ Ｅｓｔａｂｌｉｓｈｍｅｎｔ ｏｆ Ｇｅｎｅｔｉｃ Ｔｒａｎｓｆｏｒｍａｔｉｏｎ Ｓｙｓｔｅｍ ｏｆ Ａｎｔｒｏｄｉａ ｃｉｎｎａｍｏｍｅａ Ｂａｓｅｄ ｏｎ ＰＥＧ－ＣａＣｌ２Ｍｅｄｉａｔｅｄ Ｍｅｔｈｏｄ
和５ｍＬ牛樟芝液体培养基，２８℃，８５ｒ／ｍｉｎ振荡培
养４８ｈ；取１ｍＬ均匀涂布在含潮霉素Ｂ浓度为
６０μｇ／ｍＬ的牛樟芝固体培养基平板中，２８℃恒温箱
中黑暗培养１４ｄ。
１．６ 牛樟芝转化子筛选及鉴定
分别进行ｐＣＸ６２和ｐＣＴ７４质粒转化。挑取在
含潮霉素Ｂ浓度为６０μｇ／ｍＬ的牛樟芝固体培养基
上正常生长的转化子视为拟定转化子，转接至含潮
霉素Ｂ浓度为６０μｇ／ｍＬ的牛樟芝固体培养基上继
续培养５代，挑选继续生长的拟定转化子进行液体
扩大 培 养 并 收 集 菌 丝 体，采 用 ＣＴＡＢ 法 提 取
ｇＤＮＡ［２８］，进行潮霉素基因（ｈｐｈ）ＰＣＲ扩增。引物
序列分别为５′－ＧＣＣＣＴＴＣＣＴＣＣＣＴＴＴＡＴＴ－３′和
５′－ＴＣＣＡＴＣＡＣＡＧＴＴＴＧＣＣＡＧＴ－３′，引物由铂尚
生物技术（上海）有限公司合成。ＰＣＲ反应体系为
２５μＬ，扩增程序为９５℃预变性３ｍｉｎ；９４℃变性
３０ｓ，５８．７℃退火３０ｓ，７２℃延伸４０ｓ，３２个循环；
７２℃延伸７ｍｉｎ，ＰＣＲ产物用１％琼脂糖凝胶电泳检
测。
１．７ ＰＥＧ－ＣａＣｌ２介导的转化体系验证
将含ＧＦＰ的外源质粒ｐＣＴ７４导入牛樟芝原生
质体后筛选拟转化子，并通过荧光显微镜观察其菌
丝体形态。
２ 结果与分析
２．１ 原生质体的制备及再生
不同酶解时间对原生质体得率研究表明，酶解
２ｈ和３ｈ时，原生质体的获得量分别为２．０３×１０５个／ｍＬ
A B
图１ 牛樟芝原生质体（Ａ）及其在ＴＢ３培养基上再生情
况（Ｂ）
Ｆｉｇ．１ Ｒｅｇｅｎｅｒａｔｉｏｎ ｏｆ Ａ．ｃｉｎｎａｍｏｍｅａ ｐｒｏｔｏｐｌａｓｔｓ ｏｎ ＴＢ３
ｍｅｄｉｕｍ
和３．１３×１０５个／ｍＬ；酶解４ｈ时，原生质体的获得
量最大，达３．５５×１０５个／ｍＬ；继续增加酶解时间至
５ｈ，原生质体获得量降至３．０８×１０５个／ｍＬ，可能是
由于溶壁酶对已生成的原生质体产生毒害作用，影
响原生质体的数量及活性，最终影响原生质体再生
及转化效率。所制备原生质体大小适中，无变
形（图１Ａ），在 ＴＢ３ 再 生 培 养 基 上 再 生 率 达
４．５９％（图１Ｂ）。
２．２ 牛樟芝菌丝体对潮霉素Ｂ的敏感性
由图２可知，牛樟芝菌株在含不同浓度潮霉素
Ｂ的牛樟芝固体培养基上生长６～８ｄ后呈明显不
耐受性，牛樟芝菌丝体在潮霉素Ｂ浓度为２０μｇ／
ｍＬ的培养基上有少量继续生长；当潮霉素Ｂ浓度
达到４０μｇ／ｍＬ时仅有极少量菌丝可萌发，但第７
天后不再生长；当潮霉素Ｂ浓度＞６０μｇ／ｍＬ时，牛
樟芝菌丝体完全不生长。
A B C D
E F G
