全 文 ：龙须菜新品系 07-2的筛选及性状分析
孟 　琳1 , 徐 　涤1 , 陈伟洲2 , 张学成1
(1.中国海洋大学海洋生命学院 ,山东青岛 266003;2.汕头大学理学院 , 广东 汕头 515063)
摘　要:　以 981 龙须菜为出发藻种 ,通过亚硝基胍诱变和耐羟脯氨酸筛选 , 选育出龙须菜新品系 07-2 , 并对其性状进行
了分析。与出发藻种比较 ,新品系生长速度提高 17%;在高温胁迫下 ,发生病烂的时间明显晚 ,游离脯氨酸的含量明显提
高 ,具有更强抗逆性;与琼胶代谢相关的α-半乳糖苷酶活性明显提高。山东荣成海区进行的试验证明 , 07-2 品系日平均生
长速率为 6.21%,而 981 品系日平均生长速率为 4.11%, 进一步证明了该品系的生长优势。
关键词:　龙须菜;羟脯氨酸;诱变;生长速率;耐高温
中图法分类号:　Q942.6　　　　　文献标识码:　A　　　　　文章编号:　1672-5174(2009)03Ⅱ-94-05
　　龙须菜(Gracilaria lemaneiformis)是红藻门江蓠属
中的大型海藻 ,在人工养殖条件下具有较高的生长速
率 ,琼胶质量好 ,在食用 、提取琼胶和作为鲍鱼饵料等方
面被广泛利用[ 1] ,是 1个进行工业规模化栽培和高值化
开发利用的物种[ 2] 。2000年筛选出的 981龙须菜具有
耐高温 、速生 、抗逆 、琼胶含量较高且质量好等优点 ,奠定
了龙须菜栽培的基础 。但随着栽培时间延长 ,发生种质
退化 ,有必要对其进行遗传改良 ,选育出具有更好的经
济性状的新品种 ,以促进龙须菜栽培业的发展。
诱变育种是龙须菜新品种选育的重要手段之一 ,N-
甲 基-N′-硝 基-N-亚 硝 基 胍 (N-methyl-N′-nitro-N-ni-
t rosoguanidine ,MNNG)是有效的诱变剂 ,可得到稳定突变
藻体[ 3-5] 。通过耐羟脯氨酸(Hydroxyproline , HYP)筛选获
得高抗逆性植物 ,是农作物育种常用的方法 ,在小麦[ 6] 、菜
心[7]等作物中已有大量报道 ,通过羟脯氨酸筛选的植株细
胞内往往脯氨酸含量提高 ,从而增加植株的抗逆性。但耐
羟脯氨酸变异筛选法在藻类中应用未见报道。本文从原
有品种 981龙须菜出发 ,采用 N-甲基-N′-硝基-N-亚硝基
胍诱变方法[ 3] ,初步获得 981变异体植株 ,再对其进行 L-
羟脯氨酸抗性系的筛选 ,最后在 31 ℃条件下进行高温筛
选。现已初步筛选出了生长较快 、质量较高 、抗逆性较强
的龙须菜新品系 07-2 ,并在山东荣成海区进行了栽培实
验 ,另比较了981和07-2藻株内与耐高温机制相关的游离
脯氨酸(Proline;Pro)含量变化及龙须菜体内与琼胶合成相
关的一种红藻糖苷水解酶———α-半乳糖苷酶(α-galactosi-
dase)活性变化 ,进一步证实了 07-2的优良特性。本文旨
在建立适于龙须菜的耐高温品系筛选方法 ,为进一步选育
重要经济海藻龙须菜高产抗逆品系打下基础。
1　材料与方法
1.1 材料的采集和培养
实验用龙须菜为 2006年 10月采自青岛湛山湾养
殖区栽培的 981龙须菜的四分孢子体 。用毛刷刷洗除
去杂藻 ,选取 6株生长旺盛的藻株于烧杯中通气培养。
采用 f/2培养基 ,培养温度为(21±1)℃,光强 40 ～ 60
mol/m2s ,光暗周期 12L∶12D。每周更换 1次培养基。
1.2 诱变
诱变剂为 MNNG ,购自Sigma公司。
取长20 ～ 30 mm 的茎尖作为诱变材料 ,于 250 mL
三角瓶中培养 1周 ,然后置于 MNNG 处理液中进行诱
变 ,诱变剂浓度为 30 mg/L ,处理时间分别为 0 ,10 , 20 ,
30 , 40和50 min ,每组处理茎尖100条。诱变后先用消
