全 文 ：第0 2 卷第 3期
9 9 2 4年6 月
湖 南 农 学 院 学 报
J o u r n a l o fH u n a nA g r ie u l t u r a lC o l l e g。
V o l
.
20N o
.
3
J u n e9 19 4
绒毛皂荚离体茎段培养及再生
植株的细胞组织学研究
郑 晴 霞 王 凤 翱
(湖南农业大学基础科学部. 长沙 , 4 1 0 1 2 8 )
[摘 要 ] 报道了绒毛皂英离体茎段培养中几种不同的成苗途径 , 并对其组织分化和器官发生进
行了细胞组织学研究 . 结果表明 : 以 M S 为基本培养基附加一定浓度的细胞分裂素 (6B A ) 和生长
素 (l B A )在短期内即可诱导带节茎段形成丛状苗 , 丛苗主要来源于腋芽萌发和腋芽基部分化 . 愈伤
组织在加有生长素的 M S 培养基中很容易从茎段切口产生 . 转移至 M S 附加 6B A 和 N A A 培养基
中能分化不定芽 . 芽原基起源于愈伤组织近表面的分生细胞团 . 生长到 1 . 5 c m 以上的试管苗可诱
导生根 ,生根培养基中须加入一定浓度的 IB A ·
【关键词 1 豆科 ;组织培养 ;培养基 ;愈伤组织 /绒毛皂英
I分类号 J Q 9 4 9 . 7 5 1 · 9
绒毛皂荚为国家 3 级保护植物 ,是湖南省的特有种 . 其材质优良 , 不易扭曲脆裂 ,其刺 、 果
可供药用 ;树形美观 、 树冠圆满 ,果实旋曲密被金黄色绒毛 ; 在阳光照耀下闪闪发光 , 因而常作
庭园绿化树种 , 目前在原产地仅存老树 2 株 , 其中 1 株已经衰老 , 部分开始腐朽 , 另 1 株属中
龄 ,但多年未见结实 . 拯救绒毛皂荚 这一濒危植物的繁殖方法现主要是采种育苗和嫁接 ,但种
子发芽率和嫁接成活率都比较低 ,组织培养可能为其快速繁殖提供一条新 的途径 .
1 材料和方法
材料 : 绒毛皂荚 ( G l e d i t s i a v e s t i t a C h u n e t H o w e x B . G . L . ) , 为长沙农校引种栽培多年的
乔木 .
方法 :取当年生幼嫩枝条 , 剪掉叶片 , 用 0 . 1%升汞溶液消毒 10 一 12 m in , 无菌水洗 5 次 ,
在无菌条件下切成 0 . 5 c m 长的带节和不带节茎段 ,然后接种至培养基中 . 材料也可置 4 ~ 8℃
低温下保存 3~ s d 后再接种 .
诱导丛状苗 、 生根等的培养基都以 M S 为基本培养基 , 附加了不同种类和浓度的激素 . 培
养基中蔗糖 (白糖 )含量 3 % ,琼脂 。 . 7% , p H S . 6一 5 . .8
培养温度为 ( 2 5士 3 ) ℃ , 每日光照 z o h , 光强约 2 0 0 0 ~ 3 0 0 0 I J x .
接种培养的外植体按不 同时间进行固定 ,固定液为 F A A ,用常规石蜡切片法切片 ,切片厚
度为 10 拜m ,铁钒一苏木精染色 , 显微观察摄影 .
收稿日期 : 1 9 9 3一 1 2: 2 4
DOI : 10. 13331 /j . cnki . jhau. 1994. 03. 009
第 2。卷第 3 期 郑晴霞等 绒毛 皂荚离体茎段培养及再生植株的细胞组织学研究
2 结果和分析
2
.
1腋芽苗的诱导增殖
将带节茎段接种到 M S 培养基中 , 附加不同浓度的激素 , 培养 20 d 后的结果列于表
表 1 不同激素对腋芽苗诱导和生长的影响
飞’ a b l e 1 T h e in 且t l e n e c o f 一J l a n t h o r m o n e s o n : h e fo r m a t io n o f f a s e i e l e d b u d ,
M S 培养基中的激素组合
(m g / L )
接种数 形成芽的总数 增殖率 (% ) 芽 生 长 状 况
0 2 4 4 0
.
