全 文 ：第３３卷 第４期　　　　　 　　　　　 渔　业　科　学　进　展　 Ｖｏｌ．３３，Ｎｏ．４
２　０　１　２ 年 ８ 月　　　　　　　　ＰＲＯＧＲＥＳＳ　ＩＮ　ＦＩＳＨＥＲＹ　ＳＣＩＥＮＣＥＳ　 Ａｕｇ．，２０１２
刺参龙须菜混养系统中细菌数量与群落组成
高　菲１　孙慧玲１＊　王肖君１　谭　杰１　燕敬平１
（１农业部海洋渔业可持续发展重点实验室 中国水产科学研究院黄海水产研究所，青岛２６６０７１）
摘　要　　以刺参龙须菜混合养殖生态系统为研究对象，研究了系统中细菌数量的变化规律，沉积物
中细菌群落结构和多样性的变化。结果表明，实验期间，刺参单养组及不同配比的刺参龙须菜混养
组，围隔内底层水体中细菌数量均呈增高趋势，细菌数量在２．１４×１０６～４．２７×１０６ｃｅｌｓ／ｍｌ之间。不
同刺参龙须菜配比的养殖系统内沉积物中的细菌数量在１．５５×１０８～３．３９×１０８ｃｅｌｓ／ｇｄｗ之间，比水
体中的细菌数量高两个数量级。ＤＧＧＥ图谱的ＵＰＧＭＡ树状结构聚类分析图表明，不同取样时间（６
月１７日、７月７日）的沉积物细菌组成差异较大。系统发育分析表明，刺参龙须菜混养围隔内沉积物
的优势细菌主要归属于拟杆菌纲（Ｂａｃｔｅｒｏｉｄｅｔｅｓ）、γ－变形菌纲（γ－ｐｒｏｔｅｏｂａｃｔｅｒｉａ）、δ－变形菌纲（δ－ｐｒｏ－
ｔｅｏｂａｃｔｅｒｉａ）和α－变形菌纲（α－ｐｒｏｔｅｏｂａｃｔｅｒｉａ）。
关键词　　刺参　　龙须菜　　细菌　　混养
中图分类号　Ｓ９６８．９　　　文献识别码　Ａ　　　文章编号　１０００－７０７５（２０１２）０４－００８９－１０
国家自然科学基金青年基金（４１１０６１４５）、国家科技支撑计划项目（２０１１ＢＡＤ１３Ｂ０２）、国家８６３计划（２０１２ＡＡ１０Ａ４１２）、中国博士后科学基金
（２００９０４５１３５５）和山东省博士后创新资金项目（２００９０２００７）共同资助
＊通讯作者。Ｅ－ｍａｉｌ：ｓｕｎｈｌ＠ｙｓｆｒｉ．ａｃ．ｃｎ，Ｔｅｌ：（０５３２）８５８１９１９９
收稿日期：２０１１－０８－２５；接受日期：２０１２－０２－２１
作者简介：高　菲（１９８１－），女，博士，助理研究员，主要从事养殖生态学研究。Ｅ－ｍａｉｌ：ｇａｏｆｅｉ＠ｙｓｆｒｉ．ａｃ．ｃｎ，Ｔｅｌ：（０５３２）８５８０３３７５
Ｔｈｅ　ａｍｏｕｎｔ　ａｎｄ　ｃｏｍｍｕｎｉｔｙ　ｃｏｍｐｏｓｉｔｉｏｎ　ｏｆ　ｂａｃｔｅｒｉａ　ｉｎ　ｔｈｅ　ｃｏ－ｃｕｌｔｕｒｅ
ｓｙｓｔｅｍ　ｏｆ　Ａｐｏｓｔｉｃｈｏｐｕｓ　ｊａｐｏｎｉｃｕｓ　ａｎｄ　Ｇｒａｃｉｌａｒｉａ　ｌｅｍａｎｅｉｆｏｒｍｉｓ
ＧＡＯ　Ｆｅｉ　１　ＳＵＮ　Ｈｕｉ－ｌｉｎｇ１＊　ＷＡＮＧ　Ｘｉａｏ－ｊｕｎ１　
ＴＡＮ　Ｊｉｅ１　ＹＡＮ　Ｊｉｎｇ－ｐｉｎｇ１
