全 文 ：第 20 卷 第 4 期 集美大学学报 (自然科学版) Vol． 20 No． 4
2015 年 7 月 Journal of Jimei University(Natural Science) Jul. 2015
［收稿日期］ 2014 － 10 － 29 ［修回日期］ 2014 － 11 － 19
［基金项目］国家自然科学基金资助项目 (21305050);福建省科技计划重点项目 (2012Y0052，2014Y0045) ;
厦门市科技计划项目 (3502Z20143018) ;集美大学创新团队基金资助项目 (2010A007)
［作者简介］高治昊 (1990—)，男，硕士生，主要从事食品安全检测技术研究． 通信作者:黄志勇 (1963—)，
男，教授，从事食品安全分析研究，E-mail:zhyhuang@ jmu． edu． cn．
［文章编号］1007 － 7405(2015)04 － 0255 － 05
贝类产品中软骨藻酸的 HPLC检测方法
高治昊，林郑忠，陈晓梅，黄志勇
(集美大学食品与生物工程学院，福建 厦门 361021)
［摘要］建立了高效液相色谱测定贝类产品中软骨藻酸的检测方法，具体过程为:样品先经甲醇浸提后，
再用甲醇 －水(V(甲醇)∶ V(水)= 1 ∶ 1)提取 2 次，合并提取液后用 Zorbax SB300 － C18 柱 (2. 1 mm ×
250 mm，5 μm)进行分离，以乙腈 － 0. 2%磷酸水溶液 (含 0. 1%三乙胺)(V(乙腈)∶ V(磷酸水溶液)=
12∶ 88)为流动相于室温下等度洗脱，流速为 0. 25 mL /min，进样量 20 μL，检测波长为 242 nm． 结果表明，
在建立的提取方法和色谱条件下，软骨藻酸从复杂的样品基体中被分离出来，在 0. 02 ～ 1. 0 mg /L质量浓度
范围内具有良好的线性关系 (r ＞ 0. 999)，样品的平均加标回收率为 108%，测量方法的 ＲSD 为
3. 5% (n = 6)，检出限为 23. 5 ng /g． 所建立的检测方法可适用于对贝类产品中软骨藻酸的快速检测．
［关键词］软骨藻酸;高效液相色谱;贝类;快速检测
［中图分类号］ TS 207. 3 ［文献标志码］ A
Ｒapid Detection of Domoic Acid in Shellfishes by HPLC
GAO Zhi-hao，LIN Zheng-zhong，CHEN Xiao-mei，HUANG Zhi-yong
(College of Food and Biological Engineering，Jimei University，Xiamen 361021，China)
Abstract:A rapid detection method by high performance liquid chromatography (HPLC)was developed
to determine the concentrations of domoic acid in different species of shellfish． After extraction by methanol
and methanol-water (1∶ 1，V /V)，the sample was separated using a Zorbax SB300 － C18 chromatographic
column (2. 1 mm × 250 mm，5 μm) ，and was eluted with acetonitrile － 0. 2% phosphoric acid solution
(containing 0. 5% triethylamine) (12∶ 88，V /V)at room temperature． The flow rate was set as 0. 25 mL /min．
20 μL of sample was individually injected，and the detection wavelength was 242 nm． The results showed
that domoic acid can be well separated from the sample matrix within 8 min with a linear range of 0. 02 ～
1. 0 mg /L(r ＞ 0. 999)． The average recovery as tested by adding standards was 108%，and the ＲSD was
3. 5% (n = 6)． The detection limit estimated with three folds of standard deviations was 23. 5 ng /g． In con-
clusion，the established method can be used to detect trace domoic acid in shellfish samples rapidly without
further purification treatment by SPE columns．
Key words:domoic acid;HPLC;shellfish;rapid detection
0 引言
