全 文 ：农业环境科学学报 2007,26(2):718-722
JournalofAgro-EnvironmentScience
摘 要:为进一步探讨自然生态环境中农药残留对藻类的复合毒性,并为国家监测水质提供相应参考,采用人工光照培养箱室内
培养方法,研究了甲胺磷、氯氰菊酯及其混合物对斜生栅藻的毒性。结果显示,甲胺磷、氯氰菊酯对斜生栅藻 96h的 EC50分别为
12.31、45.75mg·L-1;甲胺磷在一定程度上抑制了氯氰菊酯的毒性,使混合农药对斜生栅藻生长的毒性表现为拮抗效应;氯氰菊酯对
叶绿素b的影响大于甲胺磷,对叶绿素a的影响小于甲胺磷。
关键词:甲胺磷;氯氰菊酯;斜生栅藻;毒性
中图分类号:X592 文献标识码:A 文章编号:1672-2043(2007)02-0718-05
收稿日期:2006-04-11
作者简介:徐晓宇(1984—),女,本科在读。
E-mail:rain06012003@yahoo.com.cn
农药正被越来越广泛地应用于农业生产,品种不
断增加、用量逐年上升。据统计2004年我国共生产农
药87万t,比上年增长12.6%。但是化学农药的大量
不规范使用严重污染了环境并影响了人们的健康。因
此在开发无毒副作用绿色农药的同时,如何科学有效
地监控环境中的化学农药并适时调整、规范农药的使
用及排放,将是解决当前农药问题的首要任务。
当前世界上约有 700多种农药,主要是有机磷
类、有机氯类和氨基甲酸酯类化合物[1]。有机磷类杀虫
剂在我国应用广泛,占杀虫剂总量70%,其中甲胺磷
占有机磷杀虫剂的70%以上[2]。由于甲胺磷毒性高、
残留期长,已被国家明令禁止在蔬菜水果等生长期短
的食用作物上喷施。然而长期以来由于其高效、广谱、
价廉等特点,有相当数量的菜农、果农仍违规使用,并
时常引起食物中毒事件及甲胺磷残留超标事件[3]。氯
甲胺磷、氯氰菊酯及其混合物对斜生栅藻的毒性
徐晓宇,魏 颖,唐红枫,张俊彦,陈素萍,熊 丽
(华中师范大学生命科学学院,湖北 武汉 430079)
CombinedToxicityEfectofMethamiclophosandCypermethrintoScenedesmusObliquus
XUXiao-yu,WEIYing,TANGHong-feng,ZHANGJun-yan,CHENSu-ping,XIONGLi
(ColegeofLifeScience,CentralChinaNormalUniversity,Wuhan430079,China)
Abstract:BasedonthetoxicityefectofmethamiclophosandcypermethrinonScenedesmusobliquusKützseparately,thecombinedtoxicity
efectofmethamiclophosandcypermethrinwasstudied.ItwasdemonstratedthatthegrowthrateofS.obliquusvariedwiththecoresponding
pesticideconcentrationsanditsgrowthwasdisconnectedwiththemitosisthussomeabnormalcelswereformed.The96hEC50valuesof
methamiclophosandcypermethrinweredeterminedbydetectingtheceldensityoftheS.obliquuscelsatdiferentconcentrationsof
methamiclophosandcypermethrinandwere12.31mg·L-1and45.75mg·L-1respectively,indicatingthatthetoxicityofmethamiclophosis
muchstrongerthancypermethrin.Methamiclophoshasamoreobviousefectonthecontentsofthephotosyntheticpigments(chlorophyl-a
andchlorophyl-b)andcausemoreseriousdamagetothechloroplast.Whenthemixturesofmethamiclophosandcypermethrinwereusedto
S.obliquus,methamiclophoscouldinhibitthetoxicityofcypermethrin,tosomeextent,whichindicatedthatthegrowthinhibitionofonepes-
ticidewasstrongerthantheirmixture,suggestingitsantagonisticefectbutnotcombiningefect.Whereas,thetwopesticidesshowedacom-
biningefectonthecontentsofchlorophyl-abutanantagonisticefectofchlorophyl-bwiththeincreasingconcentrationofeitherofthepesti-
cideinthemixture.Inaddition,theinhibitionefectofcypermethrinonthecontentofchlorophyl-bwasstrongerthanthatofmethami-
clophos,butweakeronchlorophyl-athanthatofmethamiclophos.Concerningthemultiplicityandlongevityofenvironmentalpolution,fur-
theratentionshouldbepaidforevaluatingthecombinedefectsofvariouspesticideswithotherpolutantsandtheirchronicdamagetohu-
manbeing.