（１　Ｋｅｙ　Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ　ｏｆ　Ｓｕｓｔａｉｎａｂｌｅ　Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ　ｏｆ　Ｍａｒｉｎｅ　Ｆｉｓｈｅｒｉｅｓ，Ｍｉｎｉｓｔｒｙ　ｏｆ　Ａｇｒｉｃｕｌｔｕｒｅ，Ｙｅｌｏｗ　Ｓｅａ
Ｆｉｓｈｅｒｉｅｓ　Ｒｅｓｅａｒｃｈ　Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ，Ｃｈｉｎｅｓｅ　Ａｃａｄｅｍｙ　ｏｆ　Ｆｉｓｈｅｒｙ　Ｓｃｉｅｎｃｅｓ，Ｑｉｎｇｄａｏ　２６６０７１）
ＡＢＳＴＲＡＣＴ　　Ｔｈｅ　ｖａｒｉａｔｉｏｎ　ｏｆ　ａｍｏｕｎｔ　ａｎｄ　ｃｏｍｍｕｎｉｔｙ　ｃｏｍｐｏｓｉｔｉｏｎ　ｏｆ　ｂａｃｔｅｒｉａ　ｉｎ　ｔｈｅ　ｓｅａ　ｗａｔｅｒ
ａｎｄ　ｓｅｄｉｍｅｎｔｓ　ｏｆ　ｍｏｎｏｃｕｌｔｕｒｅ（Ａｐｏｓｔｉｃｈｏｐｕｓ　ｊａｐｏｎｉｃｕｓ）ａｎｄ　ｃｏ－ｃｕｌｔｕｒｅ　ｓｙｓｔｅｍｓ（Ａ．ｊａｐｏｎｉｃｕｓ
ｃｏ－ｃｕｌｔｕｒｅｄ　ｗｉｔｈ　Ｇｒａｃｉｌａｒｉａ　ｌｅｍａｎｅｉｆｏｒｍｉｓ）ｗｅｒｅ　ｅｖａｌｕａｔｅｄ．Ｔｈｅ　ｔｏｔａｌ　ｎｕｍｂｅｒｓ　ｏｆ　ｂａｃｔｅｒｉａ
（２．１４×１０６～４．２７×１０６ｃｅｌｓ／ｍｌ）ｉｎ　ｔｈｅ　ｂｏｔｔｏｍ　ｗａｔｅｒ　ｏｆ　ｔｈｅ　ｍｏｎｏｃｕｌｔｕｒｅ　ａｎｄ　ｃｏ－ｃｕｌｔｕｒｅ　ｓｙｓ－
ｔｅｍｓ　ｉｎｃｒｅａｓｅｄ　ｄｕｒｉｎｇ　ｔｈｅ　ｐｅｒｉｏｄ　ｏｆ　ｔｈｅ　ｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔ．Ｔｈｅ　ｂａｃｔｅｒｉａ　ｎｕｍｂｅｒｓ　ｉｎ　ｔｈｅ　ｓｕｒｆａｃｅ　ｓｅｄｉ－
ｍｅｎｔｓ　ｒａｎｇｅｄ　ｆｒｏｍ　１．５５×１０８ｔｏ　３．３９×１０８ｃｅｌｓ／ｇｄｗ　ｉｎ　ｔｈｅ　ｓｙｓｔｅｍｓ，ｗｈｉｃｈ　ｗｅｒｅ　ｍｕｃｈ　ｈｉｇｈｅｒ
ｔｈａｎ　ｔｈｏｓｅ　ｉｎ　ｔｈｅ　ｂｏｔｔｏｍ　ｓｅａ　ｗａｔｅｒ．ＵＰＭＧＡ　ｃｌｕｓｔｅｒ　ａｎａｌｙｓｉｓ　ｏｆ　ＤＧＧＥ　ｆｉｎｇｅｒｐｒｉｎｔ　ｆｒｏｍ　ｓｅｄｉ－
ｍｅｎｔｓ　ｒｅｖｅａｌｅｄ　ｔｈｅ　ｂａｃｔｅｒｉａｌ　ｃｏｍｍｕｎｉｔｙ　ｉｎ　ｔｈｅ　ｓａｍｅ　ｓａｍｐｌｉｎｇ　ｄａｔｅ　ｈａｄ　ｈｉｇｈｅｒ　ｓｉｍｉｌａｒｉｔｙ　ｔｈａｎ
ｔｈｏｓｅ　ｉｎ　ｄｉｆｆｅｒｅｎｔ　ｓａｍｐｌｉｎｇ　ｄａｔｅｓ．Ｐｈｙｌｏｇｅｎｅｔｉｃ　ａｎａｌｙｓｉｓ　ｓｈｏｗｅｄ　ｔｈａｔ　ｔｈｅ　ｄｏｍｉｎａｎｔ　ｂａｃｔｅｒｉａ　ｏｆ
　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　渔　业　科　学　进　展 第３３卷　
ｔｈｅ　ｓｅｄｉｍｅｎｔ　ｉｎ　ｔｈｅ　ｍｏｎｏｃｕｌｔｕｒｅ　ａｎｄ　ｃｏ－ｃｕｌｔｕｒｅ　ｓｙｓｔｅｍｓ　ｂｅｌｏｎｇ　ｔｏα－ｐｒｏｔｅｏｂａｃｔｅｒｉａ，γ－ｐｒｏ－
