全 文 ：西北大学学报(自然科学版)
2006年 6月 , 第 36卷第 3期 , Jun. , 2006, Vo .l 36, No. 3
Journal o fNo rthwe st University (Na tural Science Edition)
　　收稿日期:2005-07-14
　　基金项目:陕西省自然科学基金资助项目(2003C108);陕西省教育厅重点资助项目(05 js48)
　　作者简介:韩晓玲(1963-), 女 ,陕西临潼人 , 西北大学博士生 ,从事植物细胞工程研究。
生命科学
小冠花高效体细胞胚胎发生与植株再生的研究
韩晓玲 ,王冰雪 ,林　雪 ,贾敬芬
(西北大学 生命科学学院 ,陕西 西安　710069)
摘要:目的　建立小冠花稳定高效体细胞胚胎植株再生体系。方法　采用植物离体组织培养技术 ,
通过优化外植体 ,基本培养基及其激素组合 ,提高体细胞胚发生和植株再生频率 。结果　子叶外植
体在附加 1.0mg /L 2, 4-D , 1.0mg /L NAA , 0.5mg /L KT和 100mg /L脯氨酸的 MSB培养基上 35d
100%形成体细胞胚 , 产生体细胞胚数量达 625个 /g, 在 MS +KT 1.0mg /L +IBA 0.1mg /L +脯氨
酸 300mg /L培养基上转换成完整植株的平均数为 21棵 /g。再生植株移栽成活率为 80%,其形态
特征和生长习性未见变异 。外源激素是体细胞胚胎诱导所必需的 , 2, 4-D是其中最关键的一种。
结论　建立了小冠花高频稳定高效体细胞胚胎发生和植株再生体系。
关　键　词:小冠花;体细胞胚胎发生;植株再生
中图分类号:Q813. 1　　文献标识码:A　　文章编号:1000-274Ⅹ (2006)03-0420-04
　　小冠花 (Co ronilla varia L)为多年生豆科牧草 。
具有营养丰富 、耐旱 、耐寒 、耐瘠薄 、耐覆土等优点 ,
为优良绿肥和水土保持植物[ 1] 。小冠花植株含有
3-硝基丙酸 [ 2] ,若采食过量 ,可使单胃动物中毒 [ 3] 。
如何使其有毒成分含量降低 ,获得低毒品种是育种
的一个主要目标 。用现代生物技术 ,尤其是与其他
无毒牧草之间的体细胞杂交 ,以及低毒或无毒突变
体筛选可能是实现这一目标的可行途径 ,而这些技
术的应用首先需要建立小冠花高效离体再生体系 。
豆科牧草中已有苜蓿 、骆驼刺高频再生的报
道 [ 9 ～ 10] 。有关小冠花组织培养也有少量报道 [ 4, 5] ,
但仍需缩短培养周期 ,优化培养基和培养条件 ,提高
再生频率。体细胞胚胎发生是提高离体培养植株效
率的一种理想途径 。本文以多变小冠花无菌苗子
叶 、下胚轴 、根为外植体 ,通过各种因素试验 ,建立了
小冠花高频体细胞胚胎发生和植株再生的实验体
系 ,为利用生物技术改良该牧草奠定基础 。
1　材料与方法
1. 1　植物材料
小冠花种子来自陕西省农业科学院牧草研究
所。
1. 2　无菌苗的获得
种子用自来水冲洗后 , 在 0.1%HgC l2中灭菌
10m in,再用灭菌蒸馏水冲洗 5次 ,然后接种在附加
2%蔗糖的 MS培养基 [ 6]上 。每日光照 12h,光照强
度 2 000 Lx,温度 25±2℃下培养 。
1. 3　愈伤组织诱导和体细胞胚胎的分化
取 10 d龄的无菌苗子叶 、下胚轴和根切成 3
mm大小的切段 ,分别接种在附加 1.0mg /L 2, 4-二
氯苯氧乙酸 (2, 4-D), 1.0mg /L 萘乙酸 (NAA),
0.5mg /L激动素 (KT)和 100mg /L脯氨酸的 MSB培
养基上诱导愈伤组织。MSB培养基的基本组成为
MS培养基的无机盐类和 B5培养基[ 7]的有机物质。
培养基蔗糖浓度为 2%,琼脂粉为 0.65%, pH值调
节至 5.8 ～ 6.2。培养条件同上。每个三角瓶接种
20块外植体 ,每种外植体接 4瓶 。培养 35 d后 ,观
察统计愈伤组织状态和体细胞胚胎形成数量 。
为了比较不同培养基对愈伤组织诱导和体细胞
胚胎发生的影响 ,将 10 d龄无菌苗子叶切块分别接
种在附加 1.0mg /L 2, 4-D , 1.0mg /L NAA和 1.0
mg /LKT的 MSB , MS, B5, SH培养基 [ 8]上 。同时比
较了不同植物激素对愈伤组织诱导和体细胞胚胎分
DOI牶牨牥牣牨牰牨牭牪牤j牣cnki牣xdxbzr牣牪牥牥牰牣牥牫牣牥牪牨
化的影响 ,取 10 d龄无菌苗子叶切块分别接种在表
3所列含 3种激素 、9种不同组合的 MSB培养基上。
以上每种处理均接 4瓶 ,每瓶 20块外植体 。培
养 35 d后 ,观察统计愈伤组织状态和体细胞胚胎形
