全 文 ：22 卷 1 期
2006 年 1月
生 物 工 程 学 报
ChineseJournal of Biotechnology
Vol.22 No.1
January 2006
Received:August 11 , 2005;Accepted:November 3 , 2005.
This work was supported by grant from National Science Foundation of Shaanxi Province(No.2003C108).
＊ Corresponding author.Tel:86_29_88303484;E_mai l:Jiajf38@nwu.edu.cn
陕西省自然科学基金项目(No.2003C108)和省重点实验室重点项目(No.05JS48)。
农杆菌转化的小冠花发状根的诱导及其植株再生
Hairy Root Induction and Plant Regeneration of
Crownvetch (Coronilla varia L.) Transformed by
Agrobacterium rhizogenes
韩晓玲 ,步怀宇 ,郝建国 ,赵宇玮 ,贾敬芬＊
HAN Xiao_Ling , BU Huai_Yu , HAO Jian_Guo , ZHAO Yu_Wei and JIA Jing_Fen＊
西北大学生命科学学院 ,西安 710069
College of Life Science , Northwest University , Xian 710069 , China
摘 要 利用野生型发根农杆菌 15834 菌株感染小冠花 15日龄无菌苗子叶和下胚轴切段 , 建立了高效的发状根培养及其体
细胞胚胎发生再生体系。发状根可直接从受伤的外植体表面产生 , 也能在外植体诱导的愈伤组织上发生 ,在无外源激素的MS
固体和液体培养基上 ,转化根能自主生长 , 表现出典型的发根特征。用适宜浓度的乙酰丁香酮处理对数生长期的农杆菌菌液
2h ,感染预培养 2d的子叶获得了最高的转化频率(87.4%)。在附加 0.2mg L 2 , 4_D , 0.5mg L NAA和 0.5mg L KT的 MS 培养基
上 ,发状根能 100%形成胚性愈伤组织 ,并于含 0.5mg L KT , 0.2mg L IBA和 300mg L 脯氨酸的 MS培养基上顺序经过体细胞胚
胎发育的各个典型时期 ,转换成完整植株。再生植株除具有发达的侧根外 , 其它形态特征与未转化植株未见明显的差异 , 但
在获得的 5个转化克隆中 , 其中 1个的发状根及其再生植株叶片中有毒物质 3_硝基丙酸的含量显著下降 , 分别为未转化对照
的 57.68%和 58.17%。冠瘿碱纸电泳检测和 rol B 基因 PCR扩增检测均证明农杆菌 Ri质粒上的 T_DNA已经整合到小冠花转
化细胞的基因组中。
关键词 小冠花 , 发根农杆菌 , 发状根 , 体细胞胚胎发生 , 植株再生
中图分类号 Q813.1 文献标识码 A 文章编号 1000-3061(2006)01-0107-07
Abstract An efficient system of genetic transformation and plant regeneration via somatic embryogenesis was established in
crownvetch (Coronilla varia L.)by infecting the segments of cotyledons and hypocotyls of 15d_old seedlings with Agrobacterium
rhizogenes strain 15834.Hairy roots were produced directly from the wounded surface of the explants or via calluses on hormone_
free Murashige and Skoog(MS)medium after infection by A.rhizogenes.Transformed roots grew rapidly either on solid or liquid
MS medium , and exhibited typical hairy root phenotypes.The highest transformation frequency (87.4%)was achieved by pre_
culturing cotyledons for 2d and pre_treating the A.rhizogenes with suitable concentration of acetosyringone at logarithmic phase
(OD600=0.8).The embryogenic calluses with 100% induction frequency were induced from hairy roots on MS medium
containing 0.2mg L 2 , 4_D , 0.5mg L NAA and 0.5mg L KT.Globular_ , heart_, torpedo_, and cotyledon shaped somatic
embryos were produced orderly and developed into plantlets when transferred the embryogenic calluses on MS medium
supplemented with 0.5mg L KT , 0.2mg L IBA and 300mg L proline.The transformed plants did not show differences in
morphology except abundant lateral root branches compared to the non_transformed plants.However , the contents of 3_
DOI :10.13345/j.c jb.2006.01.018
nitropropanic acid in hairy roots and leaves of one of 5 transformed clones were 57.68%and 58.17% in roots and leaves of
untransformed plants , respectively.Opine paper electrophoresis revealed the integration and expression of TR_DNA.PCR
analysis confirmed that the TL_DNA including 654 bp rol B sequence was inserted into the genome of transformed hairy roots and
their regenerated plants.
