全 文 ：文章编号:1001-4217(2006)03-0006-06
处理因素对龙须菜藻红蛋白抗氧化活性的影响
陈美珍,葛安山,余 杰,张永雨,梁满坚
(汕头大学理学院生物系,广东 汕头 515063)
摘 要:比较多种细胞破碎方法、不同硫酸铵浓度对龙须菜藻红蛋白的提取、分离效果,探
讨不同光照、温度、pH等处理条件对藻红蛋白粗提物抗氧化活性的影响.结果表明,采用
组织捣碎破壁细胞,50%饱和度硫酸铵沉淀藻红蛋白提取效果较好;温度、光照和不适宜
pH均会导致藻红蛋白粗提物清除·OH自由基能力降低甚至起促氧化作用.因此对龙须菜原
料的保存、加工及藻红蛋白的提取分离等必须在低温、避光、中性环境下进行,以保证藻红
蛋白的稳定性.
关键词:龙须菜;藻红蛋白;提取;清除羟自由基;影响因素
中图分类号:Q51 文献标识码:A
0 引 言
藻胆蛋白(phycobiliproteins)是红藻和蓝藻中光合作用的主要捕光色素蛋白,按光
谱特性,藻胆蛋白可分为红色的藻红蛋白(phycoerythrin,PE)、蓝紫色的藻蓝蛋白
(phycocyanin,PC)和孔雀蓝色的异藻蓝蛋白(alophycocyanin,APC)[1].龙须菜(Gracilaria
lemaneiformis)是一种江篱属产琼红藻,含有19.14%(以干重计)的粗蛋白,其藻胆蛋白
主要是藻红蛋白[2].研究发现,龙须菜藻胆蛋白有抗氧化、抗畸变、提高机体免疫力和
抑制肿瘤细胞生长等作用[2-4],因此有较好的利用价值.但是藻胆蛋白均为水溶性,在
完整的细胞中,它们是大分子结构的一部分,一旦细胞被破坏,这些大分子即解体,
解体的藻胆蛋白具有蛋白质和光敏剂的性质,对环境因素敏感,容易失去活性.目
前,国内外尚未见有关龙须菜藻红蛋白稳定性的报道.本文研究了龙须菜藻红蛋白的
提取方法,提取物经不同光照、温度处理和在不同pH条件下清除自由基能力的变化
情况,以期为龙须菜收获后的处理及其合理开发利用提供可靠的技术依据.
1 材料与方法
1.1 材料
新鲜龙须菜(2005年3～4月采集于南澳岛,为人工养殖).
收稿日期:2005-10-10
作者简介:陈美珍(1956～),女,福建人,副教授.E-mail:chenmz@stu.edu.cn
基金项目:汕头市科技计划重点资助项目(2003年)
2006年8月 汕头大学学报 (自然科学版) 第21卷 第3期
Aug.2006 JournalofShantouUniversity(NaturalScience) Vol.21No.3
1.2 方法
1.2.1 细胞的破碎
先将藻体切成细小片段,然后分别采用溶胀法、研磨法、组织捣碎法、反复冻融
法和混合法[5]对等量龙须菜藻体细胞进行破碎,离心取上清液,定容,用考马斯亮
蓝法测定蛋白质含量(以A595nm表示)
[6],作为破碎提取效果的评价指标.其中溶胀法
是在 4℃下用蒸馏水浸泡藻体细胞 5d,使其膨胀破裂;反复冻融法是将藻体细胞
置-20℃下冰冻、4℃融解,反复4次.
1.2.2 硫酸铵分级盐析
取50g干燥藻体,蒸馏水中浸泡使其膨胀,切碎后于组织捣碎机内捣碎,然后
置于4℃冰箱中浸提2d,离心,弃沉淀,上清液均分为 9份,分别采用不同饱和度
的硫酸铵溶液(20%～60%饱和度)沉淀蛋白,离心,将沉淀物用磷酸缓冲液溶解并定
容至100mL,测A565nm与A280nm,计算藻红蛋白纯度P(用A565/A280表示
[5],藻红蛋白在
565nm处有最大吸收值),并比较盐析效果.
