全 文 ：快速高分离度液相色谱法测定贝类中软骨藻酸残留量
吴映璇 , 林　峰 , 林海丹 , 邵琳智
(广东出入境检验检疫局 , 广州 510623)
摘　要:介绍了用快速高分离度液相色谱(RRLC)测定贝类中记忆丧失性贝类
毒素软骨藻酸的方法。样品以 V(甲醇)∶V(水)=1∶1的溶液提取 , 经 LC-SAX
强阴离子柱固相萃取净化 , 以 ZORBAX SB-C18柱(1.8μm , 2.1×50 mm)分离 , 乙
腈+0.1%三氟乙酸水溶液等度洗脱 , 1 min 内完成检测。用 RRLC外标法定量
分析。在 10 , 15 , 20 , 40 mg kg 4个添加水平下进行了验证试验 , 方法在 0 ～ 18
mg L 范围内有良好的线性关系 , 相关系数大于 0.999 , 回收率为 79.3%～
106%。
关键词:软骨藻酸;快速高分离度液相色谱法;固相萃取;贝类
　　软骨藻酸(domoic acid , DA)是一种天然神经性
氨基酸 , 可从被污染的贝类中分离 、提取获得 。人
们食用毒化的贝类 , 可引起记忆丧失 、眩晕 、昏迷
甚至死亡等。症状一般在 0.5 ～ 2 h 内出现。根据
这一中毒特征 , 该毒素被命名为记忆丧失性贝类
毒素 (amnesic shellfish poisoning , ASP)。目前对贝
类毒素中毒 , 尚无特效治疗的药 物 , 主要靠预防 ,
在毒素容易暴发的季节里(如每年的 4 、 5月份和
9 、10月份), 不吃或少吃贝类产品 , 来减轻或避免
贝类毒素中毒事件的发生。为了控制有毒的贝类
出口 , 扩大贝类的出口量为国家多创汇 , 我们国
家在各口岸对出口贝类的质量实施监控管理 , 避
免了贝类毒素超标造成的国际贸易间的纠纷 ,使有
价值的贝类大量繁殖 、出口 , 有效地保证了贸易
双方的利益和人类的健康。不少国家对其制定了
20 μg g 的限量标准 。目前测定贝类中软骨藻酸的
方法主要有高效液相色谱法(HPLC)[ 1 ～ 3] 、毛细管
电泳法[ 4 ,5] 、小白鼠生物学试验法[ 6] 、液相色谱-质
谱联用法[ 7 , 8] 等。本文采用快速高分离液相色谱法
(RRLC)技术建立了测定贝类中软骨藻酸残留量的
分析方法 , 在一分钟内完成检测 , 极大地提高了
分析速度。方法准确 、简便 、分析时间短 , 结果令
人满意 , 可应用于贝类中的实际检测工作。
1　实验部分
1.1　仪器与试剂
AGILENT 1200 快速高分离液相色谱仪(附
DAD检测器), 配置有二元输送系统 、自动进样系
统 、柱温箱 、色谱数据处理系统。Milli-Q超纯水器
(美国Millipore 公司);漩涡振荡器(德国 IKA);高
速离心机 , 转速≥8000 r min , (Sigma 4K15);可控
温摇床 , HZQ-Q(哈尔滨东联电子技术开发有限公
司);12通道半自动固相萃取装置;固相萃取柱:
3cc LC-SAX或其它等同效果的固相萃取柱 ,(使用
前依次用 6 mL 甲醇 、3 mL水 、3 mL 甲醇+水(1+
1 , 体积比)的溶液活化 , 保持柱体湿润)。甲醇 、
乙腈和甲酸为液相色谱级;三氟乙酸为优级纯 。
其他试剂均为分析纯(广州试剂厂)。记忆丧失性
贝类毒素软骨藻酸 (纯度 90%, Sigma公司)。
图 1　软骨藻酸的化学结构
1.2　色谱条件
色谱柱:ZORBAX SB-C18柱 , (1.8μm , 2.1×50
mm);流动相:V(乙腈)∶V(0.1%三氟乙酸水溶
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第 27卷增刊
2008 年 12 月　　　　　　　　　　　　 分析试验室Chinese Journal of Analysis Laboratory　　　　　　　　　　　　Vol.27.Suppl.2008-12
作者简介:吴映璇(1980-), 女 , 助理工程师;E-mail:allanwyx@126.com
DOI :10.13595/j.cnki.issn1000-0720.2008.0571
液)=13∶87 , 等度洗脱;流速 0.5 mL min;柱温:
60 ℃, 进样量:5μL;检测波长:242 nm;DAD检
测器光谱条件:检测波长:210 ～ 400 nm。以外标
法峰面积定量。
1.3　标准溶液的配置
称取记忆丧失性贝类毒素软骨藻酸标准品
1.0 mg于 10.0 mL容量瓶中 , 用乙腈+水(2+8)溶
解并稀释至刻度 , 此储备液浓度为 90 mg L。该储
备液置于 4 ℃冰箱中保存 , 保存期半年。
1.4　实验方法
1.4.1　样品制备　生鲜贝类:先用清水将贝壳外
表洗干净 , 然后切断闭壳肌 、开壳 , 用清水淋洗内
部去除泥沙及其它外来物。将闭壳肌和连接在结
合部的组织分开 , 仔细取出贝肉 , 切勿割破肉体 。
开壳前不得加热或用麻醉剂。将收集的 200 g 贝肉
置于网孔细小的金属网上沥水 5 min(注意不要使
贝肉堆积), 检出碎壳等杂质 , 将贝肉用组织粉碎
机捣碎 , 均分成两份 , 装入洁净容器内 , 作为试
样。密封 , 并标明标记 , 于-18 ℃保存。
冷冻贝类:在室温下 , 使冷冻的样品(带壳或