软骨藻酸 (Domoic Acid，DA)是一种由拟菱形藻所产生的天然氨基酸型神经毒素［1］，其化学结
集美大学学报 (自然科学版) 第 20 卷
构与红藻氨酸 (Kainic Acid，KA)和谷氨酸相似［2］． 当赤潮发生时易产生 DA 毒素，通过贝类滤食
性富集和食物链的传递危害人类健康［3 － 4］． 例如，1987 年加拿大发生了因人类食用受 DA污染的蓝贻
贝而导致 105 人急性中毒并造成 3 人死亡的事件［3］． 为此，美国食品药品管理局将 DA列为 4 种主要
海洋毒素之一，加拿大首先制定了 DA的安全限量为 20 μg /g，欧洲、日本也相继将该种毒素列为常
规检测项目［4 － 5］，但我国尚未制定 DA 的安全限量标准． 近年来我国赤潮发生规模与频率呈上升趋
势，有毒藻类及生物毒素的危害不断增加［6］． 因此，研究贝类产品中软骨藻酸的快速检测方法有着
十分重要的意义．
目前软骨藻酸的检测方法主要有生物分析法［7 － 8］、免疫分析法［9 － 10］、毛细管电泳法［11 － 12］和高效
液相色谱法［13 － 15］等． 生物分析法是生物毒素通用的检测方法，主要是对小白鼠进行毒素腹腔注射，
观察其存活情况以确定毒性大小，一般用半致死剂量来表示． 但该法检测时间长，无法确定毒素种
类，且因不同小鼠的品系、批次等差异造成检测灵敏度波动较大［16］． 免疫分析法是利用抗原 －抗体
反应来确定毒素的类型及含量，包括酶联免疫分析法、放射免疫分析法和胶体金免疫分析法［17］等，
虽具有快速、准确等优点，但目前对高特异性抗体的制备仍较困难，易出现假阳性结果［18］． 毛细管
电泳和高效液相色谱法操作简便、灵敏度高，可进行定性和定量分析，是目前 DA检测中应用最为广
泛的分析手段，已被许多国家列为标准的检测方法［19］． 但这两种检测方法通常需要对样品提取液进
行复杂的萃取和净化处理，如使用 SAX柱和 SCX柱净化以排除样品基体中色氨酸等杂质对 DA 检测
的干扰，不仅操作繁琐且技术难度高［14 － 15］． 鉴于此，本文拟对提取方法与色谱条件进行改进和优化，
使样品提取液能够直接进样分析，为贝类产品中 DA的快速检测提供实验基础．
1 材料与方法
1. 1 仪器与试剂
安捷伦 1260 高效液相色谱仪 (配备 DAD检测器)，美国安捷伦公司;FS － 1 电动匀浆机，金坛
市富华仪器有限公司;5417Ｒ 小型高速离心机，德国艾本德公司;KQ －500 数控超声波清洗器，昆山
市超声仪器有限公司;滤膜，天津津腾．
软骨藻酸标准品 (纯度 ＞ 90%)，加拿大 Sigma 公司;甲醇 (色谱纯)，美国 Sigma 公司;乙腈
(色谱纯)，美国 Tedia公司;三乙胺 (分析纯)，国药集团化学试剂有限公司;磷酸 (分析纯)，汕
头市西陇化工厂;花蛤、海蛏均购于厦门集美区农贸市场．
1. 2 标准溶液的配制
软骨藻酸标准品用超纯水溶解配制标准储备液，置于 4 ℃冰箱备用． 临用前用超纯水稀释配制成
0. 02 ～ 1. 0 mg /L的系列标准工作液．
1. 3 样品处理
取 50 g新鲜贝肉，匀浆 3 min，从中取出 0. 5 g匀浆液，放入 2. 5 mL离心管中，加入 1 mL纯甲
醇混匀后静置 30 min，随后 12000 r /min 离心 10 min，将上清液转移至 5 mL 离心管中． 残渣分别用
0. 5 mL体积分数 50%甲醇水溶液超声提取 2 次，每次 10 min ，经离心后，合并所有上清液并定容至
3 mL． 上清液过 0. 45 μm滤膜后进样分析．
1. 4 色谱条件
色谱柱:Agilent Zorbax SB300 － C18 柱 (2. 1 mm ×250 mm，5 μm)，美国安捷伦公司;柱温为室
温;流速 0. 25 mL /min;进样量 20 μL;检测波长 242 nm．
为考察不同流动相组成对软骨藻酸分离的影响，实验设计了以下 3 种流动性体系:流动相 A 为
乙腈 － 0. 1%三氟乙酸水溶液(V(乙睛)∶ V(三氟乙酸)= 13∶ 87);流动相 B 为乙腈 － 0. 2%磷酸水溶液
(含体积分数 0. 2%三乙胺)(V(乙腈)∶ V(磷酸)= 12∶ 88);流动相 C 为乙腈 － 0. 2%磷酸水溶液 (含
体积分数 0. 1%三乙胺)( (V(乙腈)∶ V(磷酸)= 12∶ 88))． 其中，0. 1%三氟乙酸水溶液和 0. 2%磷酸
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第 4 期 高治昊，等:贝类产品中软骨藻酸的 HPLC检测方法
水溶液均为体积分数．
2 结果与讨论
2. 1 提取条件的优化
与其他的贝类毒素 (如麻痹性贝毒素)提取法相似，传统的 DA 提取一般在酸性水溶液中进
行［13］，但在实际操作中发现，DA 在酸性介质中久置易分解［20］，严重影响 DA 的准确定量． 此外，
目前对贝类 DA的提取通常还采用甲醇 －水 (V (甲醇) ∶ V (水) = 1∶ 1)进行一次性浸提［14］，而后
粗提液经 SAX柱和 SCX柱净化处理，再浓缩后用 HPLC 检测，但由于需要过柱，操作步骤繁琐、耗
时，且技术难度高，不利于 DA的快速检测． 而如果仅采用甲醇 －水 (V (甲醇) ∶ V (水) = 1∶ 1)
提取后直接进样，则由于样品提取液基体浓度高，且提取不完全，易造成色谱柱压力不稳定、回收率
低等问题．