毒海水冲洗 3遍。处理后的材料于 f/2培养基中暗培
养 24 h后移至光下培养 ,培养条件同上。将存活的藻
体茎尖继续培养 ,观察其活性 ,选择生长旺盛的处理组
进行下一步耐高温筛选 。
1.3 耐高温藻株的选择
筛选试剂为 HYP ,购自华生公司。浓度为 0.5 ,
1.0 ,1.5 ,2.0 , 2.5和 3.0 mmol/L。
将上述经 MNNG诱变 30 min 的茎尖在加入不同
浓度 HYP 的 f/2培养基中进行初筛 ,每组 30条 ,根据
茎尖的死亡率选择 HYP 的适宜浓度。然后在含有此
浓度的 HYP 培养基上继续培养 。最后将存活的植株
在 31 ℃下高温筛选 ,得到的成活植株就是所要筛选的
耐高温品系。以 981 为对照 ,检测新品系的耐高温性

通讯作者:E-mail:xczhang@ouc.edu.cn
基金项目:国家高技术研究发展计划项目(2006AA10A413);国家自然科学基金项目(30671603);广东省汕头市科技计划项目(2007-44)资助
收稿日期:2008-11-20;修订日期:2008-12-17
作者简介:孟　琳(1983-),女 ,硕士生。
　 第 39卷　增刊 　
2009年 5月　
中 国 海 洋 大 学 学 报
PERIODICAL OF OCEAN UNIVERSIT Y OF CHINA
39(Sup.):94～ 98
May , 2009
能和生长状况。
1.4 耐高温性的测定
每个品系选取 3 株藻体置于 100 mL 的三角瓶中
加 80 mL 培养基 ,在 40 ℃的光照恒温培养箱中培养 ,
观察藻体的形态及色素变化。
1.5 线生长速度的测定
每个品系选取长度为 10 mm的幼嫩藻尖 50根 ,置
于100 mL 的三角瓶中加入 80 mL 培养基 ,培养1周后
测定长度 ,如有分枝 ,将所有分枝加入总长 ,连续测 4
周 ,计算平均线生长速度[ 8] 。每周更换培养基。
1.6 游离脯氨酸含量的测定
每个品系称取鲜重 2.5 g 的藻体 ,置于 500 mL 的
三角瓶中加入 300 mL 培养基 ,在 30 ℃的光照培养箱
中培养 ,连续 4 d测其含量。Pro 含量的测定采用磺基
水杨酸提取法[ 9] ;称取 0.5 g 待测藻株 ,加 5 mL 3%磺
基水杨酸沸水浴浸提 10 min ,酸性茚三酮染色 ,甲苯萃
取后 520 nm 处比色。
1.7α-半乳糖苷酶活性的测定
每个品系分别在 10 , 15 , 20 , 25 和 30 ℃的光照恒
温培养箱中培养 3 d 后测酶活。鉴于酶活性在 1 d之
内有明显的改变 ,所以实验都要在每天相同时刻测定。
准确称取 0.3 g 待测藻株。液氮研磨加缓冲液(50
mmol/L Gly-NaOH , 体积分数 0.1% β-巯基乙醇 , pH
8.25)。4 ℃离心 ,取上清进行活性分析[ 10] 。蛋白质浓
度测定参照 Bradford 的方法[ 11] 。以牛血清白蛋白作
为标准。1个酶活单位(U)定义为在上述条件下 1 min
内催化 1 μmol底物或生成 1 μmol产物的酶量。酶的
活性用酶的比活表示 ,即 U/mg 蛋白 。
以上实验均用 3个平行样 ,取其平均值。以 t-test
对 2个品系的各项生理指标进行差异显著性分析 。
1.8 日平均生长速率的测定
2008年 9月 4日 ～ 10月 14 日在山东威海海区进
行栽培实验 。苗绳长 5 m , 2个品系各夹苗 10根 , 200
g/绳。分别于第 10 d ,20 d ,30 d , 40 d称重 ,按照下列
公式进行计算龙须菜的日平均生长速率(Specific
Grow th Rate , SGR):
SGR(%)/d=(lnWn -lnW 0)/ n×100%,
式中 Wn 为第 n 天的藻体重量(g);W 0 —初始夹苗量
