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基于四尾栅藻响应的有机磷农药生态风险评估



全 文 :中国环境科学 2013,33(5):868~873 China Environmental Science

基于四尾栅藻响应的有机磷农药生态风险评估
孙凯峰,王 娜,刘莉莉,段舜山* (暨南大学水生生物研究中心,广东普通高校水体富营养化与赤潮防治重点实验
室,广东 广州 510632)

摘要:以系统评价有机磷农药在水域生态系统风险为目标,采用批次培养的方法研究了草甘膦和毒死蜱两种有机磷农药在高浓度下的毒性
效应、低浓度下的刺激效应及微量条件下的无机磷替代效应.结果表明,草甘膦和毒死蜱对四尾栅藻(Scenedesmus quadricanda)的 96h EC50
值的分别为 12.98,2.02μmol/L.低浓度草甘膦(0.014~1.35μmol/L)条件下细胞密度和最大光能转化效率表现出了显著的刺激作用,最大促进
效应分别为 13%和 6.0%;草甘膦(0.40~0.67μmol/L)表现出显著的无机磷替代效应,而毒死蜱处理组未观察到刺激作用和替代效应.有机磷农
药对微藻种群变化的作用方式以低浓度下的刺激作用为主,同时可以引发无机磷不足时某些可利用有机磷种类微藻的种群增长.
关键词:草甘膦异丙胺盐;毒死蜱;刺激作用;替代作用;四尾栅藻
中图分类号:X592 文献标识码:A 文章编号:1000-6923(2013)05-0868-06

Ecological risks assessment of organophosphorus pesticides based on response of Scenedesmus quadricanda. SUN
Kai-feng, WANG Na, LIU Li-li, DUAN Shun-shan* (Key Laboratory of Aquatic Eutrophication and Control of Harmful
Algal Blooms of Guangdong Higher Education Institutes, Research Centre of Hydrobiology, Jinan University, Guangzhou
510632, China). China Environmental Science, 2013,33(5):868~873
Abstract:Ecological risks assessment of organophosphorus pesticides, glyphosate-isopropylammonium(Glyphosate IPA)
and chlorpyrifos, were conducted based on the chlorophyll a fluorescence of S. quadricanda in batch cultures. The dosage
response was hypothesized as toxic effect under high concentrations and stimulating effect at low concentrations, besides,
utilization of OPPs as sole phosphorus source were tested. The results showed median inhibitory effect concentrations of
glyphosate IPA and chlorpyrifos at 96h were 12.98 μmol/L and 2.02 μmol/L respectively. The cell density and the
maximum photochemical efficiency (Fv/Fm) were promoted significantly at low concentrations of glyphosate IPA
(0.014~1.35 μmol/L), moreover, glyphosate IPA could be used as sole phosphorus source to sustain growth of S.
quadricanda at the range of 0.40~0.67 μmol/L notably. However, such effects were not detected in chlorpyrifos treatments.
In conclusion, ecological risks of OPPs were dominated by significant stimulating effect in yield, meanwhile, dynamic
variation of algae community could be induced by organophosphorus pesticides at the deficiency of inorganic phosphorus.
Key words:glyphosate-isopropylammonium;chlorpyrifos;stimulating effect;substitution effect;Scenedesmus
quadricanda

据报道,欧盟 2008 年和中国 2005 年农药喷
洒量分别达到了 14万 t和 100万 t以上,然而经
济利益驱使下的不合理甚至是随意滥用导致的
农药残留却带来了严重的生态环境危害及食品
安全问题[1-3].有机磷农药随农业灌溉、雨水冲
刷、淋溶等过程进入构成水域生态系统门户的池
塘、河流等水体并对“非靶目标生物”作用相关
的研究已有大量报道[4-7].高浓度有机磷农药残
留对浮游植物的毒害作用可概括为:抗氧化系统
伤害、光合作用受抑制、胞内生化组分合成受阻、
遗传物质合成破坏等[8-10];而其对水生动物的毒
害作用则主要包括神经毒性、抗氧化系统损伤、
行为干扰等[11-13].有机磷农药对初级消费者浮游
动物的干扰作用间接导致了该生态系统浮游植
物群落组成和稳定性[8,14].同时,由于藻类耐受性
差异,有机磷农药直接作用浮游植物导致其群落
组成和结构的变化也能够影响生态系统的健康
收稿日期:2012-08-10
基金项目:国家自然科学基金资助项目(41176104, U1133003)
* 责任作者, 教授, tssduan@jnu.edu.cn
5期 孙凯峰等:基于四尾栅藻响应的有机磷农药生态风险评估 869