Key words Crownvetch , Agrobacterium rhizogenes , hairy root , somatic embryogenesis , plant regeneration
小冠花(Coronilla varia L.)为多年生豆科牧草 ,
也是优良的水土保持和草坪观赏植物 ,具有营养丰
富 、耐寒 、耐旱 、耐瘠薄 、耐覆土等优良性状 ,在我国
广泛种植[ 1] 。小冠花植株含有 3_硝基丙酸[ 2] , 若采
食过量可使单胃动物中毒[ 3] 。如何使其有毒成份含
量降低 ,获得低毒小冠花品种是育种的一项主要目
标。
农杆菌介导的遗传转化为高等植物品质和性状
的改良开辟了广阔的前景[ 4] ,与根癌农杆菌相比 ,发
根农杆菌介导的遗传转化有许多优点 , 如发状根为
单细胞起源 ,具激素自主型生长 ,不含 onc 基因 ,易
再生完整植株等[ 5] ,在植物基因工程及生产实际中
更具应用价值。目前已有上百种植物获得了发状根
转化植株 ,这些植株常表现出一些形态或生理生化
特性的变异 ,如烟草植株的矮化[ 6] 及多胺代谢的变
化[ 7] ,菊苣开花习性的改变[ 8] ,天竺葵观赏特性的改
良和芳香气味的产生[ 9] 等。展示出发根农杆菌介导
的遗传转化在植物性状改良及新的有益性状发现方
面的巨大潜力。
豆科牧草中已有苜蓿[ 10] 、红豆草[ 11] 和骆驼
刺[ 12]等有关发根农杆菌遗传转化并由转化根再生
的报道 ,然而几乎都是通过器官发生途径再生苗或
根的 。小冠花是一种体细胞胚胎发生能力较强的植
物 ,迄今为止 ,有关其遗传转化的研究尚未见报道 。
本文采用野生型发根农杆菌菌株 15834 ,转化小冠
花无菌苗子叶 、下胚轴 ,探讨了影响遗传转化的因
素 , 建立了高效的发状根遗传转化及体细胞胚胎植
株再生体系 ,为利用转基因技术改良其品质奠定基
础。
1 材料与方法
1.1 菌株及植物材料
发根农杆菌(Agrobacterium rhizogenes)菌株 15834
由本实验室保存。供试小冠花(Coronilla varaia L.)
种子由陕西省农科院牧草研究所提供。
1.2 方法
1.2.1 菌液的制备:将低温保存的菌株 15834接种
于含 250mg L 青霉素的 YMB 固体培养基上 , 28℃培
养。长出新菌落后 ,挑取单菌落 ,接种于 YMB 液体
培养基中 , 28℃, 120r min 振荡培养 14h , 4000r min
离心 8min ,收集沉淀菌体 ,用无激素的液体 MS培养
基[ 13] 悬浮 ,继续培养至一定的 OD600值备用 。同时
取 OD600值为 0.6的菌液 ,分别加入终浓度为 0 、20 、
50 、100μmol L的乙酰丁香酮 ,振荡培养 2h后用于感
染。
1.2.2 无菌苗的获得及受体材料的预培养:选取饱
满籽粒 ,用浓H2SO4 处理 20min ,自来水冲洗 ,70%乙
醇浸摇 30s , 再用 0.1%HgCl2 灭菌 15min ,无菌水洗
涤 6次 ,接种于无激素 MS培养基上 ,在(25±2)℃,
1200lx下光照培养 。15d 后 ,将无菌苗的下胚轴 、子
叶切成一定大小切段 ,置于无激素的 MS 培养基上
预培养 0 、1 、2 、4 、8d后用于转化。
1.2.3 发状根的诱导及培养:将预培养不同天数的
外植体浸入菌液中 ,15min后取出 ,用无菌滤纸吸干
多余菌液 ,放于原培养基上共培养 2d。再转入附加
500mg L 羧苄青霉素的无激素MS培养基上 , 25℃暗
培养 。同时接种未经感染的外植体于无激素MS 培
养基上 ,作为对照 。每 7d转接 1 次 ,且逐次降低抗
生素浓度 。切取除菌完全 、生长快速的发状根根段 ,
接种于无激素的 MS 固体或液体培养基中 , 25℃散
射光培养 ,每 20d转代 1 次。外植体在除菌培养基
上培养 25d后 ,统计转化频率。发状根的转化频率
(%)=(诱导产生发状根的外植体数 接种的外植
体数 )×100%。上述各试验每处理接种 3瓶 ,每瓶
接 20块外植体。
