全 文 ：文章编号:1001 － 4829(2014)03 － 1237 － 06
收稿日期:2013 － 12 － 23
基金项目:中国博士后科学基金面上项目(2012M511099) ;中国
博士后科学基金特别资助项目(2013T60451) ;国家自然科学基
金青年基金项目(31300580)
作者简介:何 叶(1982 －) ，女，硕士，助理研究员，研究方向为
园林植物与观赏园艺，* 为通讯作者。
百子莲愈伤组织诱导体系的优化
何 叶1，2，任 丽1，孙海龙3，张 洁1，邹梦雯1，张 荻1*
(1．上海交通大学农业与生物学院，上海 200240;2．重庆市农业科学院蔬菜花卉研究所，重庆 401329;3．黑龙江林业职业技术
学院生态工程学院，黑龙江 牡丹江 157011 )
摘 要:以不同器官为外植体，以不同浓度的外源生长素与细胞分裂素建立正交筛选实验，对诱导百子莲的愈伤组织进行了研究，
结果表明:在百子莲愈伤组织诱导试验中，最佳外植体为花梗组织，其次为花丝组织;PIC 对花梗外植体愈伤组织诱导具有明显的
调控作用，诱导愈伤组织的最优配方是 MS +2． 0 mg /L PIC + 30 g /L蔗糖;以百子莲花丝为外植体诱导愈伤组织的最优配方是 MS
+2． 0 mg /L PIC + 1． 0 mg /L 6-BA + 30 g /L蔗糖。
关键词:愈伤;毒莠定;花梗;花丝;百子莲
中图分类号:S511． 21 文献标识码:A
Optimization of Callus Tissue Inducement System of Agapanthus praecox
ssp． orientalis (Leighton)Leighton
HE Ye1，2，ＲEN Li1，SUN Hai-long3，ZHANG Jie1，ZOU Meng-wen1，ZHANG Di1*
(1． School of Agriculture and Biology，Shanghai Jiao Tong University，Shanghai 200240，China;2． Vegetable and Flower Ｒesearch Institute
of Chongqing Academy of Agricultural Sciences(CAAS) ，Chongqing 401329，China;3． Heilongjiang Forestry Vocation Technical College，
Heilongjiang Mudanjiang 157011，China)
Abstract:This research investigates the callus of Agapanthus praecox ssp． Orientalis by taking different organs as explant and utilizing differ-
ent concentrations of exogenous auxin and cytokinins to establish the orthogonal screening experiment． The experimental result indicates that
the optimal explant is pedicel tissue，and filaments organization comes second in the experiment of callus tissue inducement of agapanthus;
PIC plays an apparent regulating role in the callus induction． The optimum formula for inducing callus is MS + 2． 0 mg /L PIC + 30 g /L sugar
cane，and the optimum formula for using agipanthus filament as the explant to induce callus is MS + 2． 0 mg /L PIC + 1． 0 mg /L 6-BA + 30 g /
L sucrose．
Key words:Callus;Picloram;Flower peduncle;Capillament;Agapanthus praecox ssp． orientalis