Keywords:methamiclophos;cypermethrin;ScenedesmusobliquusKütz;toxicity
第26卷第2期 农 业 环 境 科 学 学 报
氰菊酯为拟除虫菊酯类农药,具有杀虫高效性,是一
种毒性较低、被广泛应用于农业生产的杀虫剂。因此
本试验选择甲胺磷和氯氰菊酯为实验试剂,具有较强
的现实意义。
藻类是水生生态系统的初级生产者,其种类多样
性和初级生产量直接影响水生态系统的结构和功能,
因而成为监测评价水环境质量的重要指标[4]。斜生栅
藻是一种极常见的浮游藻类,对毒物敏感、易获得、个
体小、繁殖快,在较短时间内可得到化学物质对其许
多世代及种群水平的影响评价,是一种很好的测试生
物。因此本实验选择斜生栅藻作为实验生物,研究甲
胺磷、氯氰菊酯及其混合物对斜生栅藻的联合毒性,
以期在进一步接近自然的环境下探讨农药对藻类的
毒性效应,并为国家监测水质提供相应参考。
1 材料与方法
1.1实验材料
斜生栅藻(ScenedesmusobliquusKütz)由中国科学
院水生生物研究所淡水藻种库提供,编号FACHB39。
1.2试剂与仪器
实验试剂:甲胺磷(methamiclophos),由湖北沙隆
达股份有限公司提供;氯氰菊酯(cypermethrin),纯度
10%,由江苏扬农华工集团有限公司提供;水生 4号
(HB-4)培养基[5]。
实验仪器:光照培养箱、冷冻离心机、高压灭菌
锅、721型分光光度计、显微镜、血球记数板。
1.3实验步骤及方法
藻种的移接、驯化培养、测试均按无菌操作进行。
器皿干热灭菌,培养液消毒(121℃,15min)。
1.3.1驯化培养
斜生栅藻在无菌条件下转至水生4号培养基中,
至对数生长期后进一步扩大培养。培养条件:温度
25~28℃,pH值7~8,白色日光灯,光暗比12h∶12h,光
强为3000lx左右。静止培养,每天定时人工摇动3
次。
1.3.2甲胺磷、氯氰菊酯对斜生栅藻EC50的测定
根据不同农药毒性的强弱和反复实验结果,设置
5个甲胺磷(氯氰菊酯)浓度梯度组和一个空白对照
组,每组3个平行样。将原藻液用水生4号培养基稀
释至OD值为0.1左右,取40mL分装于100mL锥形
瓶中,并加入相应浓度农药。于24、48、72、96h取样,
用血球计数板显微计数,测定藻类细胞密度(个·mL-1)
及650nm波长处的光密度值。用概率单位-浓度对数
法[6]计算 96hEC50,以生物量为实验终点计算的 50%
抑制浓度即为EC50。计算过程如下:
最大特定生长率(U)=(lnNt-lnN0)(t-t0)
式中:N0、Nt分别为开始期(t0)和t时刻(t)的细胞数。
抑制率(I%)=(UCK-Utox)UCK×100
式中:Uck为对照组的生长速度;Utox为有供试化合物
时的生长速度。
根据抑制率的机率单位和相应的浓度对数,用直
线回归法得到浓度效应方程,计算出半效应浓度(ef-
fectiveconcentration,EC50)。并将回归方程进行 X2检
验,结果 P<0.05,表明结果可靠,统计分析用 STATIS-
TICA软件进行[7]。
1.3.3甲胺磷、氯氰菊酯对斜生栅藻光合色素含量影
响的测定
用分光光度法测定藻色素含量。于96h取10mL
藻液,10000r·min-1离心 10min,去上清;加入 5mL
80%丙酮,摇匀,在4℃冰箱中避光抽提24h;再10000
r·min-1离心10min,取上清置于1cm石英比色杯中,
以 80%丙酮为参比,于 721型分光光度计中测量
663、646和470nm波长处抽提液的吸光值。叶绿素
含量计算公式如下[8]:
C-a+b=(1000OD470-3.27C-a-104C-b)/229
C-a=12.21OD663-2.81OD646
C-b=20.13OD646-5.03OD663
式中:C-a为叶绿素 a;C-b为叶绿素 b;C-a+b为叶
绿素总量。
1.3.4甲胺磷、氯氰菊酯对斜生栅藻联合毒性的测定
根据测得的甲胺磷、氯氰菊酯96h的EC50,设置
4个混合农药浓度梯度组 (见表1)和1个空白对照
组,每组3个平行样。按上述方法分装,于24、48、72、
