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天女木兰组织培养的抗褐化研究



全 文 :第 14 期
收稿日期:2011-10-18
基金项目:国家公益性行业(林业)科研专项(201004095)
作者简介:王 欢(1978-),女,吉林吉林人,讲师,在读博士研究生,主要从事野生植物保护与利用等方面的研究,(电话)18604498157
(电子信箱)wanghuan080799@sina.com;通讯作者,杜凤国,教授,(电话)0432-64608330(电子信箱)dfg4656@hotmail.com。
天女木兰(Magnolia sieboldii K. Koch)又名天
女花、小花木兰,为木兰科木兰属落叶小乔木,是第
四纪冰川时期幸存的珍稀植物,是国家重点保护的
易危植物和吉林省一级保护植物 [1],也是中国惟一
分布于东北地区的木兰科植物[2]。 它集观叶、观花、
观果于一身,同时全株含有芳香油,可以被用于提
取高级香料并具有很高的药用价值。
目前, 主要通过种子繁殖和扦插繁殖培育苗
木,但种子繁殖存在采种难、生理休眠的问题,扦插
繁殖存在生根慢及生根率低等问题 [3-6]。运用组织培
养技术是建立天女木兰无性繁殖的重要手段,不仅
能有效解决种源欠缺的问题,而且还能保留母树的
优良性状,快速繁育良种。 已有一些学者开展了天
女木兰的组织培养研究工作, 但存在繁殖系数低、
褐化及生根难等问题[7-9]。因此如何克服褐化成为天
女木兰组织培养快速繁殖成功与否的关键之一,而
关于天女木兰组织培养快速繁殖中的褐化问题研
究较少。 基于此,研究了外植体类型、外植体预处理
天女木兰组织培养的抗褐化研究
王 欢 1,2,杜凤国 2,张志翔 1,齐翠翠 2
(1. 北京林业大学生物科学与技术学院,北京 100083;
2. 北华大学林学院 /吉林省林业与生态环境重点实验室,吉林 吉林 132013)
摘要:从外植体类型、外植体预处理方法、培养基类型、抗褐化剂类型及培养条件等方面研究了天女木兰
(Magnolia sieboldii K. Koch) 组织培养过程中的褐化问题。 结果表明,B5培养基对防止外植体褐化效果
好,外植体在 MS 培养基中褐化严重。 外植体的取材部位与天女木兰的褐化程度密切相关,侧芽褐化率相
对较低,其次是顶芽,带芽的茎段褐化率最高。 在 B5+0.5 mg / L 6-BA+0.3 mg / L IBA 培养基中添加适宜浓
度的抗氧化剂、吸附剂有利于抑制天女木兰的褐化,抗褐化效果是聚乙烯基吡咯烷酮(PVP)>维生素 C
(VC)>活性炭(AC)。用 1 g / L VC 浸泡外植体 4 h 可有效减轻褐化。培养初期一定的低温和暗培养可以减
轻天女木兰的褐化。
关键词:天女木兰(Magnolia sieboldii K. Koch);组织培养;抗褐化
中图分类号:S792.99;Q943.1 文献标识码:A 文章编号:0439-8114(2012)14-3107-03
Study on Browning Controlling of Magnolia sieboldii in Tissue Culture
WANG Huan1,2,DU Feng-guo2,ZHANG Zhi-xiang1,QI Cui-cui2
(1.College of Biological Science and Biotechnology,Beijing Forestry University,Beijing 100083,China; 2.Jilin Province Key Lab. of Forestry
and Ecological Environment Forestry College, Beihua University,Jilin 132013,Jilin,China)
Abstract: Factors affecting browning problem of Magnolia sieboldii K. Koch including type of explants, pre-treatment of ex-
plants, medium, anti-browning substances and culture conditions were studied. The results showed that B5 medium could pre-
vent the explants from browning well while browning was serious on MS medium. The type of explant played an important
role in browning. The browning rate of lateral bud was the lowest, followed by terminal bud; and the browning rate of the
stem with bud was the highest. Soaking explants in 1 g / L VC for 4 h could alleviate browning effectively. Browning could be
restrained by adding antioxidant and absorbent at appropriate concentrationn in the medium B5+0.5 mg / L 6-BA+0.3 mg / L IBA.