1.2.4 发状根愈伤组织的诱导及其体细胞胚胎发
生和植株再生:切取长约 3cm 的发状根 ,转入附加
0.2mg L 2 , 4_D , 0.5mg L NAA 和 0.5mg L KT 的 MS
培养基(蔗糖浓度 3%,琼脂 0.65%, pH 值 5.8 ～
6.2)上 。20d 后 ,挑取质地松软的愈伤组织于相同
培养基上继代培养 ,并在 Olympus实体解剖镜下定
期取样观察培养物的形态 ,待愈伤组织表面分化出
浅黄色 、颗粒状 、排列紧密的胚性愈伤组织后 ,转移
到诱导体细胞胚发生和植株再生的 MS + KT 0.5
mg L+IBA 0.2mg L +脯氨酸 300mg L+蔗糖 4g L
108 Chinese Journal of Biotechnology 生物工程学报 2006 , Vol.22 , No.1
培养基上 。苗高长至 6cm 以上 ,形成发达的根系
后 ,敞开瓶盖练苗 3d ,移至营养钵中保湿培养 。
1.2.5 发状根的冠瘿碱检测:分别称取 0.1g 鲜重
的发状根 、发状根产生的体细胞胚及其再生苗叶片 ,
加入 0.1mL 0.1mol L HCl ,充分研磨后 ,转入 1.5mL
离心管中 4℃浸提 2h。12 000r min离心 5min ,取上
清液 4μL 点样于新华 1号滤纸上 。以未转化苗的根
为阴性对照 ,甘露碱(mannopine)标准品(1mg mL)为
阳性对照 。参考 Tanaka等的方法[ 14] 并稍加改进 ,进
行纸电泳分析。300V电压电泳 90min ,小心取出滤
纸 ,热风风干 ,碱性AgNO 3染色拍照。
1.2.6 发状根 rolB 基因的 PCR 检测:按 CTAB
法[ 15]分别提取小冠花转化发状根 、发状根来源的体
细胞胚及其再生植株叶片和未转化植株根中的总
DNA。采用华美公司研制的裂解液提取质粒 DNA 。
提取方法:20μL 菌液中加入 40μL 裂解液 , 混匀后
94℃裂解 15min ,14 000r min离心5min ,上清液备用 。
Ri质粒 rolB 基因 PCR检测的上游引物为 rol_CGA
(5′GATATATGCCAAATTTACACTAG 3′),下游引物为
rol_CGT(5′GTTAACAAAGTAGGAAACAGG 3′)[ 16] , 由
大连宝生物技术公司合成。预期扩增产物大小为
564 bp 。PCR反应条件为 94℃变性 45s , 45℃退火
30s ,72℃延伸 45s ,循环35times ,72℃延伸 10min。扩
增产物用 1.2%琼脂糖凝胶电泳和 EtBr染色检测 。
标准分子量marker为 100 bp Ladder。
1.2.7 发状根及其转化植株叶片中 3_硝基丙酸含
量的检测:选取 5个转化克隆培养 28d 的发状根及
其55d龄再生苗的叶片 ,蒸馏水冲洗干净 ,精密称取
1.0g ,置于 50mL 具塞三角瓶中 , 加入 1mol L HCl
15mL ,25℃振荡提取 2h ,过滤 , 滤液于 4000r min下
离心 5min ,准确吸取 1mL 上清液 ,按汪儆[ 1] 等的方
法 ,在 530nm 波长下测定 3_硝基丙酸含量 。以未转
化外植体诱导的根及其再生苗的叶片为对照 。每样
品重复测定3次 。
2 结果与分析
2.1 发状根的诱导及培养
感染后的外植体接种于无激素的 MS培养基上
培养 4 ～ 5d后 ,有的外植体开始膨大 ,并在伤口处产
生白色愈伤组织 。10 d后 ,从这些愈伤组织上陆续
长出发状根(图 1 A , B)。出根部位多在外植体的形
态学下端 ,这可能与生长素的极性运输与分布有
关[ 17] 。有的发状根也能从感染外植体的伤口处直
接发生(图 1 C)。未经感染的子叶 、下胚轴在无外
源激素的培养基上不能产生发状根 。将 4cm 以上
的发状根切下 ,培养于无激素的MS 固体培养基上 ,
5d后发状根上产生分枝 ,生长速度明显加快;次级
发状根生长一段时间后 ,又产生很多分枝。旺盛生
长的发状根 20d可布满培养瓶的底部(图 1 D)。将
发状根转入无激素的液体培养基中振荡培养 ,亦表