1.2.3 藻红蛋白粗提物的制备
新鲜龙须菜洗净切碎,用1mmol/LpH6.8磷酸缓冲液(PBS)在4℃下浸泡1d,低
温捣碎,然后于 4℃避光浸提 2d,离心,取粉红色上清液,加入硫酸铵(饱和度为
50%)缓慢而充分搅匀,置4℃避光沉淀2h,离心,将沉淀物置PBS中充分透析,离
心得到粉红色的上清液即为藻红蛋白粗提物(Crudephycoerythrin,CPE).
1.2.4 羟自由基清除率的测定
采用fenton体系,按文献[7]的方法进行操作和计算清除率.取0.2mLFeSO4-EDTA
混合液(10mmol/L)于试管中,加入0.2mLa-脱氧核糖溶液(20mmol/L),然后再加入
0.2mL测试样品,并用磷酸缓冲液(pH7.4)定容至 1.8mL,最后加入 0.2mL的 H2O2
(10mmol/L),37℃水浴1h,然后加入1mL2.8%的TCA终止反应,再加入1mLTBA,
混匀置沸水浴中加热10min,冷却后532nm处测吸光值As.对照不加样品用磷酸缓
冲液补够,同上操作处理,测定其对比吸光值Ac.不加样品,并且不在37℃水浴中
反应,其它处理同上,测定空白吸光值Ao.样品对羟自由基的清除能力(S)按下式计算:
S(%)=[1-(As-Ao)/(Ac-Ao)]×100.
1.2.5 各种处理因素对抗氧化活性的影响
按1.2.3节制备藻红蛋白粗提物(CPE), 然后分别用不同的光源、温度和 pH作
用CPE,测其清除自由基能力.
2 结果与分析
2.1 藻红蛋白的提取与分离
2.1.1 不同细胞破碎方法提取效果比较
用不同破碎方法处理细胞,所得提取液用考马斯亮蓝法测定蛋白质含量,各样品
A595nm吸光值如表1所示.由表1可见,研磨法效果最好,其次为组织捣碎法,冻融
法效果最差,而冻融+研磨、冻融+组织捣碎等方法混合使用均未能提高藻体蛋白的
陈美珍等:处理因素对龙须菜藻红蛋白抗氧化活性的影响第3期 7
提取效果,其提取液总蛋白的吸光值反而比单独用研磨或捣碎的方法低,可能是蛋白
质经长时间的反复冻融,部分被破坏了.虽然研磨法效果好,但费时费力,且处理量
少.组织捣碎法提取效果虽比研磨法稍差一些,但操作简便,快速,是实际应用中较
适合提取龙须菜藻胆蛋白的细胞破碎方法.
2.1.2 不同饱和度硫酸铵盐析效果比较
硫酸铵盐析是提取藻胆蛋白最常用的方法,但有效沉淀藻红蛋白所需硫酸铵饱和
度所见报道不一致.本文考察了不同饱和度硫酸铵对龙须菜藻红蛋白的沉淀效果,结
果见表2.表2数据表明,总蛋白沉淀量随着硫酸铵饱和度的增加而增加,藻红蛋白
的沉淀量在饱和度为50%时达到最大,继续增加硫酸铵饱和度,沉淀量反而稍有减
少,且纯度P(A565/A280)降低.说明硫酸铵饱和度大于50%后,其他少量藻胆蛋白如藻
蓝蛋白和别藻蓝蛋白也沉淀下来.综合考虑得率与纯度的关系,作者认为50%饱和度
硫酸铵沉淀藻红蛋白效果较好.