和稳定[15-17].另外,研究者也注意到了有机磷农药
刺激微藻生长这一现象并对其可能机理进行了
探讨[18-22].然而,蓝、绿藻的“藻华”暴发的诱导
因素及发生机理仍无统一定论[15,23-26].然而,淡水
生态系统中存在磷限制的传统观念也引起了对
有机磷类化合物作用的关注,尤其是在“藻华”
暴发区域和频率都不断增加的状况下.本文意在
模拟一次有机磷农药喷洒后经历的高浓度残留
阶段、稀释后的中等残留阶段以及吸附沉降后的
低浓度存在阶段三个自然过程,探索该过程中典
型微藻四尾栅藻的生理生态响应程度.进一步揭
示有机磷农药喷洒对水域生态系统中浮游植物
种群动态响应的生理机制,探索有机磷作为磷源
下藻类的生理过程变化差异并为有机磷农药生
态风险的科学、准确评估提供参考.
1 材料与方法
1.1 实验材料
实验所用的四尾栅藻(S. quadricanda)分离
自暨南大学明湖“藻华”过程,采用 BG-11培养
基培养,并保存于暨南大学水生生物研究中心藻
种室 .BG-11 培养基主要成分和含量分别是 :
NaNO3,K2HPO4,MgSO47H2O,CaCl22H2O,Na2CO3,
EDTANa2,柠檬酸,柠檬酸铁铵溶液,微量元素,其
工作液含量分别为 1.5,0.04,0.075,0.036,0.02,0.001,
0.006,0.006g/L.
实验用市售毒死蜱浓度为40%(博乐牌)、草甘膦
异丙胺盐浓度为 41%(农达).有机磷农药使用前配置,
实验中的药物浓度均按照P原子摩尔质量设定.
1.2 实验设计及培养条件
高浓度毒死蜱和草甘膦对四尾微藻生长的毒
性效应实验:参考藻类急性毒性试验要求,将处于指
数期的微藻接种到新鲜培养基中后分装到 150mL
三角瓶中,然后根据预实验结果,分别添加 6 个浓度
的农药后进行第二次分装.50mL 玻璃管(Schott
Duran, Germany)中分装 40mL 加药后的藻液,藻细
胞起始密度为(2.6~3.0)×105个/mL.草甘膦浓度设定
为 :2.95,5.90,11.80,23.59,47.19,94.37μmol/L;毒死蜱
浓度设定为:0.46,0.91,1.83,3.66,7.31,14.63μmol/L.每
组设 3个平行,并设不加药处理组为对照.
低浓度毒死蜱和草甘膦对四尾栅藻生长的刺
激效应实验:毒死蜱处理组藻细胞起始密度为
8.5×105个/mL,浓度设定为:0.021,0.214,2.14μmol/L;
草甘膦处理组藻细胞起始密度为3.8×105个/mL,浓
度设定为:0.014,0.135,1.35μmol/L.将处于指数生长
期的藻细胞浓缩后接种到不同浓度处理组中,然后
分装 150mL藻液到 200mL三角瓶中.每组设 3个
平行,并设不加药处理组为对照.
磷饥饿处理后四尾栅藻在毒死蜱和草甘膦
作为唯一磷源下的生长实验:将培养 14d 的四尾
栅藻离心(3000r/min,5min,24 )℃ 后重新接种到无
菌蒸馏水进行饥饿处理 3d,以消耗藻细胞体内储
存的磷.然后将藻细胞离心浓缩后接种到不添加
无机磷的BG-11培养液中,分装到500mL三角瓶
中加入相应浓度的农药.草甘膦浓度设定为:0.13,
0.27,0.40,0.54,0.67μmol/L;毒死蜱浓度设定为 :
0.03,0.06,0.09,0.11,0.14μmol/L.混匀后再次分装
150mL藻液到 200mL三角瓶中.每组设 3个平行,
并设不加药处理组为对照.
实验在人工气候培养箱(CC275TL-2H, Xutemp)
中进行一次性培养,光照强度 90μmol/ (m2s),温度为
(24±1) .℃每天早中晚采用微型漩涡混合仪(XW-80A,
江苏)连续震荡(2800r/min)混匀藻液,并随机更换玻
璃试管位置,以避免光照不均匀带来的影响.
1.3 观测指标
藻细胞数目:混匀后取样 100μL,加入到血球
计数板中,并在显微镜下计数全片.
藻细胞叶绿素荧光值:采用叶绿素荧光仪(TD-
700,Turner Design)测定.取样后进行20min的黑暗处
理,若浓度高于检测线则采用蒸馏水稀释后测定.
藻细胞最大光能转化效率(Fv/Fm):采用植物效
率仪(Handy PEA, Hansatech)测定.取样后进行20min
的黑暗处理,且测样过程也在黑暗条件下进行.
半数有效浓度(EC50):以浓度的对数值(log10)为
横坐标,抑制率的百分数为纵坐标绘制曲线,通过回归
分析获得相应的回归方程,并计算出半数有效浓度.
1.4 数据处理和分析
实验数据汇总和绘图 origin8.0,统计学分析
采用 SPSS 13.0进行线性回归(Linear Regression)
和单因素方差分析(One-way ANOVA),并采用
870 中 国 环 境 科 学 33卷

