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贝类产品中软骨藻酸的HPLC检测方法



全 文 :第 20 卷 第 4 期 集美大学学报 (自然科学版) Vol. 20 No. 4
2015 年 7 月 Journal of Jimei University(Natural Science) Jul. 2015
[收稿日期] 2014 - 10 - 29 [修回日期] 2014 - 11 - 19
[基金项目]国家自然科学基金资助项目 (21305050);福建省科技计划重点项目 (2012Y0052,2014Y0045) ;
厦门市科技计划项目 (3502Z20143018) ;集美大学创新团队基金资助项目 (2010A007)
[作者简介]高治昊 (1990—),男,硕士生,主要从事食品安全检测技术研究. 通信作者:黄志勇 (1963—),
男,教授,从事食品安全分析研究,E-mail:zhyhuang@ jmu. edu. cn.
[文章编号]1007 - 7405(2015)04 - 0255 - 05
贝类产品中软骨藻酸的 HPLC检测方法
高治昊,林郑忠,陈晓梅,黄志勇
(集美大学食品与生物工程学院,福建 厦门 361021)
[摘要]建立了高效液相色谱测定贝类产品中软骨藻酸的检测方法,具体过程为:样品先经甲醇浸提后,
再用甲醇 -水(V(甲醇)∶ V(水)= 1 ∶ 1)提取 2 次,合并提取液后用 Zorbax SB300 - C18 柱 (2. 1 mm ×
250 mm,5 μm)进行分离,以乙腈 - 0. 2%磷酸水溶液 (含 0. 1%三乙胺)(V(乙腈)∶ V(磷酸水溶液)=
12∶ 88)为流动相于室温下等度洗脱,流速为 0. 25 mL /min,进样量 20 μL,检测波长为 242 nm. 结果表明,
在建立的提取方法和色谱条件下,软骨藻酸从复杂的样品基体中被分离出来,在 0. 02 ~ 1. 0 mg /L质量浓度
范围内具有良好的线性关系 (r > 0. 999),样品的平均加标回收率为 108%,测量方法的 RSD 为
3. 5% (n = 6),检出限为 23. 5 ng /g. 所建立的检测方法可适用于对贝类产品中软骨藻酸的快速检测.
[关键词]软骨藻酸;高效液相色谱;贝类;快速检测
[中图分类号] TS 207. 3 [文献标志码] A
Rapid Detection of Domoic Acid in Shellfishes by HPLC
GAO Zhi-hao,LIN Zheng-zhong,CHEN Xiao-mei,HUANG Zhi-yong
(College of Food and Biological Engineering,Jimei University,Xiamen 361021,China)
Abstract:A rapid detection method by high performance liquid chromatography (HPLC)was developed
to determine the concentrations of domoic acid in different species of shellfish. After extraction by methanol
and methanol-water (1∶ 1,V /V),the sample was separated using a Zorbax SB300 - C18 chromatographic
column (2. 1 mm × 250 mm,5 μm) ,and was eluted with acetonitrile - 0. 2% phosphoric acid solution
(containing 0. 5% triethylamine) (12∶ 88,V /V)at room temperature. The flow rate was set as 0. 25 mL /min.
20 μL of sample was individually injected,and the detection wavelength was 242 nm. The results showed
that domoic acid can be well separated from the sample matrix within 8 min with a linear range of 0. 02 ~
1. 0 mg /L(r > 0. 999). The average recovery as tested by adding standards was 108%,and the RSD was
3. 5% (n = 6). The detection limit estimated with three folds of standard deviations was 23. 5 ng /g. In con-
clusion,the established method can be used to detect trace domoic acid in shellfish samples rapidly without
further purification treatment by SPE columns.
Key words:domoic acid;HPLC;shellfish;rapid detection
0 引言
软骨藻酸 (Domoic Acid,DA)是一种由拟菱形藻所产生的天然氨基酸型神经毒素[1],其化学结
集美大学学报 (自然科学版) 第 20 卷
构与红藻氨酸 (Kainic Acid,KA)和谷氨酸相似[2]. 当赤潮发生时易产生 DA 毒素,通过贝类滤食
性富集和食物链的传递危害人类健康[3 - 4]. 例如,1987 年加拿大发生了因人类食用受 DA污染的蓝贻
贝而导致 105 人急性中毒并造成 3 人死亡的事件[3]. 为此,美国食品药品管理局将 DA列为 4 种主要
海洋毒素之一,加拿大首先制定了 DA的安全限量为 20 μg /g,欧洲、日本也相继将该种毒素列为常
规检测项目[4 - 5],但我国尚未制定 DA 的安全限量标准. 近年来我国赤潮发生规模与频率呈上升趋
势,有毒藻类及生物毒素的危害不断增加[6]. 因此,研究贝类产品中软骨藻酸的快速检测方法有着
十分重要的意义.
