全 文 ：龙须菜藻红蛋白抗肿瘤活性的研究Δ*
陈美珍 ,葛安山 , 余杰 ,杨文杰
(汕头大学理学院生物系 ,广东 汕头 515063)
摘　要:目的 探讨龙须菜藻红蛋白抗肿瘤活性。方法 体内实验以 S180荷瘤小鼠为肿瘤模型 , 检测藻红蛋白
粗提物(CPE)对肿瘤生长的抑制作用以及对免疫器官的影响;体外实验采用 M TT 法检测不同浓度的藻红蛋
白(PE)对人宫颈癌 HeLa、人食道癌 EC109 和人血管内皮细胞等细胞的作用 ,流式细胞仪 、Annex in V-F ITC /
PI双荧光染色法观察藻红蛋白对 HeLa细胞周期及细胞凋亡的影响。结果 CPE 能显著的抑制小鼠 S180肉瘤
生长 ,当灌胃剂量在 100 ～ 300 mg kg - 1范围内时 , 呈量效关系 ,其中剂量为 300 mg kg - 1时 , 其抑瘤率达
49%,且能极显著地提高荷瘤小鼠的胸腺指数;体外实验表明 PE 对人宫颈癌细胞 H eLa 有明显的抑制作用 ,
其抑制率达 70%以上 ,并存在剂量依赖性。PE 可阻滞 HeLa细胞从 G2 /M 期进入 S 期 ,促使细胞凋亡。但
PE 对人食道癌 EC109 细胞无作用 ,对正常的人血管内皮细胞有一定的促生长作用。结论 龙须菜藻红蛋白
具有体内抑制 S180肉瘤生长的活性 ,体外对培养的不同细胞作用不同 , 对人宫颈癌 HeLa 细胞有较强的抑制
作用。
关键词:龙须菜;藻红蛋白;S180肉瘤;HeLa细胞
中图分类号:R931. 711 , R965　文献标识码:A　文章编号:1002-3461(2007)04-0027-05
Studies on antitumor activities of phycoerythrin from Gracilar-
ia lemaneif theormis
CHEN Mei-zhen , GE An-shan , YU Jie , YANG Wen-Jie
(Department of B iology ,Shantou Universi ty ,S hantou 515063 , China)
Abstract:Objective To investigate the ant itumor effects of phycoerythrin from Graci laria
lemanei f theorm is. Methods T he coarse phycoe ry thrin (CPE) was ig adm inistered to sarco-
ma180 mice , then the anti tumo r effect of CPE in vivo was evaluated by the inhibi tion rate ,
thymus and spleen indexes. The g row th inhibitory effect of phycoery thrin (PE) on cell lines
HeLa , EC109 , and vascular endo thelial in vi tro was examined w ith M T T assay . Influences
on HeLa cell cycle and apoptosis of PE w ere observed by flow cy tometry and annexin v-fi tc /
PI f luorescence staining . Results CPE exhibited inhibi to ry effect against sarcoma180 g row th in
mice at the do sage of 100 ～ 300 mg kg - 1w ith a fai r do se-effect relationship , and the inhibi-
to ry rate w as 49. 23% at the dosage o f 300 mg kg - 1 . CPE could also obviously increase the
weight o f thymus;PE could obviously inhibi t the g row th of HeLa cell in a dose-ef fect rela-
tionship , the inhibitory rate could reach more than 70%. I t could prevent the t ransfo rming
of HeLa cell cy cle f rom G2 /M to S phase to cause apoptosis. But PE couldnt inhibi t the
grow th o f EC109 cell , while some g row th stimulating effects of PE on vascular endothelial
cell w ere obse rved. Conclusion The PE from Graci laria lemanei f theormis could observably
inhibit sarcoma180 g row th in vivo. Effects o f PE on different cells in v itro we re dif fe r , but
show ed po tent inhibitory effect to HeLa cell.
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中国海洋药物杂志 2007年 8 月第 26 卷第 4期 Chin J Mar Drugs , 2007 August , Vol. 26 No. 4
* Δ基金项目:汕头市科技计划资助项目(2006-149)
　作者简介:陈美珍 ,女 ,副教授　Tel:0754-2902540;E-mai l:chenmz@s tu. edu. cn
Key words:Graci laria lemanei f orm is;phycoe ry thrin;S180 ;HeLa cel l.