成数量 。
1. 4　体细胞胚胎的发育和植株再生
体细胞胚胎的发育和植株再生是将子叶 、下胚
轴来源的胚性愈伤组织接种在附加 1.0 mg /L KT ,
0.1mg /L 吲哚丁酸 ( IBA), 300 mg /L脯氨酸和
1.0%活性炭的 MS培养基(以下简称体胚发育培养
基 )上 ,培养基的蔗糖浓度为 4%,其他培养条件同
上 。 30 d时观察统计植株分化数量和生长状况 。
2　结果与讨论
2. 1　不同外植体诱导愈伤组织和体细胞胚胎发生
的效果
　　在附加相同激素的 MSB培养基上 ,不同外植体
均可 100%的诱导出愈伤组织 ,但其形成速度 、形态
特征和体细胞胚胎形成数量有明显差别 (见表 1)。
根切段 10 d时已形成约 0.5 cm大小的愈伤组织 。
愈伤组织比较稀软 ,呈白色 ,生长缓慢 ,转入体胚发
育培养基上 , 30 d时未观察到体细胞胚胎发生 ,也
未见植株分化 。
下胚轴切段培养 7 d时即可形成 0.5 cm大小
的愈伤组织 ,起初较硬 ,随着培养时间的延长逐渐变
得松软 ,并由白色变为浅黄色或黄绿色 。 30 d后愈
伤组织表面陆续出现米黄色质地致密的小颗粒 ,即
球形胚。 35 d时 ,每克愈伤组织形成的体细胞胚数
量平均为 300个。转入体胚发育培养基上 ,球形胚
顺序发育成心形胚 、鱼雷胚 、子叶胚。继续培养成熟
的子叶胚伸根萌芽 ,转换成完整的小苗。 30 d时 ,
每克愈伤组织分化植株数为 7棵。
子叶外植体愈伤组织形成速度最慢 ,大约在接
种后 15 d方可形成 0.5 cm大小的愈伤组织。其质
地松软 ,呈乳白色或浅黄色 ,体细胞胚发生潜力大。
培养 25 d时 ,已有相当数量的球形胚出现。 35 d时
统计 ,每克愈伤组织上体细胞胚的数量多达 625个 ,
为下胚轴的 2.08倍 。转入体胚发育培养基上 , 30 d
后发育成植株的数量亦最多 ,每克愈伤组织最多可
再生 25棵小苗 ,平均为 21棵 ,是下胚轴的 3倍。这
说明子叶是小冠花体细胞胚胎高频率再生植株的最
适宜的外植体 。
表 1　不同外植体对愈伤组织状态及体细胞胚胎发生和植株再生的影响
Tab. 1　Effect of d ifferent explants on callus induc tion, somatic embryogenesis and plantlet regeneration of
Coronilla varia L
外植体 愈伤组织状态 诱导出 0. 5 cm大小愈伤组织所需时间 /d
体细胞胚形成数量
/个 g FW - 1
植株再生数量
/个 g FW - 1
子　叶 松软 ,透明 , 乳白色或绿黄色 15 625±62.51a 21±4.7a
下胚轴 浅黄色 , 质地较硬 7 300±20.67b 7±2. 2b
根 白色 , 稀软 ,黏稠 10 0±0. 00c 0±0.0c
　　*1:表中数据为 4次重复的平均值 ±SE
*2:数值后的不同字母表示差异显著性(P <0. 01), 下表同。
2. 2　基本培养基对体细胞胚胎诱导和植株再生的
影响
　　在附加相同外源激素 (1.0 mg /L 2 , 4-D , 1.0
mg /L NAA和 1.0 mg /L KT)的条件下 ,比较了 4种
基本培养基对子叶愈伤组织形成和分化的影响 ,结
果 (表 2)表明 ,不同培养基上愈伤组织状态 、体细胞
胚胎发生和植株分化数量差别很大。在 B5和 SH
培养基上 ,外植体脱分化不完全 ,愈伤组织生长缓
慢 。 B5培养基上诱导的愈伤组织表面长有绒毛 ,并
且有褐化现象。如表 2所示 , B5和 SH培养基体细
胞胚胎形成的数量和再生小苗的数量均较少 ,每克
愈伤组织上产生的体细胞胚数量分别为 75和 125
个 ,分化的再生植株为 6棵和 7棵。生长在 MS和
MSB培养基上的愈伤组织呈米黄色颗粒状 ,体细胞
胚形成频率高 ,再生植株数量大 。在 MS培养基上 ,
每克愈伤组织可形成 375个体细胞胚和 13棵小苗;
MSB培养基可分化出 550个体细胞胚和 19棵植株。
体细胞胚胎产生的环境与合子胚完全不同 ,需
要在离体条件下重塑与体内相似的环境 。前人的研
究表明 ,培养基中较高的渗透势 [ 9] 、高的总氮含量
和 /或高比例的还原态氮 [ 4, 11, 12]对体细胞胚胎发生
和发育有重要的促进作用 。本实验在高渗 、高氮含
量 、高比例铵态氮的 MS以及 MSB培养基上得到了
类似的结果。
—421—第 3期　　　　　　　　　　　韩晓玲等:小冠花高效体细胞胚胎发生与植株再生的研究
表 2　基本培养基对小冠花子叶愈伤组织体细胞胚
胎发生及植株再生的影响