目前软骨藻酸的检测方法主要有生物分析法[7 - 8]、免疫分析法[9 - 10]、毛细管电泳法[11 - 12]和高效
液相色谱法[13 - 15]等. 生物分析法是生物毒素通用的检测方法,主要是对小白鼠进行毒素腹腔注射,
观察其存活情况以确定毒性大小,一般用半致死剂量来表示. 但该法检测时间长,无法确定毒素种
类,且因不同小鼠的品系、批次等差异造成检测灵敏度波动较大[16]. 免疫分析法是利用抗原 -抗体
反应来确定毒素的类型及含量,包括酶联免疫分析法、放射免疫分析法和胶体金免疫分析法[17]等,
虽具有快速、准确等优点,但目前对高特异性抗体的制备仍较困难,易出现假阳性结果[18]. 毛细管
电泳和高效液相色谱法操作简便、灵敏度高,可进行定性和定量分析,是目前 DA检测中应用最为广
泛的分析手段,已被许多国家列为标准的检测方法[19]. 但这两种检测方法通常需要对样品提取液进
行复杂的萃取和净化处理,如使用 SAX柱和 SCX柱净化以排除样品基体中色氨酸等杂质对 DA 检测
的干扰,不仅操作繁琐且技术难度高[14 - 15]. 鉴于此,本文拟对提取方法与色谱条件进行改进和优化,
使样品提取液能够直接进样分析,为贝类产品中 DA的快速检测提供实验基础.
1 材料与方法
1. 1 仪器与试剂
安捷伦 1260 高效液相色谱仪 (配备 DAD检测器),美国安捷伦公司;FS - 1 电动匀浆机,金坛
市富华仪器有限公司;5417R 小型高速离心机,德国艾本德公司;KQ -500 数控超声波清洗器,昆山
市超声仪器有限公司;滤膜,天津津腾.
软骨藻酸标准品 (纯度 > 90%),加拿大 Sigma 公司;甲醇 (色谱纯),美国 Sigma 公司;乙腈
(色谱纯),美国 Tedia公司;三乙胺 (分析纯),国药集团化学试剂有限公司;磷酸 (分析纯),汕
头市西陇化工厂;花蛤、海蛏均购于厦门集美区农贸市场.
1. 2 标准溶液的配制
软骨藻酸标准品用超纯水溶解配制标准储备液,置于 4 ℃冰箱备用. 临用前用超纯水稀释配制成
0. 02 ~ 1. 0 mg /L的系列标准工作液.
1. 3 样品处理
取 50 g新鲜贝肉,匀浆 3 min,从中取出 0. 5 g匀浆液,放入 2. 5 mL离心管中,加入 1 mL纯甲
醇混匀后静置 30 min,随后 12000 r /min 离心 10 min,将上清液转移至 5 mL 离心管中. 残渣分别用
0. 5 mL体积分数 50%甲醇水溶液超声提取 2 次,每次 10 min ,经离心后,合并所有上清液并定容至
3 mL. 上清液过 0. 45 μm滤膜后进样分析.
1. 4 色谱条件
色谱柱:Agilent Zorbax SB300 - C18 柱 (2. 1 mm ×250 mm,5 μm),美国安捷伦公司;柱温为室
温;流速 0. 25 mL /min;进样量 20 μL;检测波长 242 nm.
为考察不同流动相组成对软骨藻酸分离的影响,实验设计了以下 3 种流动性体系:流动相 A 为
乙腈 - 0. 1%三氟乙酸水溶液(V(乙睛)∶ V(三氟乙酸)= 13∶ 87);流动相 B 为乙腈 - 0. 2%磷酸水溶液
(含体积分数 0. 2%三乙胺)(V(乙腈)∶ V(磷酸)= 12∶ 88);流动相 C 为乙腈 - 0. 2%磷酸水溶液 (含
体积分数 0. 1%三乙胺)( (V(乙腈)∶ V(磷酸)= 12∶ 88)). 其中,0. 1%三氟乙酸水溶液和 0. 2%磷酸
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第 4 期 高治昊,等:贝类产品中软骨藻酸的 HPLC检测方法
水溶液均为体积分数.
2 结果与讨论
2. 1 提取条件的优化
与其他的贝类毒素 (如麻痹性贝毒素)提取法相似,传统的 DA 提取一般在酸性水溶液中进
行[13],但在实际操作中发现,DA 在酸性介质中久置易分解[20],严重影响 DA 的准确定量. 此外,
目前对贝类 DA的提取通常还采用甲醇 -水 (V (甲醇) ∶ V (水) = 1∶ 1)进行一次性浸提[14],而后
粗提液经 SAX柱和 SCX柱净化处理,再浓缩后用 HPLC 检测,但由于需要过柱,操作步骤繁琐、耗
时,且技术难度高,不利于 DA的快速检测. 而如果仅采用甲醇 -水 (V (甲醇) ∶ V (水) = 1∶ 1)
提取后直接进样,则由于样品提取液基体浓度高,且提取不完全,易造成色谱柱压力不稳定、回收率
低等问题.
本实验首先对 0. 5 g样品匀浆液用 1 mL甲醇静置提取 30 min,离心后残渣再用 0. 5 mL甲醇 -水
(V (甲醇) ∶ V (水) = 1∶ 1)重复提取 2 次,合并所有提取液即可直接进样检测. 由于提取液不需
使用固相萃取柱进行净化和浓缩处理,因而大大缩短了样品前处理时间,而且样品在检测时色谱柱压
力稳定、回收率高,为实现 DA的快速检测奠定了基础.