1 7 二 ,单芽
I BA 0
.
5 25 5 0
.
2 0 上 ,单芽
6 B A 2 1 8 5 1 2
.
8 0 干 土二 ,单 , 丛芽
6 B A 5 1 4 4 5 3
.
2 0 牛 一 , 丛芽
6 B A 8 2 5 。 。 一团疏松愈伤组织
6 B A Z+ I B A 0
.
1 8 1 9 2
.
3 0 千 本二 去 ,单 ,丛芽
6 B A Z土 I B A 0 . 5 9 2 7 3 . 0 0 二 一 干 十 ,单 ,丛芽
6 B A Z+ N A A 0
.
5 14 2 4 1
.
, O 未 未 ,单芽多
从表 1 可 见 ,培养基中不加任何激素或单加入生长素都不利于腋芽增殖 . 一般只能看到
0
.
2 c m 左右的腋芽萌动而不能进一步生长 . 细胞分裂素在一定范围内可促进腋芽萌发 , 并能
形成丛芽 ,浓度过高则不能形成芽 . 6 B A 与 BI A 配合使用时形成的芽较粗壮 , 生长也迅速 ,而
且在加入其余生长素 ( N A A , 2 , 4一D 等 ) 时往往会诱导茎脱分化产 生愈伤组织 , 只有当加入
I B A 时 ,产生的愈伤组织极少 ,有利于腋芽增殖进行快速繁殖 , 有效地排除 了来 自愈伤组织的
分化等 .
.2 2 不定芽的诱导
2
.
2
.
1 愈伤组织的诱导
茎段 (带节或不带节 )在适宜的培养基中培养 3 d 即可见切口两端 明显膨大 , s d 后陆续产
生绿色致密的愈伤组织 , 有时茎段表面也产生愈伤组织 ,但结构疏松 ,颜色为乳 白色 . 从表 2 看
出 , 只要培养基中加入生长素 (最好是 2 , 4一 D ) 或生长素与一定浓度的细咆分裂素 , 即可大大促
进愈伤组织产生 ,诱导率几乎是 1 0 % .
表 2 激素对愈伤组织形成的影响
T a b le 2 T h e in f lu e n e e o f p la n t h o r m o n e s o n t h e e a ll u s f o r m a t i o n
M S 培养基的激素组合 ( m g / )L 接种数 愈伤组织诱导率 ( % ) 愈伤组织生长情况
0 2 4 0 仅 两 端 膨 犬
N A A 0
.
5 3 4 9 4 千
2
,
4
一
D 0
.
5 3 4 1 0 0 + 斗
6B A Z千 2 , 4一 D 0 . 5 2 4 1 0 0 山 十 +
6B A Z土 N A A 0 . 5 2 2 9 5 上 +
K T Z斗 2 , 4 一 D 0 . 5 1 2 1 0 0 去 丰
2
.
2
.
2 不定芽的分化
将取自 M S十 6 B A 2 m g / L + 2 , 4一 D 0 . 5 m g / L 培养基的愈伤组织 在转褐变老化前转入分
化培养基 中 , 40 d 后可看到愈伤组织表面产生瘤状 突起 (表 3 ) ,再经 10 d , 则突起表面有愈伤
i胡 南 农 学 院 学 报 9 9 1 4年 6 月
组织分化的丛芽 , 也有个别愈伤组织分化单生型芽 . 丛芽较纤细 , 生长缓慢 ,单生型芽较粗壮 ,
生长也迅速 .
有时 , 不定 芽可从外植体表面直接产生 ,
而不经愈伤组织阶段 ,这主要与培养基中激素
情况有关 , 一般在 加入 6 B A 和 2 , 4一 D 的培养
基中较易产生 有时未切下的幼嫩茎刺也能发
展为分枝的枝条 , 同时分枝的腋 内还有并排腋
芽长出 .