现出良好的生长状态(图 1 E)。
图 1 小冠花发状根的诱导及培养
Fig.1 Induction and culture of hairy roots of C.varaia L.
A:hai ry roots induced from white callus of a cotyledon explant;B:hairy
roots induced from white calluse of a hypocotyl explant;C:hairy roots
direct ly emerging f rom a hypocotyl explant;D:20d old hairy roots in solid
MS medium without hormone;E:hairy roots cultured for 20d in hormone_
free liquid MS medium.
2.2 影响发状根转化频率的因素
2.2.1 外植体预培养时间对发状根转化频率的影
响:预培养不同天数的子叶和下胚轴在 OD600值为
0.8的菌液中浸染 15min ,培养 25d后统计结果如图
2所示 ,外植体预培养时间与转化频率有密切关系。
预培养 2d 的子叶和下胚轴转化频率最高 ,分别为
58%和 41.2%,未经预培养或预培养时间超过 4d转
化频率均较低 。子叶外植体似乎对预培养更敏感 ,
转化效果较好 。可见适当时间的预培养 ,能启动外
植体细胞分裂 ,使其处于良好的感受状态 ,有利于农
杆菌感染及 T_DNA 的整合与表达[ 18] 。这在其他一
些植物如骆驼刺[ 12] 和新疆雪莲[ 19] 的遗传转化研究
中也有类似的效果 。
2.2.2 菌液浓度对发状根转化频率的影响:将预培
养 2d的子叶和下胚轴分别浸入不同 OD600值的农杆
菌菌液中感染 15min ,培养25d后统计转化结果 。如
图 3所示 ,菌液侵染浓度对子叶和下胚轴转化频率
的影响均很大。在 OD600值为 0.0 ～ 0.8范围内 ,随
着菌液浓度的增加 ,转化频率几乎呈直线上升。当
OD 600为 0.8时 ,子叶和下胚轴的转化频率最高 ,分
109韩晓玲等:农杆菌转化的小冠花发状根的诱导及其植株再生
图2 外植体预培养时间对发根农杆菌 15834转化效率的影响
Fig.2 Effect of pre_culturing time of explants on
transformation frequency by A.rhizogenes 15834
别为 58.6%和42.4%。而 OD600高于0.8时 ,转化频
率逐渐下降 ,外植体褐化程度加剧。农杆菌的侵染
活力对转化效率影响很大 ,采用适宜的菌液感染浓
度 ,即对数生长期的农杆菌(OD600 0.8左右)进行感
染对提高转化频率是至关重要的。
图 3 发根农杆菌 15834 菌液浓度对转化频率的影响
Fig.3 Effect of concentration of A.rhizogenes 15834 on
transformation frequency
2.2.3 不同浓度乙酰丁香酮处理菌液对转化频率
的影响:在 OD600为 0.6 的菌液中 ,添加终浓度分别
为0 ,20 , 50 ,100μmol L的乙酰丁香酮(As),振荡培养
2h后 ,感染预培养 2d 的子叶和下胚轴切段 ,结果
(图 4)表明:20μmol L As处理能显著提高子叶外植
体的转化频率(87.4%),是未经 As处理的 1.49倍;
50μmol l As 处理下胚轴效果最好 , 转化频率为
72.0%,为对照的 1.68倍;高浓度 As处理并未进一
步提高转化频率 。表明As对小冠花遗传转化的促
进作用有一适宜的浓度范围。而且外植体的种类不
同 ,所需的适宜浓度亦有所差异。农杆菌侵染植物
细胞 ,首先要求 vir 基因的活化。As 是一些双子叶
植物受伤细胞释放的酚类物质 ,能诱导 Vir 区基因
的活化表达 ,促进T_DNA转移[ 20] 。当受伤外植体细
胞产生的酚类物质不足以诱导 Vir 基因活化时 ,添