LSD进行多重比较.
2 结果与分析
2.1 草甘膦和毒死蜱对四尾栅藻的毒性效应
四尾栅藻培养液中添加有机磷农药草甘膦
和毒死蜱对其生长均表现出显著的剂量效应,农
药浓度的增加,四尾栅藻的叶绿素荧光值受到的
抑制效应显著增强(图1).处理组四尾栅藻叶绿素
荧光值受到的抑制程度与有机磷农药 P 原子浓
度(μmol/L)之间存在显著的正相关关系,除草剂
草甘膦和杀虫剂毒死蜱对四尾栅藻生长的 96h
EC50值分别为 12.98,2.02μmol/L.
2.2 草甘膦和毒死蜱对四尾栅藻生长和最大光
能转化效率的刺激效应

ck
2.95
5.9
11.8
23.59
47.19
94.37
0 1 2 3 4
100
200
300
400
0 1 2 3 4
100
200
300
400
500
y = 28.85x + 17.88
R2= 0.9723
0.7 1.4 2.1
20
40
60
80
y = 28.698x + 41.264
R2= 0.9710
0 0.5 1.0
20
40
60
80
100

绿




(g
/L
)
草甘膦 毒死蜱
ck
0.46
0.91
1.83
3.66
7.31
14.63
浓度对数值 浓度对数值
培养时间(d)
毒死蜱草甘膦



(%
)
培养时间(d)

绿




(g
/L
)



(%
)

图 1 草甘膦和毒死蜱(μmol/L)对四尾栅藻叶绿素荧光值的影响及急性毒性分析
Fig.1 Effect of glyphosate and chlorpyrifos (μmol/L) on fluorescence of chlorophyll a in S. quadricanda and the
inhibitory rate under series of concentrations (log C)
四尾栅藻培养液中添加低浓度草甘膦和毒
死蜱其细胞密度和最大光能转化效率变化如图
2 所示.添加低浓度草甘膦对四尾栅藻最大光能
转化效率和细胞密度均能够表现出显著的刺激
作用(图 2).低浓度草甘膦(<0.135μmol/L)对四尾
栅藻细胞密度表现出显著的刺激效应 .0.014,
0.135μmol/L 草甘膦处理组第 6d 的细胞密度分
别比对照组增加了 13%和 10%,表现出显著的刺
激效应(P<0.05).从最大光能转化效率上,草甘膦
也表现出显著的刺激作用,0.014 和 1.35μmol/L
草甘膦处理组第 6d的促进效应比对照组增加了
6.0%和 7.1%(P<0.05).低浓度毒死蜱对四尾栅藻
细胞密度仍表现出了显著的抑制效应(图2),而在
最大光能转化效率上,仅第 5,6d时处理组高于对
照组.2.14μmol/L 处理组 Fv/Fm 比对照组增加了
11.6%,表现出显著的刺激效应(P<0.05).
5期 孙凯峰等:基于四尾栅藻响应的有机磷农药生态风险评估 871