Tab. 2　Effects of d ifferent basalm edia on the so-
maticembryogenesis and plantlet regenera-
tion of cotyledon-derived calli of Coronilla
var ia L
培养基
种　类
体细胞胚形成数量
/个 gFW - 1
植株再生数量
/个 gFW - 1
B5 75±7. 53d 6±2.2c
SH 125±10.05c 7±3.5c
MS 375±50.15b 13±3.9b
MSB 550±75.17a 19±3.8a
2.3　外源激素对小冠花体细胞胚形成与植株分化
的调控作用
　　3种激素 9种不同含量的激素组合对小冠花子
叶愈伤组织体细胞胚胎形成以及植株分化的影响差
异明显 (见表 3)。无任何外源激素 (No. 1)时 ,既不
产生愈伤组织 ,亦无体细胞胚胎和植株分化 。可见
外源激素是小冠花愈伤组织诱导和分化必不可少的
因素 。在 No. 2, No. 3和 No. 4组合中 ,不存在 2, 4-
D , 只有 NAA和 /或 KT,在这种情况下也不产生体
细胞胚 ,仅有少量不定芽或不定根 ,形成少量植株。
然而在 No. 5 -No. 9组合的培养基中 ,由于含有 2,
4-D ,均有大量体细胞胚胎发生。仅有 2, 4-D 1.0
mg /L(N o. 5)或 2.0 mg /L(No. 6)时 ,每克愈伤组
织产生的体细胞胚的数量分别达到 313个和 750
个。而 1.0 mg /L 2, 4-D与 1.0 mg /L NAA和 /或
0.5 mg /L KT配合使用 (No. 7 , 8, 9)时 ,均能得到较
多的体细胞胚 。说明 2, 4-D是诱导小冠花体细胞胚
胎发生最关键的生长调节物质 。值得提出的是 ,在
No. 9激素组合中 ,每克愈伤组织形成体细胞胚的
数量为 500个左右 ,虽没有 No. 6组合多 ,但每克愈
伤组织再生植株的数量却高达 22±2.5个 ,是 N o. 6
组合的 1.83倍。大量实验表明 , 2, 4-D对豆科植物
体细胞胚胎发生起主要作用 [ 13] ,本文结果进一步证
明了 2, 4-D在小冠花体细胞胚胎发生中起到关键性
的调控作用。
表 3　外源激素对小冠花子叶愈伤组织体细胞胚胎发生和植株分化的影响
Tab. 3　Effects of phytohorm ones on the somatic embryogenesis and plantlet d ifferentiation of coty ledon-
der ived calli
培养基序号
激素浓度 /m g L - 1 分化数量 /个 g FW - 1
2, 4-D NAA KT Adven titious budsAdventitious roo ts som a tic em bryo s P lantle ts
form a tion
1 0. 0 0. 0 0. 0 0±0. 0 0±0. 0 0±0.0 0±0.0
2 0. 0 1. 0 0. 0 0±0. 0 2±1. 0 0±0.0 0±0.0
3 0. 0 0. 0 0. 5 1±0. 2 0±0. 0 0±0.0 1±0.2
4 0. 0 1. 0 0. 5 2±0. 5 1±0. 2 0±0.0 2±0.6
5 1. 0 0. 0 0. 0 2±0. 4 0±0. 0 313±37. 50 15±2.4
6 2. 0 0. 0 0. 0 3±1. 6 0±0. 0 750±50. 13 12±3.1
7 1. 0 1. 0 0. 0 1±0. 9 1±0. 7 438±37. 55 13±3.6
8 1. 0 0. 0 0. 5 2±0. 7 1±0. 2 375±31. 33 16±2.3
9 1. 0 1. 0 0. 5 2±0. 3 2. ±1.0 500±62. 70 22±2.5
2.4　再生植株的壮苗与移栽
体细胞胚再生的小苗 ,在胚发育培养基上继续
生长 ,当小苗的高度达 6 cm时 ,敞开培养瓶盖练苗
一周 ,挑选根系发达 ,生长健壮的植株移栽到塑料盆
钵中保湿培养。移栽的小苗成活率为 80%,且生长
健壮。比较发现 ,再生植株的形态特征和生长习性
与实生苗基本相同 ,未见有明显变异 。
M oyer等人[ 4]在有关小冠花体细胞胚胎发生的
研究报道中 ,曾用下胚轴作外植体 ,在含 2, 4-D的改
良 B5培养基上诱导愈伤组织 ,经继代培养 ,在附加
椰子乳和肌醇的 Bo izy培养基上形成体细胞胚 ,并
通过生根培养基再生植株 ,达到 37.5%体细胞胚胎
发生频率 ,培养周期较长 ,程序复杂。本研究通过培