96h取样测定藻类细胞密度(个·mL-1)及650nm波长
处的光密度值,并于96h时测定藻类色素含量。
表1 混合农药各组浓度
Table1Concentrationsofthemixedpesticides
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2007年3月
2 结果与分析
2.1甲胺磷、氯氰菊酯对斜生栅藻的毒性效应
2.1.1甲胺磷、氯氰菊酯对斜生栅藻生长的影响
用不同浓度甲胺磷(氯氰菊酯)分别处理藻液,以
藻细胞密度为指标做生长曲线见图1、图2。加了甲胺
磷(氯氰菊酯)的各实验组中,藻细胞生长受到不同程
度的抑制,且抑制程度与农药浓度呈正相关,显示出明
显的浓度-剂量相关性,同时符合650nm处测得的光
吸收值趋势;另外在镜检过程中,当农药浓度高时,可
以观察到部分藻细胞体积增大,子细胞出现畸形分裂,
出现人字形和裤形[4、9],说明甲胺磷,氯氰菊酯使斜生栅
藻的生长与分裂产生一定的脱偶联作用。
由图1、图2数据,用上述方法得到不同时间的概
率单位-浓度对数曲线方程:
概率单位(Y)=b×浓度对数(X)+a
经统计分析,确定各时间(24、48、72、96h)甲胺磷、
氯氰菊酯的EC50值及其95%置信区间,如表2、表3所
示。
由表2、表3得出,96h甲胺磷EC50为12.31mg·
L-1,氯氰菊酯 EC50为 45.75mg·L-1,显示 96h甲胺磷
对斜生栅藻的毒性远远高于氯氰菊酯。随时间延长,
甲胺磷EC50值变化较小,表明甲胺磷对斜生栅藻的
持效期长,斜生栅藻恢复缓慢;氯氰菊酯EC50值呈上
升趋势,表明氯氰菊酯对斜生栅藻持效期短,斜生栅
藻恢复较快。
2.1.2甲胺磷、氯氰菊酯对斜生栅藻光合色素含量的
影响
计算96h叶绿素a、叶绿素b在不同农药浓度下
的含量,并作图,如图3、图4所示。
无论叶绿素 a、叶绿素 b还是叶绿素总量,其含
量均随农药浓度增加呈下降趋势,说明甲胺磷(氯氰
图1 不同浓度甲胺磷对斜生栅藻生长影响
Figure1Efectsofdiferentconcentrationsofmethamidophoson
growthofS.obliquus
图2 不同浓度氯氰菊酯对斜生栅藻生长影响
Figure2Efectsofdiferentconcentrationsofcypermethrinon
growthofS.oliquus
表2甲胺磷对斜生栅藻的毒性
Table2ThetoxicityofmethamidophostoS.obliquus
表3 氯氰菊酯对斜生栅藻的毒性
Table3ThetoxicityofcypermethrintoS.obliquus
图3 甲胺磷对光合色素的影响
Figure3EfectsofmethamedophosonthepigmentofS.oliquus
徐晓宇等:甲胺磷、氯氰菊酯及其混合物对斜生栅藻的毒性720
第26卷第2期 农 业 环 境 科 学 学 报
菊酯)减少斜生栅藻的叶绿素含量。在图3中,当甲胺
磷浓度仅为 0.1mg·L-1时,叶绿素 a、b对甲胺磷敏
感,其含量显著减少;但当甲胺磷浓度继续增大时,其
含量却无明显变化,说明甲胺磷对光合色素含量的影
响在低浓度范围内较明显。另外叶绿素a/b值有明显
变化,表明叶绿体的结构受到很大程度的损害[7]。在图
4中,随氯氰菊酯浓度升高,光合色素含量逐渐下降,
说明氯氰菊酯对光合色素含量的影响与浓度呈负相
关,同时叶绿素a、b对氯氰菊酯也很敏感。另外叶绿
素a/b值无明显变化,表明叶绿体的结构基本不变。
由图 3、图 4比较得出,甲胺磷对光合色素含量
的影响更为显著,且对叶绿体结构造成更大程度的损
害;氯氰菊酯对叶绿素总量的影响大于甲胺磷。
2.2甲胺磷、氯氰菊酯对斜生栅藻的联合毒性效应
2.2.1甲胺磷和氯氰菊酯共同作用对斜生栅藻生长的
影响
根据表 1的混合农药配比,分别处理藻液,以藻
细胞密度为指标作生长曲线见图5。加了混合农药的
各实验组中,藻类细胞的生长均受到不同程度的抑制,
且抑制程度与农药浓度呈正相关。从生长趋势可看
出,A、B、C、D四组对斜生栅藻的生长抑制依次增强,
表明A、B、C、D四组混合农药对藻的毒性依次增强。