2.1.3 不同柱层析纯化效果比较
分别用羟基磷灰石柱(HA
柱)和 SepHadexG-100柱纯化
CPE,其纯化效果见表 3.由表
3CPE过柱后的纯度可见,对
于分离藻红蛋白,HA柱的纯化
效果优于 SepHadexG-100柱.
但粗提物过 1次 HA柱或 1次
SepHadexG-100柱,所分离的藻
红蛋白纯度均不理想,若要达到
商品应用标准(P≥4.0),需要两种纯化方法混合使用和反复过柱.
2.2 原料预处理方法对CPE清除自由基能力的影响
称取等量新鲜龙须菜5份,分别进行:A,室内风干;B,室内风干后再经烘箱30℃
鼓风干燥;C,烘箱 50℃鼓风干燥;D,太阳晒干;E,4℃放置.处理后的含水量
表1 不同细胞破碎方法藻体蛋白提取效果比较
破碎方法 溶胀法 研磨法 组织捣碎法 冻融法 冻融+研磨 冻融+组织捣碎
A595nm 0.060 0.091 0.080 0.047 0.082 0.076
表2 不同饱和度硫酸铵对藻红蛋白盐析效果的影响
硫酸铵饱和度/% 20 25 30 35 40 45 50 55 60
A280 0.098 0.150 0.289 0.400 0.469 0.520 0.578 0.580 0.594
A565 0.020 0.032 0.063 0.110 0.137 0.151 0.166 0.165 0.165
P 0.217 0.222 0.223 0.279 0.296 0.294 0.290 0.284 0.281
表3 HA柱与SepHadexG-100柱对藻红蛋白分离纯化效果
藻红蛋白纯度
P
1 0 2.4
0 1 1.2
1 1 3.6
2 0 3.30
0 2 3.05
3 1 4.0
过柱次数
HA柱 SepHadexG-100柱
汕头大学学报(自然科学版) 第21卷8
(%)分别为:A,40.5;B,21.65;C,
13;D,29.6;E,84.6.然后按 1.2.3节
的方法提取藻红蛋白粗提物,分别测其
清除羟自由基活性,结果见图1.
由图 1可见,几种龙须菜预处理方
法中,4℃保存的龙须菜其藻红蛋白清
除自由基能力最强,室内风干的次之,
50℃干燥的清除能力最差.说明温度是
影响藻红蛋白抗氧化活性的最主要因素,而实际常用的晒干法保存龙须菜,由于各种
光线的作用也会导致其藻红蛋白抗氧化活性大大降低.
2.3 处理因素对CPE抗氧化活性的影响
2.3.1 pH对CPE清除羟自由基能力的影响
分别取不同pH值的磷酸缓冲液9mL,然
后各加入 1mLCPE样液,混匀静置 15min
后,测定其羟自由基清除能力,结果如图 2
所示.
由图 2可知,在 pH5～7范围内,CPE
清除率的变化不显著, pH7时清除活性最
高,当pH大于7时,随着pH的增加,清除
活性显著下降,到pH10时CPE几乎丧失羟
自由基清除能力,说明此时藻胆蛋白基本上已都变性.此结果与周站平等人[8]2003年
报道的螺旋藻藻蓝蛋白和别藻蓝蛋白清除羟自由基能力在pH10～11时明显增强完全
不同,这可能是藻胆蛋白种类、组成结构不同所致.
2.3.2 温度对CPE清除自由基能力的影响
将从新鲜龙须菜中提取的 CPE分别
于37℃,40℃,43℃,46℃、50℃,60
℃水浴,常温(25℃)和 4℃下放置 30
min,然后测其羟自由基清除率,结果见
图3.从图中可知,常温也会使藻红蛋白
失去部分活性,当藻红蛋白水溶液经 37
℃高温作用后,即丧失羟自由基清除能
力,37℃以上则产生自由基,起促氧化
作用.此结果与2.2节中的结果基本一致,只是在2.2节中,藻红蛋白受藻体细胞的
保护,受热后被破坏变性的程度较轻而已.由此提示龙须菜藻红蛋白对温度相当敏
感,高温容易使其失活.