(g)。
2　结果
2.1 MNNG诱变选择突变体
981龙须四分孢子体菜茎尖经 MNNG 诱变后仍
具有正常的萌发和成长能力 ,但其存活率与诱变时间
具有相关性。诱变时间越长 ,茎尖的存活率越低 。处
理3 d后 , 10 min 处理组的存活率为 90%,而 50 min
处理组的存活率仅为 75%。处理 12 d后 ,30 min处理
组的存活率为 48%, 50 min处理组已经全部死亡。同
时观察到 30 min处理组的藻体较早出现分枝 ,生长速
度高于其他各组 ,因此收集该处理组的茎尖进行 HYP
筛选 。
图 1　981 龙须菜经不同时间诱变处理后的存活率
Fig.1　Survival ra te co rresponding to different mutating times
2.2 耐高温藻株的选择
2.2.1 HYP 处理　　经 HYP 处理后第 1 ,3 ,7 天的藻
株存活率见图 2。图示可见 ,HYP 对藻株的存活率有
明显的影响 ,不同浓度处理后藻株的存活率都明显低
于对照组 ,尤其高浓度对藻株表现出强烈的致死作用 。
处理 1 d后 ,0.5 mmol/ L组存活率达到 92%,3 mmol/L
组仅为 20%,处理 7 d后 , 0.5 mmol/L 组存活率下降
到 70%,3 mmol/L 组已经全部死亡 。2 mmol/ L组第1
天存活率为 73%,第 7天下降到 51%接近半致死率。
因此经过 0.5 ～ 3 mmol/ L HYP 浓度的初始筛选后 ,得
到适宜的筛选浓度为 2 mmol/ L。用含有此浓度的筛
选培养基进行培养 ,取存活藻株在 31 ℃高温条件下培
养 24 h进行二次筛选。最后将存活的 9株藻株放入烧
杯中通气培养 ,采用 f/2 培养基 ,培养温度为(21±1)
℃,光强 40 ～ 60 mol/m2s ,光暗周期 12L∶12D。每周更
换新鲜培养基 。4周后观察有 1株材料分枝较多 、色泽
均匀 、生长迅速 ,命名为 07-2。
图 2　HYP 处理后藻株的存活率
Fig.2　Percentage of algal individuals survived after HYP screening
2.2.2 耐高温特性的测定　　相同的高温胁迫条件
(40 ℃)对 07-2和 981造成的损伤和病烂程度并不相
同 , 07-2发生病烂的时间和程度明显晚于 981。胁迫
12 h ,二者形态都无明显变化 ,枝条保持完整 ,无病烂
95增刊 孟　琳 ,等:龙须菜新品系 07-2的筛选及性状分析
现象(退色和烂梢)。24 h 时 , 981分枝开始出现退色
变白 , 07-2仅有少量分枝发白死亡。48 h时 ,981的退
色区域扩大主枝呈现粉红色 , 07-2主枝仍呈现深红色。
72 h 时 ,981全部变白死亡 ,07-2 分枝全部死亡但主枝
为红色(见图 3)。
图 3　40 ℃胁迫 72 h 后 981 和 07-2 生长状态比较
Fig.3　Characteristics of strain 07-2 and 981 stressed
at 40 ℃ for 72 hours
2.3 线生长速度的比较
07-2和 981的生长状态见图 4 ,显示出较为明显的
差异 。07-2 平均线生长速率为 0.90 mm/d;981 为
0.77 mm/d ,两者之间差异显著(P<0.05)。2个品系
的藻株起始长度都为 10 mm ,随着培养时间延长 07-2
和 981的藻体长度差异逐渐明显。7 d 时 07-2 和 981
的藻体长度并无显著差异(P >0.05), 28 d 时二者已
经显示出明显的差异(P<0.05),981 藻体平均长度为
40.85 mm ,07-2藻体平均长度为 45.90 mm ,表现出较