百子莲(Agapanthus praecox)又称‘蓝百合’，为
单子叶多年生草本花卉，具有肉质根状块茎，原产于
非洲南部的热带与亚热带地区。百子莲属植物观赏
性很强，是国外植物造景中常用的植物资源。我国
最早于 2002 年将百子莲引入上海，近 10 年来，张荻
等在百子莲花芽分化、开花特征、繁育系统、胚胎学
与体细胞胚诱导方面已经进行了较为系统的研
究［1 － 4］，发现生长素对百子莲花芽分化和胚胎发育
具有重要的调控作用，并分离得到生长素受体 TIＲ1
基因 EST序列。
植物的胚性愈伤组织是无性扩繁、基因转化与
种质保存的重要材料。已有研究发现毒莠定(Piclo-
ram，PIC)作为生长素类植物生长调节剂在诱导球
根花卉类植物愈伤组织与体细胞胚发生过程中具有
不可代替的作用，但其调控机理尚不明确。PIC 作
为内吸型生长素类除草剂可以通过叶片与根进入植
物体内，并通过运输途径与信号转导途径调控植物
的生长发育。已有研究表明单子叶植物与双子叶植
物感知与响应外源生长素具有明显的差别，除十字
花科(Cruciferae)外，其它双子叶植物对 PIC 十分敏
感，均会引起植株快速增长、维管结构发生改变导致
生长点结构坏死最终死亡，因此，PIC 能够选择性地
杀死双子叶杂草而保留单子叶植物;而单子叶植物
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2014 年 27 卷 3 期
Vol. 27 No. 3
西 南 农 业 学 报
Southwest China Journal of Agricultural Sciences
对外源生长素能够进行有限的运输并迅速降解体内
多余的外源生长素［5 ～ 6］。
体细胞胚胎发生(Somatic Embryogenesis，SE)
是指体细胞在特定条件下，未经性细胞融合而通过
与合子胚类似的发育途径发育出新个体的形态发生
过程［7］，是一种快速而高效地获得再生植株的繁殖
方法。诱导胚性愈伤组织的培养基一般采用蔗糖为
碳源，浓度通常为 3 % ～ 5 %，而相对高的蔗糖浓
度有利于胚性愈伤组织诱导［8］，而且生长素和细胞
分裂素对诱导愈伤组织的产生及促进其生长是必需
的［9］。范现丽(2009)研究发现诱导百子莲叶片愈
伤组织的最优激素组合为 PIC (2． 0 mg /L)+ 6-BA
(0． 4 mg /L) ，而以花梗为外植体时 PIC 最佳浓度为
3． 0 mg /L［10］。Suzuki，et al． (2001，2002)在诱导
百子莲愈伤组织的过程中采用的激素浓度为 PIC 1．
0 mg /L［11 ～ 12］。建立体细胞胚胎发生体系是研究细
胞胚性发生机制的基础，本研究诣在通过不同浓度
的外源生长素与细胞分裂素建立正交筛选实验，以
不同器官为外植体诱导百子莲的愈伤组织，建立百
子莲愈伤组织诱导体系。
1 材料与方法
1． 1 植物材料
供试材料为百子莲 4 年生实生苗。诱导愈伤组
织的外植体材料为花梗、雄蕊(花丝与花药)与茎基
部组织。
1． 2 主要仪器与设备
磁力搅拌器，超净工作台，Millipore 纯水仪，pH
计(Mettler Toledo)，电子天平，SANYO 高压灭菌锅，
恒温培养箱。
1． 3 实验药品与试剂
MS粉(Sigma)，植物凝胶(Sigma) ，琼脂粉，蔗
糖，PIC，6-BA，ABA，无水乙醇，次氯酸钠
1． 4 实验设计与方法
1． 4． 1 外植体消毒 百子莲花芽分化过程中，在花
苞开裂前进行花芽取材。流水冲洗 30 min 后，将材
料放置于超净工作台中，2 %次氯酸钠消毒处理 15
min，无菌水冲洗 3 次，无菌滤纸吸干材料表面的水
分，用解剖刀将花梗和花药切割成 0． 5 cm 的小块，
接种于愈伤诱导培养基中。
1． 4． 2 培养基的配制 基本培养基为 MS 培养基，
诱导方法按照试验设计添加不同浓度种类的激素。
培养基中蔗糖浓度为 3 %，植物凝胶含量为 0． 3 %，
pH值为 5． 8，培养基在 121 ℃高压灭菌锅中处理 20
min后，将不同种类的激素经 0． 22 μm 微孔滤膜过
滤后添加到培养基中。
100 mg /L激素母液配制方法:准确称取 100 mg
PIC与 6-BA，分别用少量的无水乙醇和 1 M NaOH