0 1 2 3 4 5 60
20
40
60
80
100
0
0.021
0.214
2.14
0 1 2 3 4 5 6 0
20
40
60
80
100
120
0
0.014
0.135
1.35
0 1 2 3 4 5 6
0.60
0.65
0.70
0.75
0.80
0
0.021
0.214
2.14
0 1 2 3 4 5 6
0.55
0.60
0.65
0.70
0.75
0.80
草甘膦
0
0.014
0.135
1.35
毒死蜱
草甘膦




( 1
05
in
d/
m
L)










毒死蜱
培养时间(d)培养时间(d)




( 1
05
in
d/
m
L)











图 2 低浓度草甘膦和毒死蜱(μmol/L)对四尾栅藻细胞密度和最大光能转化效率的影响
Fig.2 Effect of glyphosate and chlorpyrifos (μmol/L) on cell density and Fv/Fm in S. quadricanda under low
concentrations (μmol/L)

0 1 2 3 4 5 6500
1000
1500
2000
2500
3000
0 1 2 3 4 5 6 400
600
800
1000
1200
1400
1600
1800
0 1 2 3 4 5 6
0
0.1
0.2
0.3
0.4
0.5
0.6
0.7
0.8
0 1 2 3 4 5 6
0
0.1
0.2
0.3
0.4
0.5
0.6
0.7
0.8
草甘膦

绿




(g
/L
)
毒死蜱
培养时间(d) 培养时间(d)
草甘膦
0
0.13
0.27
0.40
0.54
0.67
毒死蜱









0
0.03
0.06
0.09
0.11
0.14
0
0.13
0.27
0.40
0.54
0.67
0
0.03
0.06
0.09
0.11
0.14

绿




(g
/L
)










图 3 磷饥饿处理后四尾栅藻在草甘膦和毒死蜱作为唯一磷源下的叶绿素荧光和 Fv/Fm变化
Fig.3 Fluorescence of chlorophyll a and Fv/Fm in S. quadricanda treated with glyphosate and chlorpyrifos (μmol/L) as
unique phosphorus in after phosphorus starvation in preculture
872 中 国 环 境 科 学 33卷