The anti-browning effect ranked as PVP>VC>AC. Low temperature and dark cultivation at the early stage of cultivation could
relieve the browning problem.
Key words: Magnolia sieboldii K. Koch; tissue culture; anti browning
第 51卷第 14期
2012年 7月
湖北农业科学
Hubei Agricultural Sciences
Vol. 51 No.14
Jul.,2012
DOI:10.14088/j.cnki.issn0439-8114.2012.14.062
湖 北 农 业 科 学 2012 年
方法、培养基类型、培养条件及抗褐化剂类型等对
天女木兰组织培养过程中外植体褐化的影响,以期
为天女木兰组织培养快速繁殖提供参考,对挽救和
保护这个珍稀濒危树种也具有重要意义。
1 材料与方法
1.1 材料
试验材料为取自吉林市龙潭区江密峰苗圃的 8
年生的长势良好的天女木兰实生苗,分别在 3、4 月
初剪取天女木兰当年生健壮的休眠枝条,在室内水
培 7~10 d,待芽萌动膨大时再接种;在 5~7 月剪取
天女木兰新萌发的幼嫩枝条做试验。
1.2 方法
采用单因素试验, 每个处理接 10 瓶, 重复 3
次。 剪取带芽的茎段、顶芽和侧芽,放入洗洁精溶液
中浸泡 20 min,再用流水冲洗 2 h,然后在超净工作
台上用体积分数为 75%的乙醇对其表面消毒 30 s,
用无菌水冲洗 2~3次,然后用 1 g / L HgCl2处理 7~8
min,用无菌水冲洗 5~6次。 将 0.5~1.0 cm 的芽或带
芽的茎段分别接种到相应的培养基中。 如无特殊说
明, 培养基中均附加 30 g / L 蔗糖和 6 g / L 琼脂,灭
菌前 pH 5.8,培养温度为 23 ℃,光照采用自然光。
分别在接种的 7、15、30 d 观察褐化率和外植体生长
情况,所有试验数据均是培养 30 d 的统计结果。 褐
化率=褐化外植体 /接种外植体×100%。
1.2.1 不同培养基对天女木兰褐化的影响 设 6
个处理,所有培养基均添加 0.5 g / L 6-BA 和 0.3 g / L
IBA。这 6个处理分别为:①以 MS为基础培养基,附
加 8 g / L 琼脂;②以 1 / 2 MS 为基础培养基,附加 8
g / L 琼脂;③以 B5为基础培养基,附加 8 g / L 琼脂;
④以 1 / 2 B5为基础培养基,附加 8 g / L琼脂;⑤以 B5
为基础培养基,附加 7 g / L 琼脂;⑥以 B5 为基础培
养基,附加 6 g / L琼脂。研究不同培养基对天女木兰
褐化的影响。
1.2.2 不同外植体对天女木兰褐化的影响 春季
分别采用顶芽、带芽的茎段、侧芽 3 种外植体接种
于培养基 B5+0.5 g / L 6-BA+0.3 g / L IBA。 研究不同
外植体对天女木兰褐化的影响。
1.2.3 不同抗褐化剂对天女木兰褐化的影响 在
培养基 B5+0.5 g / L 6-BA+0.3 g / L IBA 中添加 0.5、
1.0、2.0 g / L 聚乙烯基吡咯烷酮 (PVP),0.25、0.50、
1.00 g / L 维生素 C(VC)和 0.5、1.0、2.0 g / L 活性炭
(AC)。 研究不同抗褐化剂对天女木兰褐化的影响。