充分溶解后，用 ddH2O定容至 1 L后，放置于 4 ℃冰
箱中保存备用。
1． 4． 3 愈伤组织诱导 为筛选适宜于百子莲愈伤
诱导的培养基，本研究采用 2 因素 3 水平全组合实
验设计(表 1)。将外植体材料消毒处理后接种于相
应的培养基中(表 2)。定期观察、记录并统计愈伤
组织的诱导率。
2 结果与分析
2． 1 不同外植体材料的愈伤组织诱导效果
以百子莲花梗、雄蕊和块茎基部为外植体，应用
9 种 PIC 与 6-BA 的不同浓度组合对外植体材料进
行了愈伤组织诱导(图 1)。在 3 种外植体材中，花
梗诱导愈伤的效果最好，且诱导速度最快，在诱导第
15 天后愈伤组织开始逐渐分化(图 2a，b)，其诱导
率最高可达 100 %;雄蕊组织的愈伤形成主要在花
丝部位，诱导率最高可达 50 %，而花药组织逐渐发
生褐化(图 2c);茎基部组织在诱导初期便发生褐
化，随后逐渐趋近于死亡(图 2d) ，在 9 种诱导处理
中其诱导率都为 0。因此在百子莲愈伤组织诱导试
验中，最佳外植体为花梗组织，其次为花丝组织。
表 1 愈伤组织诱导培养基中添加的激素种类与水平
Table 1 Experiment design for callus induction culture medium
因素
Factors
水平 (mg /L)Levels
1 2 3
PIC 1． 0 2． 0 3． 0
6-BA 0． 0 0． 5 1． 0
表 2 百子莲愈伤组织诱导培养基
Table 2 Preparation for Agapanthus callus induction culture medium
试验处理
Treatments
水平 (mg /L)Levels
PIC 6-BA
1 1 (1． 0) 1 (0． 0)
2 2 (2． 0) 1 (0． 0)
3 3 (3． 0) 1 (0． 0)
4 1 (1． 0) 2 (0． 5)
5 2 (2． 0) 2 (0． 5)
6 3 (3． 0) 2 (0． 5)
7 1 (1． 0) 3 (1． 0)
8 2 (2． 0) 3 (1． 0)
9 3 (3． 0) 3 (1． 0)
8321 西 南 农 业 学 报 27 卷
A:花梗;B:花药;C:块茎基部;A:pedicel;B:anther;C:tuber;1:PIC 1． 0 mg /L;2:PIC 2． 0 mg /L;3:PIC 3． 0 mg /L;4:PIC 1． 0 mg /L + 6-
BA 0． 5 mg /L;5:PIC 2． 0 mg /L + 6-BA 0． 5 mg /L;6:PIC 3． 0 mg /L + 6-BA 0． 5 mg /L;7:PIC 1． 0 mg /L + 6-BA 1． 0 mg /L;8:PIC 2． 0 mg /L
+ 6-BA 1． 0 mg /L;9:PIC 3． 0 mg /L + 6-BA 1． 0 mg /L
图 1 百子莲愈伤组织诱导的不同激素组合处理
Fig． 1 A． praecox callus induction of different hormone combination treatment
a:花梗组织诱导第 15 天开始形成愈伤组织;b:花梗诱导第 35 天的愈伤状态;c:花丝诱导第 35 天开始形成愈伤组织;d:块茎在诱导过程中
发生褐化
图 2 百子莲不同外植体愈伤组织诱导
Fig． 2 Callus induction effects of different explants in A． praecox
2． 2 不同激素组合处理对花梗外部形态变化的影
响
花梗组织在不同浓度 PIC 与 6-BA 激素组合处
理下外植体的外部形态特征变化较大。在诱导的第
5 天时，PIC单独诱导(1． 0，2． 0，3． 0 mg /L)的花梗
材料在纵向上发生了明显的伸长，随后开始有愈伤
组织出现，到诱导第 35 天时，大部分花梗材料都分
化出愈伤组织(图 3);在含有 6-BA 的处理材料中，
花梗材料没有发生明显的纵向伸长，而是在横向上
逐渐增粗(图 3)，随后花梗外部形态基本保持不变，
愈伤的诱导率较低。花梗外植体的外部形态变化说
明 6-BA对愈伤的诱导作用较小，而 PIC对愈伤组织
诱导具有明显的调控作用。
2． 3 不同激素组合处理对花梗愈伤组织诱导的影
响