明显的生长优势 。
图 4　07-2 和 981 藻体长度的比较
Fig.4　Comparison of the thalli leng th of strain 07-2 and 981
2.4 高温胁迫条件下游离脯氨酸含量的比较
图 5表示了 07-2和 981在 30 ℃高温胁迫条件下
脯氨酸含量随着时间的变化情况 。由图 4 可以看出 ,
在高温胁迫下龙须菜藻体内的脯氨酸含量都发生了显
著的变化 ,前 3 d 内逐渐升高 ,第 4天突然回落。常温
下 07-2和 981体内脯氨酸含量为 11.17±0.51和5.24
±0.47 , t-test 结果表明不存在显著差异(P >0.05)。
高温胁迫后二者含量变化明显 ,第 3天二者体内脯氨
酸含量为 29.58±0.20和 17.19±0.40 , t-test结果表
明存在显著差异(P <0.05)。在高温胁迫条件下培养
3 d时 ,07-2体内的含量明显高于 981(P <0.05);当培
养时间到 3 d后 ,脯氨酸含量急剧下降 ,但 07-2的含量
仍明显高于 981 。
图5　30 ℃高温胁迫对07-2和 981体内游离脯氨酸含量的影响
Fig.5　F ree proline content of strain 07-2 and 981 under
heat stressed at 30 ℃
2.5α-半乳糖苷酶活性的比较
图 6表示 07-2和 981分别在 10 ,15 , 20 , 25 , 30 ℃
条件下 07-2和 981中α-半乳糖苷酶活性比较 。由图 6
看出 ,在 10 ～ 20 ℃之间 ,α-半乳糖苷酶活性变化呈下降
趋势;20 ～ 30 ℃则呈现显著上升趋势。从整体变化上
看 , 07-2体内酶的活性要高于 981。对于 07-2 来说 ,在
20 ～ 25 ℃下酶活有一个显著提高的过程(P <0.05),
与 20 ℃相比 ,提高了 47%。在 25 ～ 30 ℃下 ,酶活趋于
稳定 。
图 6　不同温度条件下 07-2 和 981 中α-半乳糖苷酶活性比较
Fig.6　Activity ofα-galacto sidase of strain 07-2 and 981
at different temperatures
2.6 日平均生长速率的测定
2个品系的起始重量都是 200 g ,经过 40 d的栽培
时间 ,981的平均藻体重量为 4 549 g ,07-2的平均藻体
重量为 7 721 g ,比 981 高 69.7%。图 7 表示 07-2 和
981日平均生长速率的变化曲线 ,其中 07-2的日平均
生长速率为 6.21%,981的日平均生长速率为 4.11%,
96 中　国　海　洋　大　学　学　报 2 0 0 9 年
经方差分析 ,差异显著(P <0.05)。
图 7　07-2 和 981 日平均生长速率比较
Fig.7　Specific grow th rate of strain 07-2 and 981
3　讨论
利用化学诱变技术诱发遗传物质变异已成为获得
新品种的重要手段之一 ,在藻类和农作物上均有大量
报道。MNNG是一种烷化剂 ,它的诱变机制是通过分
子错误配对或错误修复引起突变[ 12] 。在红藻遗传的
研究中 ,许璞等用 MNNG 处理紫菜 ,得到了色素突变
体[ 3] ;张学成等也曾用 MNNG成功地在龙须菜中诱导
多种色素突变体[ 5] ,这些事实都证明 MNNG 诱导红藻
突变体的有效性 。在龙须菜以往的诱变研究中材料主
要是幼配子体[ 4-5] ,而在本实验中我们沿继以前的诱变
方法 ,选取四分孢子体为实验材料 ,发生了色素突变和
生长差异。使用 30 mg/L 的 MNNG诱变 30 min的处
理组生长速度和分枝数明显高于其他各组 ,可以作为