加适量乙酰丁香酮能显著提高发状根的转化效率 ,
但是过量的 As对外植体有毒害作用 ,影响转化效
果[ 21] 。
图 4 乙酰丁香酮(As)浓度对转化频率的影响
Fig.4 Effect of acetosyringene concentration on
transformation frequency
2.3 发状根愈伤组织的诱导及其体细胞胚胎发生
和植株再生
将发状根各克隆切段分别在附加 1mg L 2 , 4_D
和 0.2mg L 6_BA的 MS培养基上培养 ,生长速度明
显减缓 ,根段的各部位脱分化形成乳白色松软的愈
伤组织 ,最后整个根段肿胀并愈伤组织化(图 5 A)。
继续培养 ,愈伤组织的颜色逐渐转为浅黄色或黄绿
色。20d后 ,其表面及内部形成米黄色颗拉状的胚
性愈伤组织(图 5 B)。这些胚性愈伤组织细胞小 ,
排列紧密 ,呈球形 ,诱导频率为 100%。将其转入附
加 0.5mg L KT 、0.2mg L IBA 、300mg L脯氨酸和 4g L
蔗糖的MS培养基上 , 5d左右可分化出球形胚(图 5
C),随后依次观察到心形胚(图 5 D)、鱼雷胚(图 5
E)、子叶胚(图 5 F),25d 后子叶胚转换成完整的再
生小苗(图 5 G),每克愈伤组织再生植株的平均数
为 21棵 。不断长高的植株 ,根部产生浓密的侧根分
支 ,表现出明显的发根特征 ,但其茎叶形态正常 ,与
未转化植株相比未见明显差异(图 5 H)。
2.4 发状根及其转化植株的冠瘿碱分析
发根农杆菌 TR_DNA 中存在冠瘿碱合成酶基
因 ,当TR_DNA在植物细胞基因组中整合和表达后 ,
能够在植物细胞中合成冠瘿碱。利用高压纸电泳技
术检测转化组织中冠瘿碱的存在 ,即可判断冠瘿碱
合成酶基因的转入[ 22] 。小冠花发状根 、发状根再生
植株叶片及其体细胞胚纸电泳分析结果均检测到甘
露碱的存在(图 6_2 ,3 ,4),而未经转化的对照根中没
有检测出阳性斑点(图 6_5),说明发根农杆菌 15834
质粒 TR_DNA上的冠瘿碱合成酶基因已转入发状根
组织中。
110 Chinese Journal of Biotechnology 生物工程学报 2006 , Vol.22 , No.1
图 5 小冠花发状根的体细胞胚胎发生及其植株再生。
Fig.5 Somatic embryogenesis and plant regeneration from A.rhizogenes transformed hairy roots of C.varia L.
A:callusing of a hairy root;B:an embryogenic callus derived from a hairy root;C:a globular embryo differentiated from
embryogenic callus;D:a heart_shaped embryo;E:a torpedo somatic embryo;F:cotyledon somatic embryo;G:a plantlet derived
from cotyledon embryo of hairy root;H:regenerated plants with abundant lateral branch roots.
图 6 小冠花发状根转化体中冠瘿碱的检测
Fig.6 Detection of opine in hairy root
transformants of C.varaia L.
1:standard mannopine;2:fresh hairy root extracts;3:extracts f rom
regenerated plant leaves of hai ry root s;4:extracts from somatic embryos
derived f rom hairy roots;5:extracts of non_transformed plant root;NS:
neutral sugars.;M:mannopine.