注：Ａ，空白对照；Ｂ，潮霉素Ｂ浓度２０μｇ／ｍＬ；Ｃ，潮霉素Ｂ浓度４０μｇ／ｍＬ；Ｄ，潮霉素Ｂ浓度６０μｇ／ｍＬ；Ｅ，潮霉素Ｂ浓度８０μｇ／ｍＬ；Ｆ，潮
霉素Ｂ浓度１００μｇ／ｍＬ；Ｇ，潮霉素Ｂ浓度１２０μｇ／ｍＬ（下同）。
Ｎｏｔｅ：Ａ，ＣＫ；Ｂ，２０μｇ／ｍＬｈｙｇｒｏｍｙｃｉｎ Ｂ；Ｃ，４０μｇ／ｍＬ ｈｙｇｒｏｍｙｃｉｎ Ｂ；Ｄ，６０μｇ／ｍＬ ｈｙｇｒｏｍｙｃｉｎ Ｂ；Ｅ，８０μｇ／ｍＬ ｈｙｇｒｏｍｙｃｉｎ Ｂ；Ｆ，
１００μｇ／ｍＬ ｈｙｇｒｏｍｙｃｉｎ Ｂ；Ｇ，１２０μｇ／ｍＬ ｈｙｇｒｏｍｙｃｉｎ Ｂ．Ｔｈｅ ｓａｍｅ ｂｅｌｏｗ．
图２ 不同浓度潮霉素Ｂ处理牛樟芝菌丝的生长情况
Ｆｉｇ．２ Ｇｒｏｗｔｈ ｏｆ Ａ．ｃｉｎｎａｍｏｍｅａ ｍｙｃｅｌｉｕｍ ｔｒｅａｔｅｄ ｗｉｔｈ ｄｉｆｆｅｒｅｎｔ ｃｏｎｃｅｎｔｒａｔｉｏｎ ｏｆ ｈｙｇｒｏｍｙｃｉｎ Ｂ
·８８·
贵 州 农 业 科 学
Ｇｕｉｚｈｏｕ Ａｇｒｉｃｕｌｔｕｒａｌ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ
２．３ 牛樟芝原生质体对潮霉素Ｂ的敏感性
由图３可见，牛樟芝原生质体再生培养１４ｄ
后，含不同浓度潮霉素Ｂ的牛樟芝固体培养基呈明
显不耐受性，当固体培养基中潮霉素 Ｂ 浓度为
２０μｇ／ｍＬ时牛樟芝原生质体的生长明显受到抑制，
仅有少量能生长；当潮霉素Ｂ浓度为４０μｇ／ｍＬ时
牛樟芝原生质体几乎不能生长；当潮霉素Ｂ浓度＞
６０μｇ／ｍＬ 时，牛 樟 芝 原 生 质 体 完 全 不 能 生
长（图３）。因此，将潮霉素Ｂ浓度为６０μｇ／ｍＬ作
为牛樟芝转化子抗性筛选浓度。
A B C D
E F G
图３ 不同浓度潮霉素Ｂ处理牛樟芝原生质体的生长情况
Ｆｉｇ．３ Ｇｒｏｗｔｈ ｏｆ Ａ．ｃｉｎｎａｍｏｍｅａ ｐｒｏｔｏｐｌａｓｔ ｔｒｅａｔｅｄ ｗｉｔｈ ｄｉｆｆｅｒｅｎｔ ｃｏｎｃｅｎｔｒａｔｉｏｎ ｏｆ ｈｙｇｒｏｍｙｃｉｎ Ｂ
２．４ 牛樟芝转化子筛选及鉴定
由图４表明，用２０％～４０％ＰＥＧ－ＣａＣｌ２溶液介
导原生质体转化均能获得拟转化子，但转化效率差
异较大，其中以４０％ＰＥＧ－ＣａＣｌ２介导的牛樟芝原生
质体转化效率最高。由图５可见，培养５代的牛樟
芝ｐＣＸ６２和ｐＣＴ７４拟转化子中ｈｐｈ片段扩增筛选
得到的１～５号拟转化子均可扩增大小约为５６０ｂｐ
的ｈｐｈ片段，６号为原始菌株，能初步确定该转化体
系的成功建立。
A B C
D E F
注：Ａ，ＰＥＧ浓度为０；Ｂ，ＰＥＧ浓度为２０％；Ｃ，ＰＥＧ浓度为３０％；Ｄ，ＰＥＧ浓度为４０％；Ｅ，ＰＥＧ浓度为５０％；Ｆ，ＰＥＧ浓度为６０％。
Ｎｏｔｅ：Ａ，ＣＫ；Ｂ，２０％ＰＥＧ；Ｃ，３０％ＰＥＧ；Ｄ，４０％ＰＥＧ；Ｅ，５０％ＰＥＧ；Ｆ，６０％ＰＥＧ．
图４ 不同浓度ＰＥＧ－ＣａＣｌ２溶液处理牛樟芝原生质体的转化效率