1.2.4 不同培养条件对天女木兰褐化的影响 设
计 3种培养条件:①接种后于 15 ℃暗培养 7 d,转入
23 ℃于光下培养; ②接种后于 23 ℃暗培养 7 d,转
入 23 ℃于光下培养;③接种后于 23 ℃光照培养,光
照时间 12 h / d,7 d 后在 23 ℃、 光照时间 12 h / d、光
照度 2 000~2 500 lx 的培养室中继续培养。 研究不
同培养条件对天女木兰褐化的影响。
1.2.5 不同外植体预处理方法对天女木兰褐化的
影响 将天女木兰侧芽分别在 1 g / L PVP、1 g / L
VC以及清水中浸泡 4 h, 然后接种到培养基 B5+0.5
g / L 6-BA+0.3 g / L IBA 上。 研究不同外植体预处理
方法对天女木兰褐化的影响。
2 结果与分析
2.1 不同培养基对天女木兰褐化的影响
从表 1 可知,培养基对外植体褐化和生长有明
显的影响。 在 6 种培养基中,B5培养基对防止外植
体褐化效果好,MS 培养基中外植体褐化最为严重,
褐化率达 90%。 这可能是因为 MS 培养基中无机盐
浓度过高,尤其是 NH4+浓度高,易引起酚类物质的
大量产生,而盐浓度过高又会增加酶的活性,酶进
一步促进酚类物质的合成与氧化,从而导致外植体
的褐化。 固体培养基中琼脂浓度不同即培养基硬度
不同,抑制褐化的效果有一定差异。 培养基较稀时,
酚类、醌类物质容易渗入培养基,使培养基变为褐
色,同时使接触它的外植体也变为褐色,褐化严重;
培养基硬度较高时,培养基基本不变色,外植体大
多成绿色,褐化较轻。
2.2 不同外植体对天女木兰褐化的影响
外植体的取材部位与天女木兰的褐化程度密
切相关。 从表 2 可知, 侧芽褐化率相对较低,为
40.0%;其次是顶芽,褐化率为 46.7%;带芽的茎段褐
化率最高,为 63.3%,且出现褐化的时间早。 可能是
由于茎段切口面积大,使植物体内酚类物质大量流
出,在多酚氧化酶(PPO)的作用下发生了氧化,使外
植体易发生褐变。 顶芽和侧芽的褐化发生情况不
同, 可能是由于位置效应影响了植物的生理状态,
顶芽的物质代谢活跃,同时又由于不同位置内源激
素浓度不同,致使基因的表达不一致,从而形成不
同的生长状态。
表 1 不同培养基对天女木兰褐化的影响
处理






褐化率//%
90
80
33
75
40
46
外植体生长情况
不生长,褐化严重
生长缓慢,褐化严重
生长良好,褐化较轻,展开 2 片叶
生长缓慢,褐化严重
生长良好,褐化轻,展开 2 片叶
生长良好,褐化轻,展开 2 片叶
3108
第 14 期
2.3 不同抗褐化剂对天女木兰褐化的影响
在培养基 B5+0.5 mg / L 6-BA+0.3 mg / L IBA 中
添加适宜浓度的抗氧化剂、吸附剂等抗褐化剂有利
于抑制天女木兰的褐化。 由表 3 可知,抗褐化效果
是 PVP>VC>AC, 其中吸附剂 PVP控制褐化的效果
最好,且随着 PVP 浓度的升高,褐化率降低,试验得
出添加 1.0 g / L PVP 时褐化率最低,为 10.0%,且外
植体生长良好。 抗氧化剂 VC 和吸附剂 AC 也能控
制天女木兰的褐化,随着它们浓度的升高,褐化率
均降低,但浓度过高会影响外植体的生长;VC 浓度
须控制在 0.50 g / L 以下,且随培养时间的延长褐化
明显加重, 须及时转瓶;AC 的抗褐化作用不明显,
但 AC 作为一种无选择性的吸附剂, 在吸附培养基
中有害物质的同时还会吸附植物生长所需的营养