2
.
3 生根和移栽
当芽生长到 1 . 5 Cm 以上时可切下诱导生
表 3 激素对芽分化的影响
T
a b l e 3 T h e in f lu e n e e o f p la n t h o r m o n e s o n t h e
d if f e r e n e ia t io n o f a d v e n t i t io u s b u d s
M S 培养基中的激
素组合 ( m g / L )
芽的分化率
(写 )
6B A Z
6 B A Z上 N A A 0 .
6 B A 3
6 B A S
3 3
3 8
千
` 匕 牛
2 0
.
0
根 . 生根培养基为 M S + BI A 0 . 5 m g ,I/ 才 , 20 d 后开始生根 , 根数量一般为 3 ~ 5 条 . 将生根完整
的试管苗移栽至加入蛙石的土壤中 ,加盖保湿 . 可望成活 .
根据外植体的培养情况 , 总结绒毛皂荚快速繁殖的培养程序如下 :
丛 状 苗带节茎段
完整植株
节 间 段
不 定 芽 移 栽
2
.
4 茎段培养过程细胞组织学观察
带节茎段在适宜培养条件下培养 3 d 即可见腋芽萌动 , 至 10 d 看到叶腋处不断从形态学
上端向下端分化芽 , 形成纵 向排列一线的腋芽丛 (附图 ) .
茎段愈伤组织最早是从切 口处产生 . 切片观察表明 : 茎段 中各种活细胞均可启动 ,如表皮 、
皮层薄壁细胞 、 韧皮薄壁细咆 、 形成层 、 木薄壁细胞及髓细胞均可恢复分裂 ,参与愈伤组织的形
成 . 随着愈伤组织的进一步发育 , 内部出现多种组织分化 , 常见的有分生组织结节和维管束组
织结节 . 转入分化培养基后 , 在愈伤组织近表面不断有芽原基分化 , 即不定芽 的起源属 “ 外起
源 ” . 而不定根的起源则在愈伤组织深处 , 为内起源 .
3 讨 论
a
. 利用绒毛皂荚茎段进行组织培养时 , 试管苗可以通过 2 条途径获得 : 一是侧芽 (腋芽 )萌
发 ,二是由外植体或愈伤组织分化不定芽 . 利用侧芽繁殖 , 20 多天就能获得丛状苗 , 且一般认
为遗传性稳定 〔 3〕 . 而诱导不定芽分化 ,则分化时间长 ( 50 d 左右 ) ,分化率不高 ,变异性也可能要
大 . 本试验结果表明 , 利用绒毛皂荚带节茎段进行腋芽诱导增殖 ,是快速繁殖的一条较为理想
的途径 .
i胡 南 农 学 院 学 报 1 9 94年 6月
组织分化的丛芽 , 也有个别愈伤组织分化单生型芽 . 丛芽较纤细 , 生长缓慢 ,单生型芽较粗壮 ,
生长也迅速 .
有时 , 不定 芽可从外植体表面直接产生 ,
而不经愈伤组织阶段 ,这主要与培养基中激素
情况有关 , 一般在 加入 6 B A 和 2 , 4一 D 的培养
基中较易产生 有时未切下的幼嫩茎刺也能发
展为分枝的枝条 , 同时分枝的腋 内还有并排腋
芽长出 .
2
.
3 生根和移栽
当芽生长到 1 . 5 Cm 以上时可切下诱导生
表 3 激素对芽分化的影响
T
a b l e 3 T h e in f lu e n e e o f p la n t h o r m o n e s o n t h e
d if f e r e n e ia t io n o f a d v e n t i t io u s b u d s
M S 培养基中的激
素组合 ( m g / L )
芽的分化率
(写 )
6B A Z
6 B A Z上 N A A 0 .
6 B A 3
6 B A S
3 3
3 8
千
` 匕 牛
2 0
.