2.3.3 光照对CPE清除自由基能力的影响
将CPE样液分别置于紫外光灯,红外光灯,白炽灯以及阳光下照射30min,然
第3期 陈美珍等:处理因素对龙须菜藻红蛋白抗氧化活性的影响
80
70
60
50
40
30
20
10
0
55 51
13
35
60
S
/%
A B C D E
不同的干燥处理方法
图1藻体预处理方法对CPE清除自由基的影响
40
35
30
25
20
15
10
5
0
5 6 7 8 9 10
S
/%
20.7 21.4
24
17.2
4.8 3.2
pH
图2 pH对CPE羟自由基清除率的影响
S
/%
70
50
30
10
-10
-30
47
38.5
0
4 25 37 40 43 46 50 60
温度 t/℃
图3温度对CPE羟自由基清除率的影响
-3.8 -18 -19-18.4-19
9
60
50
40
30
20
10
0
S
/%
后分别测其自由基清除率,结果见图4.
由图 4可知,各种光线均会降低 CPE
对自由基的清除率,其中太阳光对藻红蛋白
抗氧化活性破坏力最强,其次是紫外光.
3 讨 论
Evstigneev[9]在报道中指出,藻胆蛋白具
有电子转移的功能,在用藻胆蛋白或藻胆体
所构成的电化学池中,照光后获得了一定的
光生电势,表明当存在合适的电子供体或受体时,藻胆蛋白能够给出电子,从而可以
产生自由基.同时藻胆蛋白藻胆素中的双键存在异构体,两种异构体之间可逆变化,
也可以导致自由基的产生.李冠武[10]等人2002年的研究表明,藻胆蛋白在光动力治
疗中可作为有效的光敏剂.因此,藻胆蛋白具有产生自由基和清除自由基的双重功
能,且这种功能主要与藻胆蛋白中的藻胆素有关[10].本实验结果也证实了龙须菜藻红
蛋白在不同温度条件下具有清除自由基和产生自由基的双重作用.温度主要是引起藻
红蛋白变性,分子发生重排,藻胆素暴露出来,藻红蛋白和藻胆素的结构发生一定变
化,导致自由基产生.不同光照也会导致藻红蛋白变性、藻红蛋白和藻胆素的空间结
构发生变化,使藻红蛋白清除自由基能力降低,只是不同的光线光量子能量和热效应
不同,引起藻红蛋白的藻胆素及蛋白质变性的方式和程度有所不同,因此清除率下降
程度不等.如紫外光光量子能量比红外光强,所以紫外光照后藻红蛋白清除率较红外
光照低.阳光中除了可见光外,还有一部分是紫外光和红外光等射线,藻红蛋白既能
吸收和传递可见光能,又受紫外光和红外光等作用,因此阳光照射使藻红蛋白变性激
烈,几乎无清除自由基能力.碱性条件可能导致藻红蛋白的藻胆素周围氨基酸残基的
电荷变化以及藻胆素与蛋白质或藻胆素之间的相互作用发生变化,这些变化降低了藻
红蛋白清除自由基的能力.但藻红蛋白结构的变化是如何导致自由基的产生和清除的
机理尚待深入研究.
4 结 语
本实验结果表明:1)在低温下用组织捣碎法有较好的细胞破壁效果,而常用的反
复冻融法破碎藻体细胞对提取龙须菜藻红蛋白不适用,这可能与龙须菜藻体较硬,细
胞纤维素含量高有关;2)用50%饱和度硫酸铵沉淀藻红蛋白可使总蛋白得率提高的同
时又保证了较高的纯度,提取效果较好;3)温度使藻红蛋白变性激烈,容易失去稳定
性,其次是阳光照射和碱性条件,各种光线均会导致藻红蛋白发生一定的变性.因
此,为保证藻红蛋白的稳定性,对龙须菜原料的保存、加工及藻红蛋白的提取分离等
必须在低温、避光、中性环境下进行.