物质,当其浓度达到 2.0 g / L 时,虽然褐化减轻但严
重阻碍了外植体的生长。
2.4 不同培养条件对天女木兰褐化的影响
从表 4 可知,培养初期一定的低温和暗培养可
以减轻天女木兰的褐化程度,这可能与低温和黑暗
条件抑制了酶的活性和减少了酚类物质的氧化有
关。 暗培养对减轻褐化效果较明显,而低温对其影
响不大。 酚类物质在合成和氧化过程中,需要许多
酶的参与, 其中有一部分酶的活性是受光诱导的,
如 PPO 在光照条件下活性提高。 因此,暗培养可以
抑制酶活性, 从而减轻天女木兰外植体的褐化程
度。 在试验中发现,随着培养时间的延长,褐化现象
也随即产生,说明低温和暗培养只能在短时间内抑
制了褐化物质的产生。
2.5 不同外植体预处理对天女木兰褐化的影响
天女木兰芽在接种前采用抗褐化剂浸泡 4 h,
对抑制褐化有一定作用(表 5)。 两种药剂处理的褐
化率均低于对照(清水)。 用 1 g / L VC 处理效果较
好,褐化率为 20.0%,外植体长势好;用 1 g / L PVP
处理的褐化率为 36.7%。
3 小结与讨论
选择适宜的外植体是控制天女木兰褐化的有
效手段。 因为不同部位和生理状态的外植体中酚类
物质的含量及多酚氧化酶(PPO)的活性存在差异。
研究得出,以天女木兰侧芽为外植体,褐化程度较
轻。 这一结果和徐石等[9]的研究结果一致。
适宜的取材时间可减轻天女木兰的褐化程度。
由于在春季, 天女木兰植株体内代谢活动较弱,其
细胞内参与氧化反应的 PPO 活性较低,因此,在这
个季节取材褐化率较低; 将取材时间设置为 12 月
至次年 3 月的冬芽萌动时期,在一定程度上减少了
星花木兰等植株褐化的损失[10]。 周丽艳等[11]在白玉
兰组织培养的褐化控制研究中也得出了同样的结
论。
培养基中添加抗氧化剂、吸附剂可减轻天女木
兰的褐化程度。研究得出,聚乙烯基吡咯烷酮(PVP)
的抗褐化效果最好,其次是维生素 C(VC),再次是
活性炭(AC)。刘均利等[12]在木兰科华盖木组织培养
的褐化控制研究中也得出了同样的结论。 添加 1 g / L
PVP,褐化率最低,为 10.0%,且促进了外植体生长。
随着抗褐化剂浓度的升高, 褐化情况有所缓解,但
浓度过高会影响外植体生长,因此抗褐化剂的使用
浓度要适中。 而吸附剂则可吸附分泌到培养基中的
酚类、醌类物质,有效地防止此类物质所诱发的褐
变。
适宜的培养基可减轻天女木兰的褐化程度。 研
表 2 不同外植体对天女木兰褐化的影响
外植体
带芽的茎段
顶芽
侧芽
褐化率//%
63.3
46.7
40.0
外植体生长情况
生长较好,褐化严重,展开 2 片叶
生长良好,褐化较轻,展开 2 片叶
生长良好,褐化轻,展开 2 片叶
表 3 不同抗褐化剂对天女木兰褐化的影响
抗褐化剂
PVP
VC
AC
浓度//g/L
0.5
1.0
2.0
0.25
0.50
1.00
0.5
1.0
2.0
褐化率//%
16.7
10.0
10.0
26.7
20.0
16.7
30.0
23.3
20.0
外植体生长情况
生长良好,叶展开 2 片
生长良好,叶展开 2 片
生长缓慢,叶展开 1 片
生长良好,叶展开 2 片
生长良好,叶展开 2 片
生长缓慢,叶展开 1 片
生长良好,叶展开 2 片
生长良好,叶展开 2 片
生长缓慢,叶未展开
表 4 不同培养条件对天女木兰褐化的影响
培养条件



褐化率//%
33.3
36.7
46.7
褐化出现时间//d
13
12
7
