全 文 ：记忆丧失性贝毒素—软骨藻酸的 HPLC方法检测
沈阳市铁西防疫站(110021) 张一兵
辽宁省食品卫生监督检验所 李 敏 刘 宁
大连理工大学 张 华 钟虹敏 罗丽梅
软骨藻酸(Domoic Acid , DA), 作为一种罕见的天然神经毒
性氨基酸 ,由它引发的食物中毒可引起呕吐 、腹泻神志不清 、记
忆丧失 、眩晕 、昏迷甚至死亡 ,根据这种新型贝毒与其它贝毒特
征的 差 别 , 被命 名 为记 忆 丧 失性 贝 毒(AmensicShell-
fishPoisoning , ASP)〔1 , 2〕。
为了保护人类免受 ASP 的侵害 ,对海产品中染毒贝类体
内的毒素(DA)进行有效的监测是非常重要的。 作为一种水溶
性毒素 , DA的小白鼠生物法检测极易与麻痹性贝毒素(PSP)
相混淆 ,高效液相色谱(HPLC)己被公认是检测 DA 的最有效
方法〔3〕。我们参考了国外文献报道〔4 ～ 6〕, 结合国内卫生监测
实验室的情况 , 建立了贝类体内 DA 的液相色谱/紫外检测
(HPLC/ UVD)方法。现介绍如下。
实验材料和方法 (1)实验器材:MX-119 型组织搅碎机
(Hunducky Inc., USA):LD4 -2 型离心机(北京医用离心机
厂);XW-80 型旋涡混合器(上海医科大学仪器厂):JA -
017V 型高真空保温瓶(台湾康丰实业有限公司);ED型超声波
清洗器(大连华洋科学仪器公司);Mode 15000DG 微量移液管
(Niehiry o Co.Ltd., Japan):UV -240 紫外扫描仪(岛津 , 日
本):LC-4A高效液相色谱配备SPD-2A 紫外检测器和 CR-
2B 数据处理器(岛津 , 日本):3ml容量 LC-SAX 柱(NO.5-
7017 , Supelco , I nc.):250mm×4.6mm 的 Techsptlere ODS 5uC18
高效液相色谱柱(Macclesfield Cheshire Skll 6P J , UK)。(2)实验
试剂。 ①溶剂:Milli-Q 纯水;色谱纯甲醇 、乙腈;分析纯三氟
乙酸。 ②0.5mo l/ L柠檬酸洗脱液(PH =3.2):40.4g-水合柠
檬酸和 14.0g柠檬酸三铵溶解于 400ml水中 , 加入 50ml乙腈 ,
完全混合溶解后 , 定溶至 500ml。 ③溶解稀释液:乙腈=1:9
(V/ V)。 ④DA贮备液和标准溶液:0.5mg 软骨藻酸(>90%)
(Sigma Chemieal Co.)溶解于 2ml稀释液中配成 250ug/ ml 的
DA 标准贮备液(标为 DA-A):取一定量的 DA-A 用稀释液
配制 25.0ug/ml、20.0ug/ml 、15.0ug/ ml、10.0ug/ ml和 5.0ug/
ml的标准工作溶液:此贮备液和标准溶液-30℃储存。(3)样
品处理:生鲜带壳或者冷冻后在室温下半解冻的样品 , 用刀切
开闭壳肌开壳取出贝肉 , 将可食部与中肠腺分离 ,放在网眼细
小的金属网上 , 沥水 5min , 沥水后的组织在组织捣碎机中彻底
匀浆 ,装瓶冷冻保存。(4)贝中 DA的提取及浓缩纯化:取 4.0g
匀浆贝组织 , 加入 16ml的甲醇/水(1:1 , V/V), 经涡旋振荡充
分混合后(约 5min ,), 超声提取 10min , 将混合液移入离心管
中 ,在不低于 4000r/ min 的条件下离心 10min 以上 , 使固液两
相彻底分开 ,移出上请液 , 冷冻保存。取上述提取液 5.0ml移
入依次经甲醇 、水 、甲醇/水(1:1 , V/ V)活化后的 XAX 柱上 , 待
液体以 1d/ s 的速度流出后 , 再依次用 5ml稀释液 、0.5ml洗脱
液以 1d/ s 的流出速度洗柱 ,弃去液体:再用 2ml洗脱液将吸附
在柱上的 DA 洗脱下来并收集作为 HPLC-UVD 分析液 , 1ml
溶液相当相当于0.5g样品。(5)LC-UVD 分析条件:流动相:
甲醇/水=22:78(V/ V)(PH=2 , 500ml含 0.5ml三氟乙酸):流
速 1.0ml/ min.;柱温:25℃, UVD波长:242nm:进样量 10μl。
