全 文 ：中 国 药 科 大 学 学 报
J o ur n al of h C in ah Pr a m ac e ut i e al Un ir e s vir y 1990 ;2 1 (6 ): 34 5一 8 34 5
浙江贝母组织培养材料的染色体显微鉴定技术
高山林 赵爱平 , 徐德然
(遗传育种教研室 ; ’ 江苏省如东县中医院 )
摘 要 对浙江贝母组织培养材料进行了染色体显徽鉴定技术和方法的研究 . 通过对组培材料
的取材时间 、 预处理药剂的选择 、 浓度 、 时间 、 离析方法 、 离析药剂 、 浓度和时间以及不同取材部
位 (根尖 、 愈伤组织 、 芽尖 )的系统试验获得了较佳制片效果 , 表明本染色体显徽鉴定技术能较好地
用于贝母离体组织培养材料的鉴定 .
关健词 贝母 ; 组织培养 ; 染色体
染色体是植物遗传基因的主要载体 , 染色
休倍数性的变化是导致植物发生遗传变异的重
要途径川 , 据此我们应用组织培养技术进行人
工诱发多倍体 , 以提高药用植物有效化学成分
的含量和产量 . 本文报道了该研究的一部分工
作 , 即对组织培养材料进行染色体显微鉴定技
术的研究 . 国内外对贝母染色体做过研究报
道 12川 , 但都是取材于室外植株的根尖 , 而对
贝母组培材料的染色体制片技术未见报道 . 英
国 G o ul d 认为 , 对组培材料的染色体显微鉴
定中的制片技术需要有所改良刁能取得较好的
效果 15 . 为了探索贝母在离体组织培养条件下
的染色体显微鉴定制片技术 , 我们进行了取材
时间 、 预处理 、 离析方法及取材部位四个方而
的试验 .
最后统一用改 良苯酚品红染液染色 . 压片后用
奥林巴斯 B H 一2 显微镜进行观察并摄影 .
结果和讨论
材料与方法
试验 材料 为浙 江 贝 母 (rF l t “ la r必 t h u n一
加gr i M iq . ) 组织培养材料 , 总继代培养时间
为两年 , 培养室温度为 25 ℃ 土 1℃ , 侮天 12 h
光照 .
试验采用细胞学研究 中常用的压片法 16 ,
组织培养材料取材后分别用秋水仙碱 、 8一经
基哇琳溶液预处理 , 统一用冰醋酸一95 % 乙醇
(l : 3) 固定液固定 , 然后分别用酶或酸离析 ,
一 、 取材时间
于上午 9 时到下午 2 时每隔 l h 取材 , 经
蒸馏水洗三次后放人 0 . 2% 秋水仙碱中预处理
Z h
, 水洗三次后固定 Z h , 依次用 95 % 乙
醇 、 70 % 乙醇 、 蒸馏水各洗三次 . 在 60 ℃条
件下用 l m ol / L H CI 水解 10 m in , 水洗三
次 , 70 % 乙醇洗两次并保留于其中 . 最后取
根尖染色压片 , 在显微镜下观察染色休 .
对不同取材时间的每个根尖进行了有丝分
裂相前期 、 中期 、 后期细 胞数的统计 (见表
l)
, 并计算出不同取材时间征个根尖平均处 J屯
分裂相细胞数 , 从而判断最适取材时间 . 为 了
明晰起见 , 以取材时间为横坐标 , 平均征个根
尖分裂相的细胞数为纵坐标 , 绘制图 1 .
试验结果表明 : 取材时间以 1 时平均句
个根尖处于分裂相的细胞数最多 , 每个根尖可
以观察到 2 1 5 . 2 个分裂相 , l司时处于前期分裂
相的细胞比例较少 , 仅占 1 . 1% , 随着取材时
间的提前 , 处于分裂前期相的细胞数有增加趋
势 , 说明取材时间偏早 ; 尽管 1 1 时取材平均
每个根尖处在分裂后期相的细胞数也有 4 . 7%
19 90 年 4月 2 1[ 收稿 本研究为国家医药总局科研项目的一 部分
34 6 中 国 药 科 大 学 学 报 2 1卷
的比例 , 但此时取材平均每个根尖处在中期的
细胞数明显高于其他时间 , 所以综合起来看以
1 1 时左右取材为最适时间 .
二 、 预处理方法
T a b 1
.
C e ll n u m b“ in m i t o s i s i n d icf r e n t t im e o f e u t t i n g m a t e r ia l
iT m e
R O 0 t C e l l n . m b o r in m it o s is (A v e r a罗 , R a t io % )
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.