表 5 不同外植体预处理对天女木兰褐化的影响
抗褐化剂
1 g/L PVP
1 g/L VC
清水(对照)
抗褐化剂浓度//g/L
1
1
褐化率//%
36.7
20.0
50.0
外植体生长情况
生长良好,褐化较轻
生长良好,褐化最轻
生长缓慢,褐化严重
(下转第 3118页)
王 欢等:天女木兰组织培养的抗褐化研究 3109
湖 北 农 业 科 学 2012 年
性农技推广机构正常的推广经费。
2.3.2 构建农业信贷体系 在现代农业的要素投
入中,资金是一种必不可少的要素,农业信贷资金
是农业资金要素中的重要组成部分。 积极探索“三
农”信贷体制改革,建立适应市场经济发展的政策
性、合作性和互助性“三农”信贷体系。 通过创新支
农方式,积极筹集资金,出台管理办法,召开专题会
议,通过财政以奖代补,加快推进农业信贷担保体
系建设。 拓宽农业信贷担保风险财政补助制度,是
财政支农资金的一项创新性工作。 通过财政资金补
助,将引导金融资本、民间资本、工商资本投入农业
领域,实现“小杠杆”撬动“大资金”,加快推进广东
省现代农业发展和新农村建设。 积极推进广东省首
创“政银保”合作农业贷款,由政府、银行和保险公
司合作推出的农业贷款新模式[9]。
2.3.3 鼓励民营资金投入 完善基层农技推广投
资体制和机制,鼓励民营资金投入,实现公益性和
经营性技术推广相结合,无偿服务与有偿经营相结
合,生产技术指导与市场营销相结合,集中示范与
推广普及相结合[10]。 按照“谁投资谁受益”的原则制
定相关优惠政策, 吸引民间社会力量投资资助、赞
助农技推广事业, 政府农技推广投资要渠道明确、
预算合理、增量保障、拨付及时,并纳人法制化轨
道。 引导和鼓励涉农企业等社会力量参与农技推
广,形成政府、企业、社会相结合的多元化、多渠道、
高效率的农技推广投入格局, 参与农业新品种、新
技术的引进、开发和推广工作。
广东省新农村建设任重道远,实现农业现代化
是全面建设小康社会的重要任务之一,完善和建立
多元主体、多层次的农技推广应用长效机制,开展
农技推广模式创新、 运行机制创新和投入机制创
新, 推进广东省新农村建设和现代农业体系建设,
为早日实现广东农业现代化提供坚实基础。
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(上接第 3109页)
(责任编辑 田宇曦)
究得出,B5培养基防止外植体褐化的效果最好。 MS
培养基抑制褐化效果最差,不适合作为天女木兰组
织培养的培养基。 不同培养基中盐离子浓度差异较
大,而盐浓度过高会增加酶的活性,酶又进一步促
进酚类物质的合成与氧化; 同时无机盐中的 Cu2+、
Mn2+参与酚类物质的合成, 是氧化酶的组成成分或
辅助因子,导致外植体的褐化。
适宜的培养条件能延缓天女木兰的褐化,这可
能是黑暗和低温暂时降低了 PPO 的活性,在一定程
度上降低了酚类物质的氧化,但一旦恢复到正常的
培养状态,其活性也随即恢复,又继续进行。 在试验
过程中,天女木兰暗处理比光处理效果好,较高的
培养温度和光照度能加速外植体褐化。
综上所述,以上单因素措施在一定程度上控制
了天女木兰的褐化程度,为了更好地控制天女木兰
的褐化程度,需要综合采取多种抗褐化措施。
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(责任编辑 张东华)
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