结果和讨论 (1)方法原理及样品处理条件:到目前为止 ,
国外所报道的 DA-HPLC 检测方法主要有两大类 , 一是针对
海水和微藻中 DA 进行的甲氧基芴甲酸衍生化/ HPLC-FLD
(荧光检测)法〔4〕 , 这种方法虽因在 DA分子上引进了荧光基团
而使 FLD检测的灵敏度很高 , 但因操作烦琐且提取物中干扰
太多而不适用于贝类的检测:另一种方法是贝类样品被提取
后 ,经浓缩纯化再 HPLC— UVD 分析〔5 ～ 6〕 , 此法经不断的改
进 ,基本上能满足一般情况下贝类组织中 DA 的检测 , 我们就
是以这些方法为基础探索 DA 的 HPLC 分析条件。 ①提取溶
剂的选择:在早期的 DA-HPLC 分析方法中 , 对 ASP 的提取
一般根据其水溶性采用与 PSP(麻痹性贝毒素)相同的酸性水
溶液提取方法〔5〕 , 后来在实际操作中发现:DA 在酸性条件下
久置分解 , 不便于批量分析操作:提取液中存在着大量小分子
蛋白 ,对分析有干扰。我们采用甲醇和水的配比为 1:1(V/ V)
作为提取液 ,并在提取液和样品比为 4:1(V/W)的情况下铺以
超声提取。在 50ng ～ 250ng检测范围内的添加实验证明 , 这种
提取方法其回收率可高达 95%。 ②固相浓缩纯化柱的选择:
对贝体内 DA的食用安全性研究已发现 , 贝组织中 DA 量达到
40mg/kg时可引起食用者中毒 , 接近 150mg/ kg 对食用者有致
死危险 ,所以普遍认为可耐受的极限量为 20mg/kg〔7〕。我们通
过实验确定所用的 UVD对 DA 的最低检测量约为 10ng , 在一
般 10μl的进样量中要对 DA 进行有效的检测 , 则要求提取液中
DA 含量在 1.0μg/ ml以上 ,所以在耐受极限量(20ug/ g)的量级
检测贝体内的 DA , 需对贝提取液进行浓缩。固相提取(SPE)
是目前样品中待测成分不被破坏的最佳浓缩纯化技术 ,
M.A.Quilliam 等人分别探索了 SEP-PAK C18(Waters Associ-
ates Co.)阳离子SPE柱〔6〕和 LC-SAX阴离子 SPE 柱〔7〕对 DA
检测添加回收的影响 ,发现 SEP-PAK柱对 DA 的衍生化物有
较好的回收效果 , 但对 DA 的回收率仅能达到 75%, 而 LC-
SAX 柱则能使 DA 的回收最高达 99.9±2.4%(回收率±SD)。
我们选用 LC-SAX 作为浓缩纯化柱 , 除回收率较好(能达到
92%以上)外还发现 LC-SAX 的洗脱液中可能对 DA 造成干
扰的色氨酸明显少于 SEP-PAK 柱。(2)仪器条件的选择。
①检测波长:为了获得 DA 的最佳 UVD响应 ,我们先对 DA 在
常用的检测波长范围内进行了紫外扫描 , 图 2 是 10μg/ ml的
DA 标准溶液在 200～ 300nm 紫外吸收曲线 ,可见 242nm 是 DA
的最大紫外吸收波长 , 可作为最佳检测波长。 ②流动相:依据
DA 的分子结构 , 在贝类样品中最有可能对 DA 的 HPLC 分离
分析产生干扰的物质是与其性质接近的色氨酸等氨基酸 , 优化
色谱条件的目标之一是将 DA 与提取液中其他物质完全分离。
我们以色氨酸为分离对象所优化的色谱条件是:在 250mm ×
4.6mm 的 Techsphere ODS 5uC18高效液相色谱柱上 ,所选定的
流动相为 PH=2 的甲醇/水=22:78(V/V);流速 1.0ml/ min;
柱温:25℃。在此条件下所得的图像分别是:a-DA(200ng)标
323中国公共卫生 2000年第 16卷第 4期 CHINA PUBLIC HEALTH Vol.16 No.4 Apr 2000
准谱图:b-空白样品添加 DA(150ng/10ul)经提取后 SEP-
PAK 纯化后谱图;c-空白样品添加 DA(150ng/ 10ul)经提取后
LC-SAX 纯化后谱图。可见在选定的色谱条件下 , 色氨酸(T
峰)对软骨藻酸(D峰)基本上没有干扰。(3)方法学评价。 ①
低浓度检测的标准曲线:根据上述讨论 , DA 的检测量必须满