脱壳的)呈半冷冻状态 , 按上述方法开壳 、淋洗 、
取肉 、均质。
1.4.2　样品提取　称取已捣碎的试样 2 g (精确
至0.01 g)于 50 mL离心管中 , 加入 5 mL V(甲醇)
∶V(水)=1∶1涡旋混匀 1 min , 置超声波水浴中超
声振荡 5 min , 于可控温摇床中振荡 20 min , 以 8
000 r min离心 10min , 移出上清液至50 mL离心管
中 , 残渣加入5 mL V(甲醇)∶V(水)=1∶1再提取 1
次 , 合并上清液 , 用水定容至 15 mL , 混匀。
1.4.3　净化方法　取上述提取液 7.5 mL移入已
活化的 LC-SAX柱上 , 待液体以 1滴 s的速度流出
后 , 再依次用 5 mL V(乙腈)∶V(水)=2∶8的溶液 、
0.5 mL 0.1 mol L 甲酸洗脱液以 1 滴 s 的速度淋
洗 , 弃去流出液 , 最后用 3.0 mL 0.1 mol L甲酸洗
脱吸附在柱上的 DA , 收集流出液用 0.1 mol L 甲
酸定容至 3.0 mL 并于漩涡振荡器上混漩 30 s , 经
0.45 μm滤膜过滤后上机测定。
2　结果与讨论
2.1　色谱柱的选择
采用 1.8μm 小颗粒填料进行快速高分离液相
色谱分析大大提升了色谱柱的性能。另外 , 颗粒
度越小 , HETP 越低 , 柱效越高 , 分离度越好。本
文采用ZORBAX SB-C18柱(规格均为 1.8 μm , 2.1
×50 mm), ZORBAX XDB-C18柱 , Eclipse Plus C18
柱等 , 试验发现 ZORBAX SB-C18 柱 , ZORBAX
XDB-C18柱二者均可得到对称 、尖锐的峰形 , 但
ZORBAX SB-C18柱更适用于高酸性流动相 , 在低
PH值下 , 更具有最长的柱寿命和最好的重现性 ,
故本文选择ZORBAX SB-C18柱。
2.2　流动相的选择
在 Zorbax SB2C18柱上比较了常用的不同配比
的乙腈-水(含 0.1% TFA)和甲醇-水(含 0.1%
TFA)流动相体系 , 结果表明 , DA 的保留时间对流
动相的配比非常敏感 , 并且乙腈-水(含 0.1%
TFA)体系优于甲醇 2水(含 0.11%TFA)体系。选
择 V(乙腈)∶V(水 , 含 0.1% TFA)=12∶88 , 13∶
87 , 14∶86时 , DA色谱峰对称性大于 0.9 , 随着流
动相中乙腈比例的减小 , DA 保留时间增加 , DA
色谱峰对称性增强 。基于上述结果 , 最后选定
V(乙腈)∶V(水 , 含 0.1%TFA)=13∶87的溶液为
本方法的流动相。在此流动相下 , DA峰形的对称
性 、出峰时间 、均较理想 。
2.3　固相萃取(SPE)净化
SPE技术是目前纯化样品中待测成分的常用
有效方法 。我们在试验中发现 , 样品中的 DA经甲
醇-水提取后 , 能很好地保留在 LC-SAX 阴离子交
换柱上;用 5 mL 的 V(乙腈)∶V(水)=2∶8的溶液
能除去样品中的内源性杂质特别是色氨酸的干扰;
3 mL 0.1 mol L 甲酸溶液能完全洗脱 DA , 回收率
理想 。
2.4　线性关系及检出限
将一系列不同质量浓度的标准溶液依次进样
分析 , 在 0 ～ 18.0 mg L 范围内与其对应的峰面积
呈线性关系 , 相关系数大于 0.999 , 最低检出限为
1.8 mg kg 。
2.5　回收率与精密度试验
称取经测定不含有贝类毒素的贝类试样 2.0
g , 进行 10 , 15 , 20 , 40 mg kg 4种添加水平的回收
试验 , 每个添加水平平行测定 6个样品 , 方法的平
均回收率:79.3%～ 106%。指标符合国内外对残
留分析的要求 , 加标样品的色谱图见图 2。
2.6　RRLC方法和 HPLC方法的比较
2.6.1　分析时间的比较　我们曾经建立了记忆丧
失性贝类毒素软骨藻酸残留量的 HPLC 方法 , 分
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析保留时间为 7.3 min。而本研究建立的 RRLC 方
法其分析保留时间为 0.73 min 。在保证分离度的
情况下分析时间大大缩短 。
图 2　空白加标样品的色谱图
2.6.2　流动相溶剂消耗量的比较　记忆丧失性贝
类毒素软骨藻酸残留量的 HPLC 方法完成一次样
品分析的流动相溶剂消耗量为 8 mL (流速为 1.0
mL min), 而 RRLC方法完成一次样品分析的流动
相溶剂消耗量为 4 mL (流速为 0.5 mL min), 为
HPLC方法溶剂消耗量的一半。可见 , 采用 RRLC
方法可以在很大程度上节省溶剂消耗 , 这既降低
了分析成本 , 又减少了废液的排放。
3　结论
本文用甲醇-水提取 , 提取液经 LC-SAX 强阴
离子柱固相萃取(SPE)净化 , 供快速高分离液相色
谱仪测定 , 外标法定量 。方法简便 、快速 、准确 ,
方法的测定低限为 10 mg kg , 可用于贝类中记忆丧
失性贝类毒素软骨藻酸残留量的检测 。
参考文献
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