下一步筛选的材料。
通过耐羟脯氨酸变异筛选获得抗逆新品种在农业
上已有很多研究 ,但在海藻中尚未见报道。本试验借
鉴农业的方法首次将此方法运用到大型海藻龙须菜
中。以前的研究主要侧重于变异体的鉴定和分析[ 6-7] ,
而对筛选方法的建立研究较少。本实验将化学诱变和
耐羟脯氨酸相结合 ,建立起 1套筛选龙须菜优良品系
的完整方法 ,并且鉴定和分析结果显示得到的新品系
07-2与 981 相比 ,具有耐高温 、生长快 、琼胶含量高等
优良特性 。
研究表明逆境下脯氨酸积累的多少可以作为植物
抗逆性强弱的生理指标[ 11] 。高温逆境下菜心[ 7] 和甘
蓝[ 14]中都出现脯氨酸的明显积累 ,表明脯氨酸含量的
提高是对高温逆境的响应 。菜心在热胁迫下通过提高
脯氨酸含量来达到保护功能 。而脯氨酸主要通过保持
细胞膜的稳定性 ,使细胞在逆境下保持分裂能力和增
殖 ,提高存活率来提高对热胁迫的耐性[ 15] 。在高温胁
迫条件下 ,07-2与 981体内游离脯氨酸含量均有很大
变化 ,07-2 的脯氨酸含量明显高于 981。在一定程度
上反应出 07-2具有较高的耐热性 。
龙须菜优良品种的 2个衡量指标是线生长速度和
琼胶含量 。线生长速度比较的结果显示 ,07-2 的线生
长速度比 981 高约 17%,差异显著 。α-半乳糖苷酶与
琼胶合成过程有关 ,其天然作用底物是红藻糖苷。红
藻糖苷(flo ridoside)是红藻中重要的碳源储备形式之
一 ,其降解产物是小分子的半乳糖和甘油 ,而琼胶的基
本组成单位是由 β-D-和α-L-半乳糖组成的琼脂二糖 ,
因此红藻糖苷降解的碳可再参与到琼胶的合成[ 16] 。
于是将α-半乳糖苷酶活性作为龙须菜琼胶含量比较的
指标 。α-半乳糖苷酶活性比较结果显示 , 07-2 在整体
上酶活高于 981 ,因此可能会获得更好的栽培效益 。
实验表明 ,07-2与 981相比抗高温性得到明显提
高 ,证明通过耐羟脯氨酸诱变筛选获得高抗逆性植物
品种的方法在大型藻类研究中也可以得到较好的应
用。在实验条件下 , 07-2 的日平均生长速率提高约
17%,海区生长状况进一步表明 07-2的生长优势。因
此可以看出用脯氨酸类似物羟脯氨酸作选择压力进行
耐热性筛选的可行性 ,并且过程简单易操作和控制 ,是
一种筛选抗逆品种的有效方法。
参考文献:
[ 1] 　Santelices B , Doty M S.A review of Gracilaria faming [ J] .Aquacul-
ture , 1989 , 78:59-133.
[ 2] 　Xiugeng F , Xuecheng Z.A research on the transplan t of Graci laria le-
maneiformis [ C] .A Presentat ion at The 4th International Phycologi-
cal Congress.1991.
[ 3] 　Pu X , Xiugeng F , Xuecheng Z , et al.Studies on pigmentation m uta-
tion of Porphyra I:Inducement effect and genetic analysisof N-
methy-N-nit ro-Nnit rosoguanidine(NG)to conchospores of Porphyra
[ J] .Marine S ci Bull , 2002 , 21(5):19.
[ 4] 　Xuecheng Z , van der Meer J P.A genetic study on Gracilaria sjoeste-
dii [ J] .Can J Bot , 1988 , 66:2022-2026.