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e u t t in g m a 比 r ia l
于最适时间 1 1 时切取根尖 , 随机分成四
组 , 按以下四种方法预处理 . 然后均 固定 Z h
后用 95 % 乙醇 、 70 % 乙醇 、 蒸馏水冲洗 , 在
印℃条件下用 1 m o l / L H C I水解 10 m i n , 经
水洗后用 70 % 乙醇洗并保存于其中 , 供显微
观察 . 结果 :
,
.
0
.
1%秋水仙碱处理 6 h 染色休缩短适
宜 , 分散度也较好 , 染色休明晰可数 , Z n
= 2 4
. 见图 .2 1 .
2
.
.0 2% 秋水仙碱预处理 4 h 染色休缩短
较好 , 但分散度一般 , 染色休计数略难 .
3
.
.0 0 5% 8一经基咬琳预处理 4 h 染色
体仍细长 , 缩短不够 , 但分散度尚好 .
4
. 未预处理 染色休细 长而缠绕交叉 ,
分散度也差 , 因而难以计数 , 见图 2 . 2 。
尽管 0 . 1%和 .0 2% 的秋水仙碱预处理 的
效果相近 , 但是高浓度的秋水仙碱有可能使染
色体缩短过度或者在预处理过程中产生部分细
胞的多倍性 , 这样容易得 出错误的结论 , 因此
选用 0 . 1% 秋水仙碱溶液处理、 6 h 为宜 .
三 、 离析方法
于 1 1 时切取培养材料根尖 , 用 0 . 1%秋
水仙 液预处理 6 h , 用冰酷酸一 95 % 乙醉液固
定后随机分成四组 , 分别用 以下四种方法离
析 . 离析后均水洗 , 再用 70 % 乙醇洗并保存
于其中供染色休观察 .
1
. 用纤维素酶和果胶酶各 5% 的混合酶液
在 2 0℃条件下酶解 Z h 有部分细胞破碎 , 染
色休散在细胞外的现象 , 说明酶解过度 .
2
. 在 20 ℃ 条件下用 45 % 醋酸一 1 m ol / L
盐 酸 一 1% 硫 酸 ( 10 0 : 10 : l) 混合 酸 解 30
m in 细胞和染色休的分散都较好 , 染色体染
色较深 , 明晰可见 (见图 .2 3) 这是比较好的解
离方法 .
3
. 先用 3% 果胶酶在 20 ℃条件下酶解 3 0
m in
, 再在 60 ℃条件下用 1 m ol / L 盐酸水解
s m in 有部分细胞 破碎和染色体散失现象 ,
表明解离过度 .
4
.
60 ℃条件 下用 ! m ol / L 盐酸酸解 10
m in 效果 尚可 , 但与混合酸法 比较 , 后者不
仅解离效果好 , 而且春秋二季可以不加热 , 在
常温下进行 , 简便易行 .
在以上解离方法 一试验的基础上 , 又对混合
酸处理的适宜 !卜r间进行了一组试验 , 分成解离
3 0 m i n
,
4 0 m i n 和 6 0 m i n 三种处理 , 结果混合
酸解离 4 0 m in 的根尖 , 染色体分散性 也较
好 , 因此用混合酸解离 30 一 40 m in 均较为适
宜 . 具休选择时可随气温变化作些相应调整 ,
可望取得最佳制片效果 。
此外 , 由 J 几酶不仅价格吊贵 , 而且在 保存
6 期 高山林等 : 浙江贝母组织培养材料的染色体显徽鉴定技术 3 4 7
2一了
F应 9 2. M ier o s e op ie ob s er v az二 on
- 2l p 佗 tr c at mn et o fr 6 hw it h0
.
1 %
e ol c hie in e ; 2一 2. N op r et代 at m en t ; 2一 3. hyd r ol yZ e o fr o. s hw il m hix t`一r ed a cd i
- 24
.
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s e ; 2一 5. m et ap ha sc ; 2一6 . an ap ha` e ; 2一 7. [ el叩 ha s e: 2一8 . t wn o e w e el !s
34 8中 国 药 科 大 学 学 报 2 1卷
过程中对其活性难以控制 , 因此 , 在一般条件
下以选用混合酸解离为宜 .