2.5 发状根转化组织 rol B基因的 PCR检测
Rol B 基因是发根农杆菌 Ri质粒 TL_DNA 上与
发状根形成密切相关的基因[ 23] ,利用 rol B 基因序
列设计的引物 ,能够从农杆菌 15834质粒 DNA 、小冠
花发状根及其体细胞胚和再生植株的总 DNA 中扩
增出 564bp的预期特异性片段(图 7_1 ,2 ,3 , 4),而未
经转化的植株根总 DNA中无此特异条带出现(图 7_
5)。证明TL_DNA 上的 rol B 基因已整合进小冠花
毛状根转化细胞的核基因组中 。
2.6 发状根及其转化植株叶片中 3_硝基丙酸含量
的变化
对冠瘿碱检测呈阳性和 rol B 基因 PCR扩增检
测呈阳性的5个转化克隆发状根及其再生植株叶片
中3_硝基丙酸含量测定结果如图 8所示 。与未转化
图 7 小冠花发状根转化体 rolB 基因 PCR产物的电泳分析
Fig.7 Profile of agarose gel electrophoresis of PCR products
of rolB gene transformed by A.rhizogenes in C.varaia L.
M:marker , 1kb DNA ladder;1:f ragment from Ri plasmid;2:fragment
from hairy root s;3:fragment f rom somatic embryos derived f rom hairy
roots;4:fragment f rom transformed plant;5:non_transformed roots.
的对照(CK)相比 ,TC1 、TC2 、TC4和 TC5四个转化克
隆中 3_硝基丙酸含量虽有一定的变化 ,但统计分析
未达显著 、极显著水平;而 TC3转化克隆的发状根
及其再生植株叶片中 3_硝基丙酸含量却大幅度降
低 ,分别为未转化根和再生植株叶片中 3_硝基丙酸
含量的 57.68%和 58.17%。
3 讨论
迄今为止 ,有关小冠花遗传转化的研究尚未见
报道 。本文采用野生型发根农杆菌 15834菌株感染
小冠花无菌苗子叶 、下胚轴 ,诱导产生了发状根 。发
111韩晓玲等:农杆菌转化的小冠花发状根的诱导及其植株再生
图 8 小冠花发状根及其再生植株叶片中 3_硝基丙酸含量
Fig.8 The contents of 3_nitropropanic acid in hairy roots
and leaves of transformed plants in C.varaia L.
状根在无激素培养基上能自主生长 ,表现出典型的
发根特征。这与发根农杆菌 Ri质粒 T_DNA 上携带
的 rol 基因和生长素合成酶基因(tms1 , tms2)有
关[ 24] 。
高再生能力的受体系统与转化方法的匹配是遗
传转化成功的关键[ 25] 。多数研究者把组培再生系
统和遗传转化系统孤立起来研究 ,由于这两个系统
在对外植体的处理上存在着很大的差别 ,因此一个
良好的组培系统不一定是一个优秀的遗传转化系
统[ 26] 。本试验直接以转化系统为平台 ,优化了转化
条件 ,获得了高达 87.4%的转化频率 ,并且通过高
频率(100%)的体细胞胚胎发生途径 ,从发状根中再
生出大量转基因植株 ,克服了以往组织培养再生体
系与遗传转化体系不能很好匹配的障碍 ,建立了农
杆菌介导的小冠花高效遗传转化体系。
在农杆菌介导的遗传转化中 , 由于T_DNA插入
植物基因组的位置 、长度和拷贝数千差万别[ 27] ,植
物感染部位就会产生在形态 、生理生化特性和次生
代谢产物含量等方面各异的发状根克隆[ 7 , 8, 9 , 28] ,这
些单细胞起源的变异克隆为新的优良性状的发现和
筛选提供了方便和可能。本实验所获得的有毒物质
3_硝基丙酸含量显著降低的发状根克隆 ,有望为低
毒小冠花品种的选育提供种质资源 。但其变异的机
理尚待进一步探讨。
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科学出版社生命科学编辑部新书推介
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113韩晓玲等:农杆菌转化的小冠花发状根的诱导及其植株再生