由 B、C组藻的生长趋势看出,C组斜生栅藻受
到的生长抑制大于 B组。因 C组甲胺磷浓度高于 B
组,氯氰菊酯浓度低于B组(见表1),所以在对斜生栅
藻的生长抑制中甲胺磷起决定性作用,也说明甲胺磷
毒性强于氯氰菊酯。相同结论也可在比较A与C组
(B与D组)藻类的生长趋势中得出。
分析A、B(C、D)组藻类的生长趋势:A与B组(C
与 D组)甲胺磷浓度相同,B组(D组)氯氰菊酯浓度
为A组(C组)两倍,理论预测B组生长趋势应弱于A
组,但是A、B(C、D)组生长曲线在72h后却出现交叉
(重叠)状态,即B组(D组)的生长速度超过(赶上)了
A组(C组)。这表明,甲胺磷在一定程度上抑制了氯
氰菊酯的毒性,即这两种农药对斜生栅藻生长的联合
毒性表现为拮抗效应,而非加和效应。
2.2.2混合农药对斜生栅藻光合色素含量的影响
计算96h叶绿素a、叶绿素b在不同混合农药浓
度下的含量并作图,见图6。叶绿素a、叶绿素b以及
叶绿素总量均随农药浓度上升呈缓慢下降趋势,说明
混合农药可减少斜生栅藻的叶绿素含量,但影响很
小。另外叶绿素a/b值有明显变化,表明叶绿体的结构
图4 氯氰菊酯对光合色素的影响
Figure4EfectsofCypermethrinonthepigmentofS.oliquus 图5混合农药对斜生栅藻生长的影响
Figure5EfectsofMixedpesticideonthegrowthofS.oliquus
图6 混合农药对光和色素的影响
Figure6 EfectsofMixedpesticideonthepigmentofS.oliquus
721
2007年3月
受到很大程度的损害。将实验组叶绿素a、b的含量比
对照组减少的百分比列于表4。
比较B、C组:B组混合农药对于叶绿素a的毒性
远远低于C组,但是对于叶绿素b的毒性却远远高
于C组。因为B组氯氰菊酯浓度较高,C组甲胺磷浓
度较高(见表1),所以氯氰菊酯对叶绿素b的毒性起
决定作用,即氯氰菊酯对叶绿素 b的影响大于甲胺
磷,甲胺磷对叶绿素 a的毒性起决定作用,即甲胺磷
对叶绿素a的影响大于氯氰菊酯。
比较A、C、D三组,虽然C组甲胺磷浓度高于A
组(氯氰菊酯浓度相同),D组甲胺磷及氯氰菊酯浓度
均高于A组(见表1),但是对于叶绿素b的毒性却都
小于A组,说明混合农药中甲胺磷或氯氰菊酯的浓
度适当增大时,对于叶绿素b的复合毒性表现为拮抗
效应,而非加和效应。
3 结论
本实验探讨了甲胺磷、氯氰菊酯复配对于斜生栅
藻的生长抑制作用以及光合色素含量变化的影响。实
验证明,当不同浓度甲胺磷、氯氰菊酯分别作用于斜
生栅藻时,对其生长的影响表现为浓度相关性,且使
斜生栅藻的生长与分裂产生一定的脱偶联作用。由
96hEC50值及相关图表得出,甲胺磷对斜生栅藻的毒
性高于氯氰菊酯,对光合色素含量的影响更为显著,
且对叶绿体结构造成更大程度的损害。当甲胺磷、氯
氰菊酯以不同浓度配比混合后作用于斜生栅藻时,甲
胺磷在一定程度上抑制了氯氰菊酯的毒性,使混合农
药对斜生栅藻生长的联合毒性表现为拮抗效应。当混
合农药中任一组分浓度适当增大时,对于叶绿素a的
联合毒性表现为加和效应,对于叶绿素b的联合毒性
则表现为拮抗效应。另外,氯氰菊酯对叶绿素b的影
响大于甲胺磷,对叶绿素a的影响小于甲胺磷。
农药对藻的毒性效应受到多种环境因子制约并
与藻的种类有关,因此将藻做为环境污染的测试生物
将是一个十分复杂和漫长的研究过程[10]。本实验仅为
两种农药混合后对斜生栅藻的毒性研究,且在室内模
拟条件下进行,无法反映出完整生态环境对藻生长的
影响,又因斜生栅藻对甲胺磷和氯氰菊酯的抗性都较
低,恢复缓慢,故同时还需要注意两者的长期毒性。所
以本文仅是混合农药对藻类毒性效应的初步研究,对
于农药的复合污染机制,还有待进一步探讨。
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表4 实验组叶绿素a、b含量比对照组减小的百分比
Table4Thedecreasepercentageofchlorophyl-aand
chlorophyl-bcomparedtothecontrolgroup
徐晓宇等:甲胺磷、氯氰菊酯及其混合物对斜生栅藻的毒性722