四 、 取材部位
分别切取同一培养材料的根尖 、 芽尖及愈
伤组织块 , 经预处理 、 固定后在 60 ℃ 条件下
用 1 m of / L 盐酸解离 10 m in , 经水洗后在
20 ℃条件下用 2% 果胶酶解离 l h , 水洗后 用
70 % 乙醇洗并保存于其中 , 供压片观察 , 结
果见表 2 .
T a b 2
.
C e ll n u m be
r in m it o ` 15 in d i爪 er n t m a tC r i妞 l
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从表 2结果可见 :
1
. 根尖处于有丝分裂相的细胞数明显多
于芽尖及愈伤组织 , 因此在组织培养材料中 ,
进行染色体显微鉴定时 , 根尖仍然是首选材
料 , 尤其是选用幼嫩根尖 .
2
. 试验中所用的愈伤组织处于有丝分裂
期的细胞较少 , 其原因之一是已径发生了组织
分化 . 如果能注意选取未分化的幼嫩细胞团 ,
处于分裂相的细胞数可能会有所增加 . 愈伤组
织在组织培养中容易获得 , 可以作为组培材料
染色体鉴定的选材 , 这一点是室外植株染色体
鉴定中所不及的 .
3
. 芽尖材料中处于分裂相的细胞数也较
少 , 这可能与较难准确地切取到芽尖分生组织
有关 .
五 、 较佳的制片方法和步骤
综合试验结果 , 就贝母组织培养材料而
言 , 拟出较佳的制片方法和步骤 : 于 1 时切
取贝母幼嫩根尖 、 芽尖或幼嫩愈伤细胞团 , 经
蒸馏水洗三次后在 25 ℃条件下用 0 . 1% 秋水仙
碱预处理 6 h , 水洗后用冰醋酸一95 % 乙醇 ( 1
: 3) 固定 Z h , 再先后 以 95 % 乙醇 、 70 % 乙
醇 、 蒸馏水各洗三次 . 在 20 ℃条件下用 45 %
醋酸一 l m ol / L 盐酸一 1% 硫酸 ( 10 : 10 : 1)
酸解 30 一 40 m in , 蒸馏水洗三次 , 70 % 乙醇
洗并保存其中 . 显微观察前将处理好的根尖用
改良品红染液染色 15 一 20 m in , 压 片后在显
微镜下观察 . 如需长期保存可做成永久制片 .
我们按上述方法对浙江贝母组织培养材料
进行了染色休鉴定观察 , 有丝分裂各期 (前期 、
中期 、 后期 、 末期和子细胞形成 )的分裂相均获
得了较佳的显微观察效果汉图 .2 4一 9) 。
参 考 文 献
高山林 . 组织堵养在植物育种上的意义和应用 . 见 : 经济
植物纽织培养实用技术 . 南京 : 江苏科学技术出版社 ,
19 8 8: 9 8一 106
D a r l in g东o n C D , W y li七 A P . C h r o m o ` o m e a t la s o f fl o协
e r i
n g
. 尸勿月 Js 19 5 5 ; 3 5 8
S a r o
,
S uz u ka
. 翔山 x r o P白砚 hC r o用 0 5 0川亡 如励 e sr
18 7 5一 1 97 9
徐晋麟 , 李爆照 , 张林维等 . 三种贝母核型的比较研究 .
桂物分类学执 19 8 7 ; 书( l ): 7 7一吕8
G o u ld A R
.
S t a in in g a n d n p e lca r e y一o l o g y o f e u l t u r e d
c日15 . I:n ce l C . tI u陀 a耐 习口州姆 , cI 0 1 C u lt “ ,e 口厂尸勿月 st
19 84 ; 1: 6 9 8一 7 1 1
李国珍主编 . 染色体及其研究方法 , 北京 :北京科学出版
社 , 一9 8 5: 2
T e e h n iq u e o f C h r o m o s o m e M i e r o s e o P i e D e t e r m i n a t i o n
i n C u l t u r e d M a t e r i a l o f rF i t ila r i a th u n b e r g i i M iq
.
G a o S h a n l i n
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A cs r i e s o f e x pe ir m e n ts w e er e o n d u e te d w iht a v i e w to o b t a i n i n g g o o d cs P a r a t i o n o f c h r o m o so m e fo r m i
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a s th e ` x p e r i m e n ts o n t h e t im e o f e u t t i n g m a te ir a l, t h e sc le e t io n o f p er t r e a t m e n t
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ht e e o m p a r i阳 n o f d i fc cr n t e u lt u cr d m a t e r i a l . B a sc d o n t h e cr s u l t s o f e x p e r im e n t , a g o o d m e t h o d a n d p r oc e s s w a s
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