　　研究表明 ,龙须菜粗蛋白含量占干重的
19. 14%,其中藻胆蛋白(Phycobiliprotein)约
占 29%,该藻胆蛋白以藻红蛋白(Phycoe ry-
thrin ,PE)为主(占 70%以上),经分离纯化
的藻红蛋白属 Ⅰ型 R-PE[ 1] 。虽然许多藻类
的藻红蛋白抗肿瘤作用以及作为光敏剂用于
辅助激光治疗癌症在国内外已得到广泛关
注[ 2 ～ 4] ,但龙须菜藻红蛋白抗肿瘤活性的研
究仍少见报道。作者前期研究发现龙须菜藻
红蛋白体外有清除自由基作用[ 1] ;藻红蛋白
粗提物能提高实验小鼠机体抗氧化 、抗突变
和免疫能力 ,对小鼠移植性肿瘤 S180的生长
有抑制作用[ 5 , 6] 。本文在原有对抗肿瘤作用
研究的基础上 ,进一步探讨龙须菜藻红蛋白
的体内外抗肿瘤活性 。
1　材料与方法
1. 1　实验材料
1. 1. 1 　材料 龙须菜:为 KF981 品系 ,
2006年 3月至 5月采自广东省南澳县 ,为人
工养殖 ,由汕头大学南澳海洋实验站站长林
元喜鉴定;
1. 1. 2　实验动物 KM 小鼠(由汕头大学
医学院实验动物中心提供),清洁级 ,(20±2)
g ,雄性。
1. 1. 3　细胞株 小鼠 S180腹水瘤细胞 、人
宫颈癌细胞 HeLa 、人食道癌 EC109 、人血管内
皮细胞(均购于中科院上海生物细胞研究所)。
1. 1. 4　药品 龙须菜藻红蛋白粗提物
(CPE),用新鲜龙须菜按文献[ 6]方法制备;
藻红蛋白(PE),由 CPE 经羟基磷灰石柱和
Sephadex G-100进一步分离纯化获得 ,其纯
度(A570 /A280)为 3. 76。
1. 1. 5　试剂 小牛血清(杭州四季青生物
工程材料有限公司);RPM I-1640培养液 、胰
蛋白酶 、MT T 、二甲亚砜(DMSO)(均为 Sig-
ma公司);环磷酰胺(CP ,上海华联制药有限
公司);四乙氧基丙烷(Fluka公司);Annexin
V-FITC / PI凋亡检测试剂盒(北京宝赛生
物技术有限公司);其余试剂均为分析纯 。
1. 2　实验方法
1. 2. 1　CPE抗肿瘤实验
1. 2. 1. 1　瘤细胞的培养
S180瘤细胞于 37℃, 5%CO2培养箱中 ,
用含 10%小牛血清的 RPM I1640 培养液培
养。收集对数生长期的 S180瘤细胞 ,用无菌
生理盐水离心洗涤 2次 ,然后小鼠腹腔接种
传代 ,7d后吸取小鼠腹水 ,显微计数 ,计算存
活率 ,用生理盐水稀释瘤细胞悬液使活细胞
数达 1. 4×107个 mL - 1 。
1. 2. 1. 2　CPE 对小鼠 S180肉瘤抑制作用
小鼠适应性喂养 3d后随机分为空白组 、
模型组 、CP 阳性对照组和低 、中 、高 3个剂量
给药组 ,每组 10只。除空白组外 ,各实验组
小鼠右前肢腋窝皮下接种 0. 2mL 的瘤细胞
悬液 。阳性对照组从第 1天开始隔天腹腔注
射 CP(20 mg kg - 1);各给药组分别灌胃给
予 CPE 100 , 200 , 300 mg kg -1 ,空白组和
模型组给予等体积(5mL)生理盐水 ,连续给
药 8d ,次日小鼠眼眶取血后马上解剖 ,剥取
肿瘤 ,胸腺及脾脏 ,称重 ,计算肿瘤抑制率以
及胸腺 、脾指数 。
肿 瘤 抑 制 率 (%) =
模型组平均瘤重 -给药组平均瘤重
模型组平均瘤重 ×100%
胸腺(或脾脏)指数 =[胸腺或脾脏重
(mg) /体重(10g)]
1. 2. 2 　MT T 法测定 PE 对 3 种细胞生长
的抑制作用[ 7]
分别取对数生长期的人宫颈癌细胞 He-
La 、人食道癌细胞 EC109 、人血管内皮细胞 ,
0. 25%胰酶消化 ,用含 10%小牛血清的 RP-
M I1640培养液调成细胞悬液 , 浓度为 5×
104个 mL -1 ,接种于 96 孔培养板中 ,每孔