2. 2 色谱条件的选择
由于色氨酸与 DA的分子结构有一定的相似性,在 HPLC 检测中,样品中共存的色氨酸对 DA 将
产生严重干扰. 如图 1B所示,采用 Quilliam等[13]报道的流动相体系即乙腈 - 0. 1%三氟乙酸 (pH =
2. 16),样品中软骨藻酸的 HPLC组分峰 (即峰 2)受基体的干扰严重. 这是由于提取液未经固相萃
取柱净化,样品中色氨酸等杂质对软骨藻酸的色谱峰产生了干扰[21]. 因此,本实验采用乙腈 -磷酸
洗脱体系[22],并发现通过添加三乙胺可以使 DA与色氨酸的色谱峰分开,从图 1C和图 1D可以看出,
采用乙腈 - 0. 2%磷酸流动相体系,在流动相中添加适量的三乙胺均可以使软骨藻酸与基体中色氨酸
达到基线分离. 但当流动相中三乙胺的添加量达到水相体积的 0. 2%时 (图 1C),虽然软骨藻酸与色
氨酸的分离度达到了 4. 0,但软骨藻酸峰形较差,拖尾严重. 而当流动相中三乙胺的体积分数为
0. 1%时 (图 1D),软骨藻酸峰形较好,与色氨酸的分离度也达到 3. 4,完全满足检测的要求. 因此,
本实验采用乙腈 - 0. 2%磷酸 (含体积分数为 0. 1%三乙胺)(V (乙腈) ∶ V (磷酸) = 12∶ 88)作为
软骨藻酸分离的流动相体系.
2. 3 线性关系
在优化的色谱条件下,分别测定软骨藻酸系列标准工作液,以相应的色谱峰面积 (y)对其质量
浓度 (x,mg /L)进行线性回归. 结果表明,软骨藻酸在质量浓度为 0. 02 ~ 1. 0 mg /L 范围内线性关
系良好(r > 0. 999),线性方程为 y = 246. 65 x - 0. 3521 .
2. 4 检出限
以 0. 3 μg /g软骨藻酸标准溶液,在花蛤和海蛏的实际样品中进行 9 次加标平行试验,用峰面积的
3倍标准偏差进行估算,测得方法的检出限为 23. 5 ng /g,不仅远远低于国标 GB/T 5009. 198—2003[23]中
软骨藻酸的检出限 (1. 0 μg /g),而且与同类研究中软骨藻酸的检出限34 ng /g[14]、63 ng /g[11]、200 ng /g[22]
相比,本方法具有更低的检出限水平,说明本方法具有很高的检测灵敏度.
2. 5 精密度与回收率
实验选取花蛤与海蛏作为实际测量样品,在测定其本底值为未检出的基础上,分别对其进行了
3 个水平的加标回收率试验,结果如表 1 所示. 其中,花蛤的回收率为 93. 5% ~99. 8%,海蛏的加标
回收率为 116% ~120% . 以加标水平为 0. 3 μg /g 的实际样品进行 6 次平行试验,其相对标准偏差
(RSD)为 3. 5%,说明方法的精密度良好.
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集美大学学报 (自然科学版) 第 20 卷
表 1 贝类中软骨藻酸的加标回收率试验
Tab. 1 Recovery tests of domoic acid by adding standards in Venerupis philippinarum and razor clam(n = 3)
样品 Samples
加标水平 Adding standards /(μg·g -1)
A B C
测得值 Measuring value /(μg·g -1)
A B C
平均加标
回收率
Average recovery
by adding
standards /%
花蛤 Venerupis
philippinarum 0. 3 1. 0 1. 6 0. 27 ± 0. 03 0. 97 ± 0. 01 1. 60 ± 0. 02 96. 5
海蛏 Razor clam 0. 3 1. 0 1. 6 0. 33 ± 0. 02 1. 21 ± 0. 05 1. 87 ± 0. 03 119. 0
3 结论
本文建立了贝类中软骨藻酸的高效液相色谱检测方法,通过对提取方法的改进及色谱条件的优
化,有效解决了样品中复杂基质对软骨藻酸检测的影响,通过甲醇浸提再用 0. 5 mL 甲醇 -水 (V(甲
醇)∶ V(水)= 1 ∶ 1)进行重复提取,提取液可直接进样检测;通过对流动相体系乙腈 - 0. 2%磷酸
(含体积分数为 0. 1%三乙胺)(V(乙腈)∶ V(磷酸水溶液)= 12∶ 88)的优化,解决了基体中色氨酸对软
骨藻酸检测干扰的问题. 样品的平均加标回收率为 108%,检出限为 23. 5 ng /g,完全可以满足贝类
产品软骨藻酸的检测要求.
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第 4 期 高治昊,等:贝类产品中软骨藻酸的 HPLC检测方法
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(责任编辑 马建华 英文审校 曹敏杰)
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