2.3 草甘膦和毒死蜱对磷缺失培养液中四尾栅
藻磷源的替代效应
经过无菌蒸馏水饥饿处理 3d的四尾栅藻接
种到草甘膦和毒死蜱作为磷源下的生理生长情
况如图 3 所示.四尾栅藻以草甘膦作为唯一磷源
下的叶绿素荧光值均高于对照组,0.4μmol/L 处
理组在第 4d比对照组增加了 30.8%,表现出显著
促进作用.但第 6d 的促进作用有所降低,仅为
18.0%(图 3).从 Fv/Fm变化上看,0.67μmol/L草甘
膦处理组显著减缓了 Fv/Fm的降低,第 2,4d分别
是对照组的 2.1 倍和 1.7倍(P<0.05).以毒死蜱作
为唯一磷源下的叶绿素荧光值在实验中也表现
出毒性效应,Fv/Fm仅 0.03和 0.06μmol/L处理组
第 1d比对照组增加了 5.2%和 16.8%(图 3).
3 讨论
有机磷农药多为磷酸酯类或硫代磷酸酯类,
基本构型以P原子为中心连接 4个取代基(R1、R2、
Z、X).其中,R1、R2 多为甲氧基(-CH3O)或乙氧基
(-C2H5O);Z 为氧(O)或硫(S)原子;X 为烷氧基、芳
氧基或其他取代基团.有机磷农药的毒性与其中
心P原子的电正性直接相关,取代基种类和结构通
过影响 P 原子电荷分布影响其毒性效应[7].同时,
有机磷农药直接或分解后被藻类利用所提供的营
养元素最主要的也是 P.因此,可以根据 P原子的摩
尔质量开展有机磷农药的生态效应研究.
有机磷农药在农业上的应用可间接导致水体
有机磷农药残留的增加,而水产养殖业中的有机磷
杀虫剂和杀菌剂的应用可直接导致水体的有机磷
农药污染.一次有机磷农药喷洒(0.15g/m2)可导致
水深 30cm,表面积 666.67m2水塘产生 1μg/L 的农
药残留[27].以磷酸酯类或硫代磷酸酯类经典的结构
式计算其最小分子量在 220左右,按照 P原子计算
一次农药喷洒后残留的有机磷农药残留量为
4.55μmol/L.有机磷农药对淡水微藻的急性毒性效
应尽管存在种间差异,但其急性毒性浓度范围多为
μmol/L数量级.本实验中选取的草甘膦和毒死蜱对
四尾栅藻的急性毒性 96hEC50 值分别为
12.98μmol/L 和 2.02μmol/L,毒死蜱毒性显著高于
草甘膦.这一现象从化学结构上看,毒死蜱取代基
可诱导 P原子产生高电正性,而草甘膦仅由甘氨酸
异丙胺盐取代了一个-OH;从作用特征上看,毒死
蜱类杀虫剂作用四尾栅藻主要是降低藻细胞体内
胆碱酯酶活性、产生抗氧化损伤、增加细胞膜通
透性等[8-9,19],而草甘膦主要作用于藻细胞内烯醇
丙酮基莽草素磷酸合成酶,通过抑制莽草素向苯丙
氨酸、酷氨酸及色氨酸的转化,使蛋白质的合成受
到干扰导致植物死亡[21-22].因此,草甘膦作用的专
一性也是限制其毒性强度的重要因素.
有机磷农药进入水体后的吸附和沉降导致其
浓度逐渐降低,有研究者发现一定浓度的有机磷农
药会刺激藻类的生长并可能诱发特殊条件下某些
种类微藻的“水华”.有机磷农药对微藻的刺激作
用表现在叶绿素和蛋白质含量增加、DNA和 RNA
合成速度升高、抗氧化系统活性增强,光合作用速
率提高以及营养盐吸收速率增加等[18-20].如:低于
22.7μmol/L的甲胺磷和 0.34μmol/L的辛硫磷能够
促进显著铜绿微囊藻(Microcystis aeruginosa)的生
长[23],5.2μmol/L 对硫磷显著提高了三角褐指藻的
生长速率[17].本研究中也进一步证实这一现象,添
加低浓度草甘膦能够显著促进四尾栅藻细胞密度
增加以及最大光能转化效率的升高,藻细胞密度和
最大光能转化效率的刺激作用最大值分别为 13%
和 7%.然而,本实验也发现毒死蜱在显著低于其
EC50浓度下仍未检测出刺激作用,这可能受实验选
取观察指标的限制或毒死蜱浓度设定的限制等.谢
荣等[19]在探讨丙溴磷对微藻刺激效应和毒性作用
的机理中提出了抗氧化系统响应程度差异引发不
同生理反应的观点,从污染物引发胞内活性氧含量
的程度差异以及引发脂质过氧化水平变化上揭示
有机磷农药的作用机制.然而,也有研究者认为藻
细胞可以通过利用有机磷作为磷源,进而促进藻类
的生长[24-25].辛硫磷浓度介于 67.1~ 335.2nmol/L条
件下可作为磷源维持滇池微囊藻的生长[23],铜绿微
囊藻在无机磷缺乏的条件下易成为优势种,而斜生
栅藻在无机磷充足条件下占优势[26].本实验中,草
甘膦能够较显著地弥补培养液中无机磷缺失对四
尾栅藻生长的限制,然而这仅局限在较短的时间内.
从最大光能转化效率上看,所有无机磷缺失条件下
的四尾栅藻光合作用均收到显著的抑制.毒死蜱对
5期 孙凯峰等:基于四尾栅藻响应的有机磷农药生态风险评估 873

培养液中无机磷缺失下四尾栅藻不仅没有促进作
用,反而表现出了抑制或毒害作用.
综合以上结果,有机磷农药喷洒后进入水体
的残留对水体初级生产者浮游植物的影响以低
浓度下的刺激作用为主.同时,某些种类的有机磷
农药可一定程度上作为磷源供藻类生长所需,即
可引发特殊种类微藻优势种的形成或“水华”的
暴发.另外,农药喷洒对初级消费者浮游动物种群
的毒害作用及由此引发的摄食压力降低在浮游
植物群落结构变化中的作用也值得关注.
4 结论
4.1 草甘膦和毒死蜱对四尾栅藻均表现出显著
的毒害作用,毒性强弱受 P原子电正性影响显著.
4.2 除草剂草甘膦能够显著刺激四尾栅藻的生
长和光能转化效率,其浓度为 0.014~1.35μmol/L.
4.3 四尾栅藻能够利用草甘膦作为唯一磷源,
表明草甘膦可刺激四尾栅藻生长.
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作者简介:孙凯峰(1983-),男,山东淄博人,暨南大学博士研究生,主
要从事环境污染物对浮游生物的生态毒性效应研究.发表论文 5篇.