200μL。于37℃, 5%CO 2培养箱中培养24h 。
然后洗去培养液 ,每孔加入 180μL 含 1%小
牛血清的 RPM I1640培养液 ,和不同浓度 PE
溶液各 20μL(剂量分别为:1. 25 , 2. 5 , 5 , 10 ,
20μg mL - 1),每个剂量设 6个平行孔 ,阴性
对照组加 20μL 无菌去离子水 ,培养 24h 和
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48h后取出 3 个平行孔 ,每孔各加入 20μL ,
5mg mL - 1的 MT T 溶液 ,继续培养 4h ,小
心吸弃上清液 , 加入 200μL , 37℃预温的
DMSO 液 ,震荡 10min ,酶标仪作双波长检
测 ,参考波长 630nm ,测定 570nm 处的吸光
值(A),重复 3次 。计算抑制率 。
癌细胞抑制率(%)=(1 -实验组 A 值 /
对照组 A值)×100%
1. 2. 3　流式细胞仪测定细胞周期[ 8]
HeLa细胞制成 2. 5×105个 mL -1的
细胞悬液 ,取 1mL 接种到 25mL 培养瓶中 ,
另加 2mL RPM I1640培养液 ,于 CO2培养箱
中培养 18h 使细胞贴壁 。吸弃培养液 ,无菌
PBS 洗涤 3次 ,加入 3mL 终浓度为 2. 5 、5 、
10 μg mL - 1的 PE作用液 ,同时设空白 ,继
续培养 48h。弃去 PE 作用液 , PBS 浸洗 2
次 ,收集细胞 ,加入 0. 25mL PBS 和 5mL 预
冷的 70%乙醇于 4℃下固定 12h ,离心 , PBS
洗涤除尽乙醇 ,离心后 PI 染色 30m in ,用流
式细胞仪检测各组细胞周期。
1. 2. 4　Annex in V-FITC / PI 双荧光染色
检测凋亡细胞[ 9 , 10]
选取对数期生长的 HeLa 细胞 ,常规消
化 , RPMI-1640 培养液制成 5 ×105个
mL - 1的细胞悬液。将盖玻片置于 6孔板中 ,
加入 2mL 10%小牛血清 、1mL 细胞悬液于
CO 2培养箱中培养 18h。细胞贴壁后小心吸
弃培养液 ,PBS浸洗3次 ,然后加入不同浓度
的 PE 溶液(2. 5 , 5 , 10 μg mL -1)3mL ,空
白对照组加 PBS ,继续培养 24 h 和 48h 。弃
去培养液 , PBS 洗涤数次 ,得细胞爬片。将
制备好的细胞爬片立即放入 Annexin V-
FITC / PI双荧光染色工作液中室温避光染
色 15min ,细胞面朝上放于载玻片上 ,荧光显
微镜观察拍照 。
Annexin V-FITC / PI双荧光染色工作
液组成[ 9] :
20μg mL - 1 的 Annexin V-FITC
10μL ,Binding Buffer 500μL , 50μg mL - 1的
Propidium iodide 5μL。
1. 6　数据处理
用 SPSS10. 0 统计软件 , 统计数据采用
均数±标准差( x ±s)表示 ,组间差别均采用 t
检验 。
2　结果与分析
2. 1　CPE 对小鼠 S180肉瘤生长的抑制作用
龙须菜藻胆蛋白粗提物对 S180小鼠瘤细
胞的生长有显著的抑制作用 ,并存在剂量效
应关系。当给药剂量是 300 mg kg - 1时 ,抑
瘤率达到了 49. 29%,见表 1。本实验结果与
张永雨等[ 6] 报道的龙须菜藻红蛋白粗提物 ig
给药剂量为 250 mg kg -1时 ,对 S180小鼠抑
瘤率达 44. 01%基本一致 。实验进一步证实
了藻红蛋白粗提物对小鼠 S180肉瘤具有较强
的抑制作用。
表 1　CPE 对小鼠 S180肉瘤生长的抑制作用和免疫器官脏器指数的影响( x±s , n=10)