足耐受能力的极限量。为此我们在 50ng ～ 250ng检测范围内 ,
取5μg/ml 、10μg/ ml、15μg/ ml、20μg/ ml 和 25μg/ ml的标准 DA
溶液 10μl 进样 , 所得的 DA 量与峰面积的回归曲线为:y =
53.18x-197.2 , r=0.9997。可见此方法不仅其灵敏度可满足
卫生监督检测的需要 , 而且 UVD 对 DA 的响应具有较好的线
性。②实际检测的准确度与精密度:利用所建立的方法 , 我们
对 1998 年 9 ～ 10 月渤海赤潮重灾区的兴城芷锚湾南海和东海
的 6 份贝类进行了分析。 此样品虽然含有大量软海绵酸等腹
泻性贝毒素〔8〕 , 但没有 DA检出。为了验证我们方法的准确度
和精密度 , 我们对空白样品进行了不同量的添加 、重复实验。
分别在 4g 样品中添加 60μg 和 150μg 标准 DA , 按实验 1.4 和
1.5 的步骤操作 , 所测定方法的准确度和精密度结果见表 1。
表 1 实际测定的准确度和精密度
添加量
(μg/ g) 重复次数
测定值(μg/ g)
(C±SD)
回收率
(%)
C.V
(%)
15.0 6 13.86±0.52 92.4 3.75
37.5 6 35.54±1.46 94.8 4.11
实验结果表明:本研究所建立的 DA-HPLC/ UVD检测方
法 ,无论从检测的灵敏度还是准确度和精密度上都能满足极限
检测的要求。在我国能产生 DA的 Nitzschia spp 藻类有广泛的
分布 ,我们时刻面临着 DA 的威胁 , 本方法将可成为我们对海
岸 DA的分布状况进行调查的有利工具。
参 考 文 献
1. Quilliam et al.The amnesic shellfish poisoning mystery.Anal.Chem.
1989;61(18):1053A
2. Wrigh t et al.Domoicacid , a new shellf ish toxin:the Canadian Experi-
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3. S oames , et al.Shellfish poisoning public health risks , quality assurance
and analy tical detect ion.Chemistry in Aust ralia 1995;12:22
4. Pocklington R , et al.Trace determination of domoic acid in seaw ater
and phytoplank ton by high-performance liquid chromatography of
the fluorenylmethoxycarbonyl derivat ive.Int.J.Environ.Anal.Chem.
1990;38:351
5. Quilliam , et al.High-performance liquid chromatography of domoic
acid, a marine neu rotoxin , w ith application to shellf ish and plank ton.
Int.J>Environ.Anla.Chem , 1989;36:139
6. Quilliam , et al.Rapid ext raction and cleanup for liquid chromatography
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7. Leira , et al.Domoic acid levels of natu rally contaminated scallops as af-
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8. 刘宁,等.辽东湾赤潮污染海区贝类软海绵的染毒情况调查分析.