如图 4 所示，PIC 单独诱导花梗愈伤组织形成
的效果优于 PIC与 6-BA组合诱导的效果，且 PIC单
独诱导愈伤组织的过程中，不同浓度的 PIC(1． 0，
2． 0，3． 0 mg /L)对愈伤组织的诱导率差异不显著，
但是 2． 0 mg /L PIC 对花梗愈伤组织的诱导速度最
快。在 PIC与 6-BA组合诱导过程中，6-BA(0． 5，1．
0 mg /L)的加入使花梗的愈伤诱导率表现出不同程
度的降低，且 6-BA与不同浓度 PIC组合对花梗愈伤
诱导率具有显著性差异。6-BA 明显的降低了 1． 0
mg /L PIC对花梗愈伤的诱导效果;但是对 2． 0 与 3．
0 mg /L PIC的愈伤诱导效果影响较小。
不同激素组合对花梗愈伤诱导率的极差分析的
Ｒ值表明 6-BA对愈伤诱导的影响力为 0 ＞ 1． 0 ＞ 0．
5，而 PIC 对愈伤诱导的影响力为 2． 0 ＞ 3． 0 ＞ 1． 0
(表 3)。根据极差选择的最优水平组合为 MS + 2． 0
mg /L PIC + 30 g /L蔗糖，在本试验处理结果中此组
合的花梗愈伤诱导率也是最高(100 %)。因此，以
百子莲花梗为外植体诱导愈伤组织的最优配方是
MS +2． 0 mg /L PIC + 30 g /L蔗糖。
2． 4 不同激素组合处理对花丝愈伤组织诱导的影
响
不同激素组合对花丝愈伤诱导率的极差分析的
Ｒ值表明 6-BA 极差大于 PIC，证明 6-BA 的影响较
大，且 6-BA对愈伤诱导的影响力为 1． 0 ＞ 0． 5 ＞ 0，
而 PIC对愈伤诱导的影响力为 2． 0 ＞ 1． 0 ＞ 3． 0(表
93213 期 何 叶等:百子莲愈伤组织诱导体系的优化
1:PIC 1． 0 mg /L;2:PIC 2． 0 mg /L;3:PIC 3． 0 mg /L;4:PIC 1． 0 mg /L +6-BA 0． 5 mg /L;7:PIC 1． 0 mg /L +6-BA 1． 0 mg /L
图 3 百子莲愈伤诱导过程中外植体材料形态变化
Fig． 3 Morphological changes of explants during callus induction in Agapanthus
a:PIC 1． 0 mg /L;b:PIC 2． 0 mg /L;c:PIC 3． 0 mg /L;d:PIC 1． 0 mg /L + 6-BA 0． 5 mg /L;e:PIC 2． 0 mg /L + 6-BA 0． 5 mg /L;f:PIC 3． 0
mg /L + 6-BA 0． 5 mg /L;g:PIC 1． 0 mg /L + 6-BA 1． 0 mg /L;h:PIC 2． 0 mg /L + 6-BA 1． 0 mg /L;i:PIC 3． 0 mg /L + 6-BA 1． 0 mg /L
图 4 不同激素组合对百子莲花梗愈伤组织的诱导效果
Fig． 4 Different exogenous hormones on callus induction of pedicel in Agapanthus
0421 西 南 农 业 学 报 27 卷
表 3 不同激素组合对花梗愈伤组织诱导的影响
Table 3 Influence of different exogenous hormones on callus induc-
tion of pedicel in Agapanthus
处理
Treatments
PIC
(mg /L)
6-BA
(mg /L)
诱导率(%)
Inductivity
1 1 (1． 0) 1 (0． 0) 87． 5
2 2 (2． 0) 1 (0． 0) 100
3 3 (3． 0) 1 (0． 0) 93． 3
4 1 (1． 0) 2 (0． 5) 6． 25
5 2 (2． 0) 2 (0． 5) 75
6 3 (3． 0) 2 (0． 5) 55． 6
7 1 (1． 0) 3 (1． 0) 18． 2
8 2 (2． 0) 3 (1． 0) 75
9 3 (3． 0) 3 (1． 0) 50
K1 111． 95 280． 8
K2 250 136． 85
K3 198． 9 143． 2
k1 37． 32 93． 6
k2 83． 33 45． 62
k3 66． 3 47． 73
Ｒ 46． 01 47． 98