Tab 1　Inhibition o f CPE on mice S180 sa rcoma g row th
组　别 剂量(mg kg - 1)
瘤重
(g)
抑瘤率
(%)
胸腺指数
(mg / 10g)
脾脏指数
(mg /10g)
空白组 - - - 20. 55±6. 51 54. 81±8. 18
模型组 - 1. 66±0. 43 - 17. 74±7. 29 40. 84±9. 87
CP 对照组 20 0. 81±0. 27** 51. 08 12. 23±4. 87** 44. 76±9. 68
CPE低剂量 100 1. 31±0. 27△ 21. 48 21. 18±10. 44 43. 09±7. 83
CPE中剂量 200 1. 03±0. 17△△ 37. 83 24. 28±7. 33△ 44. 58±4. 81
CPE高剂量 300 0. 84±0. 23△△ 49. 29 24. 50±7. 16△△ 45. 2±11. 69
　注:△P<0. 05 , △△P<0. 01 , **P<0. 01 vs model g roup
　　由表 1 可见 ,小鼠接种肉瘤 S180后其免
疫器官萎缩 、重量下降;阳性药物 CP 在抑制
肿瘤的同时 ,也抑制了免疫器官 ,其胸腺指数
显著减少;而给予 CPE的各剂量组胸腺指数
和脾指数都有所增加 ,其中胸腺指数增加显
著 ,文献报道 CPE 能有效增强小鼠腹腔巨噬
细胞的吞噬能力 ,刺激小鼠胸腺和脾脏器官
的发育[ 5] 。这提示了 CPE 的抗肿瘤活性可
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能是通过提高荷瘤小鼠的免疫功能等作用得
以实现的 。
2. 2　PE 对 3种细胞株体外生长的影响
结果如表 2。对表 2 中 PE 的浓度与
HeLa 细胞的抑制率的关系作图得到作用
24h和 48h的回归方程及相关系数分别为 y
=0. 90x +47. 10 、r=0. 93和 y =0. 62 x +
58. 55 、r=0. 97。
表 2　PE 对 3 种细胞株生长的抑制作用
Tab 2　The inhibito ry effects of PE on prolifera tion of H eLa , EC109 and va scular endothelial cells
剂量
(ug mL- 1)
24h 抑制率(%)
HeLa细胞 EC 109细胞 血管内皮细胞
48h抑制率(%)
HeLa细胞 EC 109细胞 血管内皮细胞
0 - - - - - -
2. 5 46. 15 2. 07 - 20 58. 97 2 - 13. 06
5 54. 64 2. 06 - 13 63. 24 1 - 1. 12
10 57. 07 - 0. 05 - 2 64. 31 0 - 3. 98
20 64. 18 - 2. 2 - 22 70. 88 - 7 - 15. 01
　　从表 2可见 , PE 对人宫颈癌细胞 HeLa
的生长有显著的抑制作用并呈剂量依赖性 ,
当剂量为 20μg mL - 1 、作用 24h和 48h 后 ,
其抑制率分别为 64. 18%与 70. 88%。但是 ,
PE 对人食道癌 EC109 细胞作用微弱;对正
常的人血管内皮细胞 ,PE具有一定的促生长
作用 ,但无规律性。实验结果说明 PE 对细
胞的抑制作用具有选择性 ,其具体原因尚待
进一步的探讨 。
2. 3　PE 对 HeLa 细胞周期的影响
HeLa细胞经 PE作用 24h和 48h后 ,细
胞中 S期细胞的百分比随着剂量的增加明显
下降 ,G2 /M 期细胞百分比上升 ,提示 PE可
将细胞周期阻滞在 G 2 /M 期 ,降低 HeLa 细
胞分裂能力 ,抑制其增殖 ,见表 3。
表 3　PE对 HeLa细胞周期的影响(%)