中国公共卫生 1999;15(3):209
(2000-03-01收稿 蔡天德编校)
紫外导数分光光度法测定水中硝酸盐氮
浙江省常山县卫生防疫站(324200) 徐青华
NO-3 -N 是水质监测的重要指标 , 测定方法有化学分析
法和紫外分光光度法。本文利用紫外双波长分光光度法获得
导数光谱曲线 ,来测定水中 NO -3 -N。 结果表明 ,该法准确度
和精密度良好 ,且可用普通紫外分光光度仪进行导数分析 , 操
作简便快捷。现报道如下。
方法原理 据文献〔1〕所载 , 设在波长λ及λ+Δλ时 , 输出
信号分别为 Sλ及 Sλ+Δλ,根据朗伯—比尔定律有 Sλ=IλDλe-ελCd
及 Sλ+Δλ=Iλ+ΔλDλ+Δλe-ελ+ΔλCd(式中 , Dλ、Dλ+Δλ分别为在波长
λ和Δλ处仪器函数;ελ、ελ+Δλ是待测组分在波长λ和λ+Δλ处
的摩吸光系数;c是待测物浓度;d 是液层厚度), 于是可以得:
lg= Sλ
Sλ+Δλ-lg
S′λ
S′λ+Δλ=(ελ+Δλ-ελ)Cd(1)。 其中 S′λ和 S′λ和
S′λ+Δλ分别是在该波长处空白输出信号。由式(1)可看出 ,输出
信号与待测浓度呈线性关系。
试验部分 (1)仪器与试剂:7520 紫外可见分光光度仪;
1.0mol·L-1盐酸溶液;NO-3 -N 标准贮备液 200μg·m L-1。
(2)试验方法:于 50ml比色管中 , 加入一系列 NO-3 -N 标准溶
液 ,加纯水至 50ml , 各加 1.0ml HCl溶液 , 摇匀。放置 10min 后
比色 , 以纯水为参比 , 1cm 直径石英比色皿 , 在 219nm 和
220nm 处测定输出值(透光度),利用式(1)算出导数值 ,绘制导
数曲线。样品操作方法同上。
结果与讨论 (1)波长选择:NO -3 -N 在 200 ～ 230nm 范
围内有吸收。由导数概念的本质就是变化率可知 ,在波长间隔
足够小时 ,可视为ΔI/ Δλ=dI/ dλ,保持 Δλ为 0.2nm ,则有 dI/ dλ
=ΔI/ 0.2 ,以波长为横座标 , 导数值为纵座标 , 在 215 ～ 220nm
范围有一宽峰 , 为避开 NO-2 -N 的干扰 , 本文选择 219 和
220nm 为测定波长 , 以导数值作为 NO -3 -N 的定量信息。试
验表明 ,波长间隔对导数值没有明显影响。为方便操作 ,本文
选择 Δλ=1nm。(2)HCL加入量试验:加 1mol·L-1 HCL酸化
目的是消除碳酸盐和氢氧化物的干扰 ,分别试验加 1、2、3 、5ml
HCL , 对透光度影响不大。本文选择 1.0ml HCL。(3)干扰试
验:Mg2+、SO 2-4 、K +、Na+、Ca2+、Fe3+、Cu2+、Zn2+、F -、Cl-等
离子存在对结果影响不大。如水样混浊 ,需加 ZnSO4 和 NaOH
混凝沉淀 ,取澄清液测定。(4)标准曲线回归方程:以 NO-3 -
N标准液的不同浓度与相应的导数值绘制标准曲线。试验表
明 ,在 0.1 ～ 2.0mg/ L 范围内 , Y =-0.0299X +0.0004(r=
0.9980)。(5)准确度和精密度:用本法对 5 份 NO -3 -N 含量
为 0.33 ～ 1.21mg·L-1的水样 , 分别加入 10 ～ 50μg NO-3 -N
后测定回收率 ,回收率在 97.3%～ 104.9%之间 , 平行样测定/
RSD0.11%～ 2.70%。另外用文献〔2〕法和本法分别测定 5 份
天然水样 , NO -3 -N 含量在 3.70 ～ 8.41mg·L-1之间 , 测得结
果经统计学分析:T=0.24
无显著差异。
(本文经岑福炎副主任技师指导 ,谨此致谢)
参 考 文 献
1. 王保宁.导数分光光度法.分析化学 1983;11(2):149
2. 俞克力.标准加入作图法测定水中硝酸盐氨.分析化学 1986;14
(6):446
(1998-11-29收稿 1999-08-10修回 宋艳萍编辑 蔡天德校对)
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