0
根 . 生根培养基为 M S + BI A 0 . 5 m g ,I/ 才 , 20 d 后开始生根 , 根数量一般为 3 ~ 5 条 . 将生根完整
的试管苗移栽至加入蛙石的土壤中 ,加盖保湿 . 可望成活 .
根据外植体的培养情况 , 总结绒毛皂荚快速繁殖的培养程序如下 :
丛 状 苗带节茎段
完整植株
节 间 段
不 定 芽 移 栽
2
.
4 茎段培养过程细胞组织学观察
带节茎段在适宜培养条件下培养 3 d 即可见腋芽萌动 , 至 10 d 看到叶腋处不断从形态学
上端向下端分化芽 , 形成纵 向排列一线的腋芽丛 (附图 ) .
茎段愈伤组织最早是从切 口处产生 . 切片观察表明 : 茎段 中各种活细胞均可启动 ,如表皮 、
皮层薄壁细胞 、 韧皮薄壁细咆 、 形成层 、 木薄壁细胞及髓细胞均可恢复分裂 ,参与愈伤组织的形
成 . 随着愈伤组织的进一步发育 , 内部出现多种组织分化 , 常见的有分生组织结节和维管束组
织结节 . 转入分化培养基后 , 在愈伤组织近表面不断有芽原基分化 , 即不定芽 的起源属 “ 外起
源 ” . 而不定根的起源则在愈伤组织深处 , 为内起源 .
3 讨 论
a
. 利用绒毛皂荚茎段进行组织培养时 , 试管苗可以通过 2 条途径获得 : 一是侧芽 (腋芽 )萌
发 ,二是由外植体或愈伤组织分化不定芽 . 利用侧芽繁殖 , 20 多天就能获得丛状苗 , 且一般认
为遗传性稳定 〔 3〕 . 而诱导不定芽分化 ,则分化时间长 ( 50 d 左右 ) ,分化率不高 ,变异性也可能要
大 . 本试验结果表明 , 利用绒毛皂荚带节茎段进行腋芽诱导增殖 ,是快速繁殖的一条较为理想
的途径 .
24 8 湖 南 农 学 院 学 报 1 9 94 年 6月
参 考 文 献
2
崔 微 . 植物激素与细胞分化及形态发生的关系 . 细胞生物学杂志 , 19 83 , 5 ( 2) : 1一 5
张王方 南蛇藤茎段培养中芽的形态发生 . 复旦大学学报 ( 自然科学版 ) , 1 9 8 6 , 25 (幻 : 1 51 ~ 1 56
M
u r a s
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·
p la n t p r o p a g a t io n t h r o u g h t i s , u e e u l t u r e s
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A n n R e v P l a n t P h v s io l
,
1 9 7 4
,
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1 3只一 1 6 6
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、
H A N U
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C h a n g s h a
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4 1 0 1 2 8 )
A B S T R A C T T h e M S b a s i e m e d i u m s u p P l e m e n t e d w i t h e y t o k i n i n ( 6 B A ) P l u s a u x in ( I B A )
g r e a t l y s t im u l a t e d t h e f o r m a t io n o t t a s e i e l e d b u d s
.
T h e e a l l u s l o r m e d i n t h e M S m e d i o m s u P
-
p l e m e n t e d w i t h a u x i n
, a n d t h e a d v e n t i t io u s b u d 、 d i f f e r e n t i a t e d i n M S + 6 B A Z ~ 3 m g / L
+ N A A 0
.
5 m g / L
.
T h e n e w g r o u t h o f p l a n r le t w a s e u t o f f w h e n i t r e a e h e d 1
.
5 e m i n h e i g h t
·
T h e n t r a n s t e r r e d t h e p l a n t l e t s in t o M S m e d iu m w i t h I B A 0
.
5 m g / L
, a n d t h e y b e g a n t o r o o t
a b o u t 2 0 d a y s l a t e r
.
K E Y W O R D S l e g u m i n o s a e ; t i s s u e e u l t u r e s ; e u l t u r e m e d i a ; e a l l u s / g l e d i t s ia