Tab 3　The effects of PE on cycle pha se o f HeLa ce lls
PE剂量
(μg mL- 1)
24h
G 1 /G 0 S G2 /M
48h
G 1 /G 0 S G 2 /M
0 51 39. 4 9. 6 52. 2 37. 8 10. 2
2. 5 51 28. 4 20. 4 56. 1 18. 8 25. 1
5 53. 1 21. 8 25. 1 57. 5 12. 8 29. 7
10 52. 7 20. 8 26. 5 57. 4 12. 4 30. 2
图 1　PE 作用 H eLa 细胞 24 ～ 48h 的荧光照片
(a:空白;b、c、d分别为:2. 5 、5 、10μg mL- 1 ,处理 24h , ×400;e:空白;f、g、h分别为:2. 5 、5 、10μg mL - 1 ,处理 48h , ×400)
F ig . 1　The fluo rescence photo of PE on HeLa cell af te r 24 ～ 48 hour 30
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2. 4　PE 对 HeLa 细胞凋亡的影响
由不同剂量的 PE 分别作用 HeLa细胞
24h和 48h ,经 Annexin V-FITC / PI双荧光
染色后的细胞照片见图 1。
细胞凋亡早期由于细胞内钙离子的流
动 ,谷氨酰胺转移酶的转化 ,使胞浆膜磷脂分
布的不对称性被破坏 ,导致细胞膜内层的磷
酯酰丝氨酸(PS)翻转到膜外 ,而 Annexin V
是一种 Ca2+依赖性磷脂结合蛋白 , 能与细
胞凋亡过程中翻转到膜外的 PS 特异性结
合 , 以标记了 FITC(显示绿色荧光)的 An-
nexin V 作为荧光探针可检测细胞凋亡的发
生[ 10 , 12] 。Propidium iodide(PI)是一种极性
核酸染料 ,对活细胞不起作用 ,仅能进入凋亡
晚期或坏死细胞的细胞核 ,与 DNA 结合使
之发出红色荧光[ 13] 。将 Annexin V 与 PI匹
配使用 ,可将凋亡早期的细胞和晚期的细胞
以及坏死细胞区分开[ 14] 。从图 1 中可见 ,在
剂量为 0 ～ 10μg mL - 1范围内 ,随着 PE 剂
量的增加和作用时间的延长 ,呈绿色荧光和
红色荧光的细胞均随之增多 ,说明凋亡细胞
和凋亡晚期或坏死细胞增加。
3　讨论
3. 1　龙须菜藻红蛋白对不同细胞作用效果
不同 ,对肿瘤细胞的抑制作用具有选择性。
藻红蛋白能明显抑制人宫颈癌细胞 HeLa的
生长 ,当剂量为 10μg mL -1时 ,其抑制率达
70. 88%,但对人食道癌 EC109 细胞低浓度
时抑制作用微弱 ,高浓度时却有促生长作用。
李冠武等用多管藻藻红蛋白作用 S180细胞 ,
在 1 ～ 100μg mL - 1剂量范围 ,对细胞杀伤
作用最大只能达到 30%,由此认为藻红蛋白
只有发生光敏反应才对肿瘤细胞产生强的杀
伤作用[ 11] 。但本文的实验结果表明 ,单用藻
红蛋白也能对肿瘤细胞产生较强的杀伤作
用 ,只是藻红蛋白对肿瘤细胞的抑制能力存
在着种类依赖性 。
3. 2　文中流式细胞仪检测结果表明:PE 能
将 HeLa 细胞周期阻滞在 G 2 /M 期 ,从而抑
制细胞增殖 。A nnexin V-FITC / PI 双荧光
染色是一种较新的细胞调亡检测方法 ,利用
该方法可见在一定剂量范围 ,调亡早期和晚
期或坏死细胞数目随剂量的增加而增多 。说
明 PE 体外抑制 HeLa 细胞作用与对该肿瘤
细胞周期的抑制和诱导细胞调亡有关 ,其作
用机理我们将会在今后继续进一步研究 。
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