4)。根据极差选择的最优水平组合为 MS +2． 0 mg /
L PIC + 1． 0 mg /L 6-BA + 30 g /L 蔗糖，此组合对花
丝愈伤组织诱导率为 50 %，在各组合处理结果中也
是最高。因此，以百子莲花丝为外植体诱导愈伤组
织的最优配方是 MS + 2． 0 mg /L PIC + 1． 0 mg /L 6-
BA +30 g /L蔗糖。
3 讨 论
PIC作为植物生长调节剂始于 1967 年在小麦
(Triticum aestivum) ，大豆(Glycine max) ，烟草(Nic-
otiana tabacum)和刀豆(Canavalia ensiformis)等多种
作物的胚性愈伤组织诱导中，并发现 PIC 比其它生
长素类物质具有更高的活性［17 ～ 18］。在组织培养研
究中，单子叶植物通常比双子叶植物更难形成愈伤
组织与体细胞胚。Beyl 和 Sharma(1983)应用 PIC
诱导百合科的沙鱼掌(Gasteria verrucosa)和条纹十
二卷(Haworthia fasciata)愈伤组织，发现 PIC可以作
为外源生长素类物质降低单子叶植物组织培养的难
度［19］。目前 PIC已广泛应用于小麦、大麦(Hordeum
vulgare)、小米(Foxtail millet)、豌豆(Pisum sati-
vum)、大豆、黑麦(Secale cereale)、花生(Arachis hy-
pogaea)与木薯(Manihot esculenta)等农作物及棕榈
科等多种植物体胚诱导中。另外，近期研究表明
PIC在单子叶球根花卉的体细胞胚性启动与胚性保
表 4 不同激素组合对花丝愈伤组织诱导的影响
Table 4 Effects of different exogenous hormones on callus induction
of filaments in Agapanthus
处理
Treatments
PIC
(mg /L)
6-BA
(mg /L)
诱导率(%)
Inductivity
1 1 (1． 0) 1 (0． 0) 8． 3
2 2 (2． 0) 1 (0． 0) 15． 4
3 3 (3． 0) 1 (0． 0) 16． 7
4 1 (1． 0) 2 (0． 5) 27． 3
5 2 (2． 0) 2 (0． 5) 33． 3
6 3 (3． 0) 2 (0． 5) 16． 7
7 1 (1． 0) 3 (1． 0) 30
8 2 (2． 0) 3 (1． 0) 50
9 3 (3． 0) 3 (1． 0) 18． 2
K1 65． 6 40． 4
K2 98． 7 77． 3
K3 51． 6 98． 2
k1 21． 87 13． 47
k2 32． 9 25． 77
k3 17． 2 32． 73
Ｒ 15． 7 19． 26
持方面具有其它外源生长素不可代替的调控作用。
在对百子莲、香蕉、岷江百合、东方百合、郁金香等植
物诱导愈伤组织的研究中，PIC 被单独使用或与 6-
BA、BA、IAA、NAA等其他生长调剂物结合使用，取
得了很好的效果，愈伤诱导率均有明显的改
善［10，13 ～ 16］。已有研究表明 PIC 可直接诱导百子莲
花梗组织形成愈伤，且诱导率为 53． 3 %［10］;而应用
PIC诱导出的百合愈伤组织结构疏松、分散性好，获
得的胚性愈伤组织质量好且水渍化程度降低［13 ～ 14］。
然而 PIC诱导的香蕉胚性愈伤组织含水量较高，在
进行液体悬浮培养的初期容易出现褐化现象［15］。
在本研究中发现，百子莲愈伤组织诱导的最佳外植
体为花梗组织;PIC 单独诱导的花梗材料在纵向上
发生明显的伸长，到诱导第 35 天时，大部分花梗材
料都分化出愈伤组织;PIC(2． 0，mg /L)的愈伤诱导
率可达 100 %，且诱导速度较快，较已有研究结果明
显提高。
植物的愈伤组织是无性扩繁、基因转化与种质
资源保存的重要试验材料。建立高效稳定的愈伤组
织诱导体系是植物体细胞胚性发生、遗传育种、种质
资源长期离体保存等研究领域的重要技术保障，为
后续的研究工作奠定了一定的基础。
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( 责任编辑 姚永红)
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