本实验首先对 0. 5 g样品匀浆液用 1 mL甲醇静置提取 30 min，离心后残渣再用 0. 5 mL甲醇 －水
(V (甲醇) ∶ V (水) = 1∶ 1)重复提取 2 次，合并所有提取液即可直接进样检测． 由于提取液不需
使用固相萃取柱进行净化和浓缩处理，因而大大缩短了样品前处理时间，而且样品在检测时色谱柱压
力稳定、回收率高，为实现 DA的快速检测奠定了基础．
2. 2 色谱条件的选择
由于色氨酸与 DA的分子结构有一定的相似性，在 HPLC 检测中，样品中共存的色氨酸对 DA 将
产生严重干扰． 如图 1B所示，采用 Quilliam等［13］报道的流动相体系即乙腈 － 0. 1%三氟乙酸 (pH =
2. 16)，样品中软骨藻酸的 HPLC组分峰 (即峰 2)受基体的干扰严重． 这是由于提取液未经固相萃
取柱净化，样品中色氨酸等杂质对软骨藻酸的色谱峰产生了干扰［21］． 因此，本实验采用乙腈 －磷酸
洗脱体系［22］，并发现通过添加三乙胺可以使 DA与色氨酸的色谱峰分开，从图 1C和图 1D可以看出，
采用乙腈 － 0. 2%磷酸流动相体系，在流动相中添加适量的三乙胺均可以使软骨藻酸与基体中色氨酸
达到基线分离． 但当流动相中三乙胺的添加量达到水相体积的 0. 2%时 (图 1C)，虽然软骨藻酸与色
氨酸的分离度达到了 4. 0，但软骨藻酸峰形较差，拖尾严重． 而当流动相中三乙胺的体积分数为
0. 1%时 (图 1D)，软骨藻酸峰形较好，与色氨酸的分离度也达到 3. 4，完全满足检测的要求． 因此，
本实验采用乙腈 － 0. 2%磷酸 (含体积分数为 0. 1%三乙胺)(V (乙腈) ∶ V (磷酸) = 12∶ 88)作为
软骨藻酸分离的流动相体系．
2. 3 线性关系
在优化的色谱条件下，分别测定软骨藻酸系列标准工作液，以相应的色谱峰面积 (y)对其质量
浓度 (x，mg /L)进行线性回归． 结果表明，软骨藻酸在质量浓度为 0. 02 ～ 1. 0 mg /L 范围内线性关
系良好(r ＞ 0. 999)，线性方程为 y = 246. 65 x － 0. 3521 ．
2. 4 检出限
以 0. 3 μg /g软骨藻酸标准溶液，在花蛤和海蛏的实际样品中进行 9 次加标平行试验，用峰面积的
3倍标准偏差进行估算，测得方法的检出限为 23. 5 ng /g，不仅远远低于国标 GB/T 5009. 198—2003［23］中
软骨藻酸的检出限 (1. 0 μg /g)，而且与同类研究中软骨藻酸的检出限34 ng /g［14］、63 ng /g［11］、200 ng /g［22］
相比，本方法具有更低的检出限水平，说明本方法具有很高的检测灵敏度．
2. 5 精密度与回收率
实验选取花蛤与海蛏作为实际测量样品，在测定其本底值为未检出的基础上，分别对其进行了
3 个水平的加标回收率试验，结果如表 1 所示． 其中，花蛤的回收率为 93. 5% ～99. 8%，海蛏的加标
回收率为 116% ～120% ． 以加标水平为 0. 3 μg /g 的实际样品进行 6 次平行试验，其相对标准偏差
(ＲSD)为 3. 5%，说明方法的精密度良好．
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集美大学学报 (自然科学版) 第 20 卷
表 1 贝类中软骨藻酸的加标回收率试验
Tab. 1 Ｒecovery tests of domoic acid by adding standards in Venerupis philippinarum and razor clam(n = 3)
样品 Samples
加标水平 Adding standards /(μg·g －1)
A B C
测得值 Measuring value /(μg·g －1)
A B C
平均加标
回收率
Average recovery
by adding
standards /%
花蛤 Venerupis
philippinarum 0． 3 1． 0 1． 6 0． 27 ± 0． 03 0． 97 ± 0． 01 1． 60 ± 0． 02 96． 5
海蛏 Ｒazor clam 0． 3 1． 0 1． 6 0． 33 ± 0． 02 1． 21 ± 0． 05 1． 87 ± 0． 03 119． 0
3 结论
本文建立了贝类中软骨藻酸的高效液相色谱检测方法，通过对提取方法的改进及色谱条件的优
化，有效解决了样品中复杂基质对软骨藻酸检测的影响，通过甲醇浸提再用 0. 5 mL 甲醇 －水 (V(甲
醇)∶ V(水)= 1 ∶ 1)进行重复提取，提取液可直接进样检测;通过对流动相体系乙腈 － 0. 2%磷酸
(含体积分数为 0. 1%三乙胺)(V(乙腈)∶ V(磷酸水溶液)= 12∶ 88)的优化，解决了基体中色氨酸对软
骨藻酸检测干扰的问题． 样品的平均加标回收率为 108%，检出限为 23. 5 ng /g，完全可以满足贝类
产品软骨藻酸的检测要求．
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第 4 期 高治昊，等:贝类产品中软骨藻酸的 HPLC检测方法
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(责任编辑 马建华 英文审校 曹敏杰)
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