汕头大学学报(自然科学版) 第21卷
20
30 30
5
45
紫外光 红外光 灯光 阳光 避光
图4 不同光照对CPE羟自由基清除率的影响
10
参考文献:
[1] 王仲孚,赵谋明,彭志英,等.藻胆蛋白研究[J]. 生命的化学,2000,20(2):72-75
[2] 陈美珍,张永雨,余杰,等.龙须菜藻胆蛋白的分离及其清除自由基作用的初步研究[J].食品科
学,2004,25(3):159-162.
[3] 张永雨,陈美珍,余杰,等.龙须菜藻胆蛋白抗突变与抗肿瘤作用的研究[J].中国海洋药物,
2005,24(3):36-39.
[4] 陈美珍,余杰,钟秋玲,等. 龙须菜藻胆蛋白免疫功能和抗氧化作用的研究[J].食品科学,2005,
26(7):456-459.
[5] 郑江. 藻胆蛋白的提取纯化研究进展[J]. 食品科学,2002,23(11):159-161.
[6] 李建武,余瑞元,袁明秀等. 生物化学实验原理和方法[M],北京:北京大学出版社,1997:168-
170,174-176,216-223.
[7] 陈美珍,余杰,郭慧敏.大豆分离蛋白酶解物清除羟自由基作用研究[J].食品科学,2001,23(1):
43-47.
[8] 周站平,陈秀兰,陈超,等. 藻胆蛋白脱辅基蛋白对其抗氧化活性的影响[J].海洋科学,2003,
27(5):77-80.
[9]EvstigneevVB.Theoriginoflifeandevolutionaryofbiochemistry[M].London,NewYork:Plenum
press,1974:97.
[10]李冠武,王广策,温博贵,等. 藻红蛋白介导的光敏反应可诱导人肝癌 7721细胞凋亡[J]. 肿瘤
防治杂志,2002,9(2):144-146.
[11]范晓,张士璀,秦松,等.海洋生物技术新进展[M].北京:海洋出版社,1999:196-204.
InfluenceofDiferentTreatmentFactorsonAntioxidativeActivitiesof
thePhycoerythrinfrom theGracilariaLemaneiformis
CHENMei-zhen,GEAn-shan,YUJie,ZHANGYong-yu,LIANGMan-jian
(DepartmentofBiology,ShantouUniversity,Shantou 515063,Guangdong,China)
Abstract:Thebestconditionsoftheextractionandisolationofphycoerythrin(PE)from theGracilaria
lemaneiformis,andtheinfluenceofenvironmentalfactorsonthePE’santi-oxidationactivityareinvestigated.
ThecrudePEwasextractedbyvariedmethodstocelsfragmentation,precipitatedbydiferentconcentration
ofammoniumsulfateandisolatedbyHAandSephadexG-100columnchromatography.Theeficiencyof
extractionwasdecidedbythepurityofPE.ThecrudePEwastreatedbydiferentlight,temperature
andpH valueetc,andthenitsscavengingrateof·OH freeradicalwastested.Tissue-triturationand
ammoniumsulfateatsaturationdegreeof50% hadabeterefectofextraction.Hightemperature,light
andunfitpHvaluecouldalmakethePEloseitsabilityofscavenging·OH,somuchsothatPEmight
makeitcontributeprooxidantefect.InordertokeepthePE’sphysiologicalcharacters,theconservation
andprocessingofGracilarialemaneiformisandtheextractionandisolationofPEshouldalbemanipu-
latedundertheconditionsoflowtemperature,darkcircumstanceandneutralpHvalue.
Keywords:Gracilarialemaneiformis;Phycoerythrin;extraction;scavenginghydroxyl;radical
第3期 陈美珍等:处理因素对龙须菜藻红蛋白抗氧化活性的影响 11