Ｆｉｇ．４ Ｔｒａｎｓｆｏｒｍａｔｉｏｎ ｅｆｆｉｃｉｅｎｃｙ ｏｆ Ａ．ｃｉｎｎａｍｏｍｅａ ｐｒｏｔｏｐｌａｓｔ ｔｒｅａｔｅｄ ｗｉｔｈ ｄｉｆｆｅｒｅｎｔ ｃｏｎｃｅｎｔｒａｔｉｏｎ ｏｆ ＰＥＧ－ＣａＣｌ２ｓｏｌｕｔｉｏｎ
Ⅳ Ⅳ
2 000 bp
750 bp
500 bp
1 000 bp
750 bp
500 bp
注：样品１～５号为转化菌株，６号为原始菌株。
Ｎｏｔｅ：１～５，ｔｒａｎｓｆｏｒｍａｎｔ ｓｔａｉｎｓ；６，ｏｒｉｇｉｎａｌ ｓｔａｉｎ．
图５ 牛樟芝ｐＣＸ６２（左）和ｐＣＴ７４（右）拟转化子ｈｐｈ片段扩增
Ｆｉｇ．５ ｈｐｈ ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ ｏｆ ｐＣＸ６２（ｌｅｆｔ）ａｎｄ ｐＣＴ７４（ｒｉｇｈｔ）ｔｒａｎｓｆｏｒｍａｎｔ ｏｆ Ａｎｔｒｏｄｉａ ｃｉｎｎａｍｏｍｅａ
·９８·
李 晶 等 ＰＥＧ－ＣａＣｌ２介导牛樟芝遗传转化体系的构建
ＬＩ Ｊｉｎｇ ｅｔ ａｌ Ｅｓｔａｂｌｉｓｈｍｅｎｔ ｏｆ Ｇｅｎｅｔｉｃ Ｔｒａｎｓｆｏｒｍａｔｉｏｎ Ｓｙｓｔｅｍ ｏｆ Ａｎｔｒｏｄｉａ ｃｉｎｎａｍｏｍｅａ Ｂａｓｅｄ ｏｎ ＰＥＧ－ＣａＣｌ２Ｍｅｄｉａｔｅｄ Ｍｅｔｈｏｄ
A B C
图６ ｐＴＣ７４转化子菌丝体在普通（Ａ）和荧光显微镜（Ｂ）及野生菌株（Ｃ）在荧光显微镜下菌丝形态
Ｆｉｇ．６ Ｍｙｃｅｌｉｕｍ ｏｆ ｐＣＴ７４ｔｒａｎｓｆｏｒｍａｎｔ ｕｎｄｅｒ ｃｏｍｍｏｎ ｍｉｃｒｏｓｃｏｐｅ（Ａ）ａｎｄ ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｃｅ ｍｉｃｒｏｓｃｏｐｅ（Ｂ）ａｎｄ
ｈｙｐｈａｌ ｍｏｒｐｈｏｌｏｇｙ ｏｆ ｗｉｌｄ ｓｔｒａｉｎ（ｃ）ｕｎｄｅｒ ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｃｅ ｍｉｃｒｏｓｃｏｐｅ
２．５ 牛樟芝遗传转化体系的验证
由图６可见，在荧光显微镜下ｐＣＴ７７４拟转化
子的菌丝体中可观察到大量的绿色荧光，而野生型
牛樟芝菌丝体则无该现象，从而进一步证明ＰＥＧ－
ＣａＣｌ２可成功介导牛樟芝原生质体转化。
３ 结论与讨论
与前人研究结果［２３－２４］相比，本研究利用ＧＦＰ对
所转化体系进行验证，在荧光显微镜下能快速、直接
观察到转化情况，缩短转化培养及验证时间，提高了
验证效率。张新涛等［２４］的结果中灵芝原生质体再
生率仅１％，李刚等［２３］的研究结果也表明，灵芝再生
率也与酶解时间、培养基等有关，本研究牛樟芝原生
质体再生率４．５９％，而原生质体再生率低也能直接
影响转化效率。牛樟芝原生质体再生率和转化效率
低可能是因为高等真菌的遗传规律和菌龄限制［２４］，
但也可能是以下原因：
１）酶解条件的选择。有效去除细胞壁是成功
制备原生质的关键。真菌细胞壁主要含有大量的多
糖类物质，选择适宜的溶壁酶至关重要。刘莉等［１８］