[ 5] 　张学成 , 张锦东 , 隋正红 , 等.江蓠属藻胆蛋白的研究Ⅰ诱变 、突
变体筛选及藻胆蛋白的光谱特性 [ J] .青岛海洋大学学报 , 1996 ,
26(3):318-326.
[ 6] 　Tantau H , Dorff ling K.In vit ro selection of hydroxyproline-resistant
cell lines of w heat (Tr it icum aest ivum):Accumulation of proline ,
decrease in osmotic potent ial , and increase in f rost tolerance [ J] .
Physiol Plant , 1991 , 82:243-248.
[ 7] 　廖飞雄 , 潘瑞炽.菜心耐羟脯氨酸初选系的耐热性 [ J] .热带亚热
带植物学报 , 2004 , 12(4):359-362.
[ 8] 　张学成 , 王永旭 , 件小南 , 等.不同产地龙须菜光合色素的比较研
究 [ J] .海洋湖沼通报 , 1993 , 1:52-58.
[ 9] 　张殿忠 , 汪沛洪 , 赵会贤.测定小麦叶片游离氨基酸含量的方法
[ J] .植物生理学通讯 , 1990(4):62-65.
[ 10] 　Yu S , Pedersen M.Theα-galactosidase of Graci laria tenu istipitata
and G.sod ida(Gigartinales, Rhodophyta).Phycologia , 1990 , 29:
454-460.
[ 11] 　Bradford M .A rapid and sensit ive method for the quantif icat ion of
microgram quantit ies of protein uti lizing the principle of protein-dye
binding [ J] .Analytical Biochemist ry , 1976 , 72:248-254.
[ 12] 　张学成 , 秦松 , 马家海, 等.海藻遗传学 [ M ] .北京:中国农业
出版社 , 2005:209.
97增刊 孟　琳 ,等:龙须菜新品系 07-2的筛选及性状分析
[ 13] 　汤章诚.逆境条件下植物脯氨酸的累积及其可能的生态学意义
[ J] .植物生理学通讯 , 1984 , (1):330-335.
[ 14] 　曹必好 , 雷建军.离体筛选甘蓝抗性变异体及其生化特性研究
[ J] .华北农学报 , 2001 , 16(2):62-66.
[ 15] 　廖雄飞 , 潘瑞炽.热胁迫下菜心脯氨酸含量变化及其在耐热中的
作用 [ J] .华南师范大学学报:自然科学版 , 2001 , 40(2):45-
49.
[ 16] 　Macler B A.Regulat ion of carbon flow by nit rogen and light in the
red alga Gelidiumcoulteri [ J] .Plant Physiology , 1986 , 82:36-141.
Selection and Characterization of a New Strain of Gracilaria lemaneiformis
MENG Lin1 , XU Di1 , CHEN Wei-Zhou2 , ZHANG Xue-Cheng1
(College of Marine Life Sciences , Ocean University of China , Qingdao 266003 , China;2.College of Science , Shantou University ,
Shantou 515063 , China)
Abstract:　After mutation by N-methyl-N′-nitro-N-nit rosoguanidine and selection wi th hydroxyproline proto-
col , a new stain of Graci laria lemanei formis , namely 07-2 , was obtained from the o riginal(981).The charac-
teristics of the selected strain w as analyzed and compared with the o riginal.The results show ed that the new
strain grew faster , survived longer than 981 at high temperature and contend higher proline than st rain 981 at
high temperature , indicating that this new st rain is bet ter tolerant to high temperature heat.Also the α-galac-
tosidase activi ty related to agar formation of 07-2 w as increased signif icantly comparing to st rain 981.Cultiva-
tion experiment in open sea in Weihai seacoast area show ed the SGR of 07-2 w as 6.21%, but that of 981 was
only 4.11%(P <0.05).
Key words:　Graci laria lemanei formis;hydroxyproline;selection;grow th rate;high temperature tolerance
责任编辑　于　卫
98 中　国　海　洋　大　学　学　报 2 0 0 9 年