养条件的优化 ,以 10日龄无菌苗子叶为外植体 ,在
附加 1mg /L 2, 4-D , 1mg /L NAA , 0.5mg /L KT的
MSB培养基上 , 25 d诱导出体细胞胚 ,并在附加 1.0
mg /L KT, 0.1mg /L IBA , 300mg /L脯氨酸 MS培养
基上 30 ～ 45 d形成大量绿色幼苗 ,培养程序简单 ,
时间短(仅 65 d),形成的体细胞胚数量多 ,从而建
立了小冠花高频高效体细胞胚胎发生和植株再生体
系。
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(编　辑　徐象平)
A study on efficcient somatic embryogenesis and
plant regeneration in crownvetch
HAN X iao-ling , WANG B ing-xue, LIN Xue, JIA Jing-fen
(Co llege of L ife S cience, Northw est Unive rsity, X i′an 710069, China)
Abstract:Ami 　To estab ilish system of efficien t plan t regene ration via soma tic embryogenesis in crownve tch (Co-
ronilla varia L. ). Methods　Optim iza tion o f exp lant types, basalmedia, and hormone combina tion to increase fre-
quency som atic embryogenesis and p lant regeneration by using p lant tissue cultu re techno logy. Results　H igh fre-
quency (100%) o f som atic embryos w ith an average of 625 pe r gram fresh w eigh t o f emb ryogenic callus has been
obtained from co ty ledon-derived ca lli onmod ifiedM Smed ium con taining 1mg /L 2, 4-D, 1mg /L NAA , 0.5mg /L
K and 100mg /L pro linew ithin 35 d. Transfer of som atic embryos toM Smedium supplemented w ith 1.0mg /LKT,
0.1mg /L IBA , 300mg /L pro line and 1% ac tivated charcoal resulted in comple te plan t regeneration at high fre-
quency(100%)w ith an average o f 21 p lantlets pe r gram fresh we ight o f calli in 5 w eeks. Phy toho rmone w as nece s-
sary to induced ca llus and soma tic embryogenesis, and 2, 4-D play a key role in emb ryos induc tion. w hile KT,
NAA comb ined w ith 2, 4-D had an important improving effec.t The roo ted plantlets w ere successfully transferred to
soilw ith 80% su rv ivo r and the p lants show ed norma lmo rpho log ical and grow th characteristics. Conclusion　 H igh
efficient p lant regeneration via soma tic emb ryogenesis w as achieved in crow nvetch (Coronilla varia L)。
Key words:crow nvetch;som atic embryogenesis;p lantl regeneration
—423—第 3期　　　　　　　　　　　韩晓玲等:小冠花高效体细胞胚胎发生与植株再生的研究