对猴头菇遗传转化体系的研究中发现，１％溶壁酶、
１％纤维素酶和１％蜗牛酶对原生质体的制备效果
最佳（３×１０６个／ｍＬ），其次为１％溶壁酶（２．８×
１０６个／ｍＬ）。本研究中用１０ｍｇ／ｍＬ的溶壁酶制备
牛樟芝原生质体可达３．１３×１０５个／ｍＬ，说明不同
溶壁酶之间对原生质体的形成可能存在差异。
研究中还发现酶解时间能直接影响原生质的数
量，酶解２～４ｈ，原生质体数量不断升高，而酶解５ｈ
后，原生质体数量明显下降，是由于酶解时间过长，
溶壁酶对原生质体膜进行酶解，导致原生质体破裂，
从而使再生能力下降，这与李刚等［１６］研究结果一
致。
２）ＰＥＧ介导浓度的选择。本研究结果表明，
不同浓度的ＰＥＧ－ＣａＣｌ２溶液对转化获得率影响较
大。当ＰＥＧ－ＣａＣｌ２溶液浓度为２０％～４０％时，均能
获得不同数量的转化子，而当浓度达５０％以上时，
均无法获得相应的转化子，在ＰＥＧ处理过程中，由
于细胞质浓度不均匀或细胞体积过小容易使原生质
体破碎，因此转化过程中，原生质体的质量、活性以
及细胞渗透压环境的稳定是转化成功的关键。过高
的ＰＥＧ浓度会影响细胞稳定性，对细胞产生一定的
毒害作用，本研究当ＰＥＧ浓度＞５０％时，未获得相
应的转化子，可能是因为浓度过高使原生质体破裂
从而无法再形成转化子。
利用ＧＦＰ验证牛樟芝遗传转化体系具有直观、
快速、稳定等特点，提高转化验证效率和准确性，可
在各领域使用。牛樟芝子实体和菌丝体都含量大量
三萜类和多糖类，其药理功能越来越得到认可，建立
牛樟芝遗传转化体系，利用分子生物学技术拓展牛
樟芝的研究和利用空间，建立稳定、快速的牛樟芝遗
传转化体系，通过导入外源基因，提升牛樟芝工业生
产价值，从而为牛樟芝的市场化推广应用奠定基础。
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贵 州 农 业 科 学
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ｉｎ ｂａｒｌｅｙ：ｍｅｎｄｅｌｉａｎ ｉｎｈｅｒｉｔａｎｃｅ，ｃｈｒｏｍｏｓｏｍａｌ ｌｏｃａ－
ｔｉｏｎ，ａｎｄ ｐｏｐｕｌａｔｉｏｎ ｄｙｎａｍｉｃｓ［Ｊ］．Ｐｒｏｃｅｅｄｉｎｇｓ ｏｆ ｔｈｅ
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（责任编辑：刘忠丽）
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李 晶 等 ＰＥＧ－ＣａＣｌ２介导牛樟芝遗传转化体系的构建
ＬＩ Ｊｉｎｇ ｅｔ ａｌ Ｅｓｔａｂｌｉｓｈｍｅｎｔ ｏｆ Ｇｅｎｅｔｉｃ Ｔｒａｎｓｆｏｒｍａｔｉｏｎ Ｓｙｓｔｅｍ ｏｆ Ａｎｔｒｏｄｉａ ｃｉｎｎａｍｏｍｅａ Ｂａｓｅｄ ｏｎ ＰＥＧ－ＣａＣｌ２Ｍｅｄｉａｔｅｄ Ｍｅｔｈｏｄ