ｔｅｏｂａｃｔｅｒｉａ，δ－ｐｒｏｔｅｏｂａｃｔｅｒｉａ　ａｎｄ　ｂａｃｔｅｒｏｉｄｅｔｅｓ．
ＫＥＹ　ＷＯＲＤＳ　　Ａｐｏｓｔｉｃｈｏｐｕｓ　ｊａｐｏｎｉｃｕｓ　　Ｇｒａｃｉｌａｒｉａ　ｌｅｍａｎｅｉｆｏｒｍｉｓ　　
Ｂａｃｔｅｒｉａ　　Ｃｏ－ｃｕｌｔｕｒｅ
大型藻类与养殖动物具有生态上的互补性，大型藻类能吸收养殖动物释放到水体中多余的营养盐，转化为
具有较高经济价值的产品，同时大型藻类能固碳、产生氧气，调节水体的ｐＨ值，从而达到对养殖环境的生物修
复和生态调控作用。现已发展了大型藻类与鱼（Ｖａｎｄｅｍｅｕｌｅｎ　ｅｔａｌ．　１９９０；Ｎｅｏｒｉ　ｅｔ　ａｌ．　１９９１；Ｃｈｏｐｉｎ　ｅｔ
ａｌ．　１９９９）、虾（王吉桥等　２００１；Ｍａｒｉｎｈｏ－Ｓｏｒｉａｎｏ　ｅｔ　ａｌ．　２００２）、贝类（Ｅｖａｎｓ　ｅｔ　ａｌ．　２０００；Ｄｅｍｅｔｒｏｐｏｕｌｏｓ
ｅｔ　ａｌ．　２００４）和大型藻类与几种生物（Ｎｅｏｒｉ　ｅｔ　ａｌ．　２０００；Ｃｈｏｗｅｔ　ａｌ．　２００１）混养的多种综合养殖模式。
龙须菜Ｇｒａｃｉｌａｒｉａ　ｌｅｍａｎｅｉｆｏｒｍｉｓ能有效吸收和去除栉孔扇贝Ｃｈｌａｍｙｓ　ｆａｒｒｅｒｉ、文蛤Ｍｅｒｅｔｒｉｘ　ｅｒｅｔｒｉｘ和
黑鲳Ｓｅｂａｓｔｏｄｅｓ　ｆｕｓｃｅｓｃｅ等的排泄物，可以作为生物过滤器与养殖动物进行综合养殖，随着龙须菜的收获，降
低水体的营养负荷，同时提高养殖的经济效益和生态效益（胡海燕等　２００３；毛玉泽等　２００６；孙　伟等
２００６）。
微生物是养殖生态系统的重要组成部分，在养殖生态系统的物质循环和能量流动中发挥着巨大作用
（郑天凌等　１９９４）。尽管国内外对不同尺度的多元综合养殖生态系统中养殖生物的生长特性、营养盐排泄和吸
收效率、系统输出和经济效益评估等有很多报道，但对微生物在不同养殖模式下的数量、群落结构的变化等研
究较少。
我国的刺参增养殖业发展迅速，现已成为我国海水养殖单一经济总量最大的养殖品种。然而，长期以来刺
参以单养模式为主，既不利于充分利用水体空间和饵料资源，也不利于保持养殖系统的稳定。本研究以刺参龙
须菜混合养殖生态系统为研究对象，研究了养殖系统水体和沉积物中细菌数量的变化规律、沉积物中细菌群落
结构和多样性的变化，获得了养殖环境中微生物群落结构的初步研究结果，可为探讨刺参龙须菜多元养殖系统
中的微生物动力学提供理论依据。
１　材料与方法
１．１　实验设计
实验于２０１０年５月１９日～７月７日在山东省乳山市刺参养殖池内进行。围隔用帆布制作，用木桩固定
在养殖池中，面积为２．２５ｍ２，实验期间水深１．１～１．３ｍ。每个围隔内放置４个波纹板框架。实验刺参初始重
量为８．０１±０．０１ｇ，龙须菜从福建莆田购买，空运至养殖池，暂养７ｄ后夹苗。
实验共设３个处理，每个处理设３个平行。每个围隔内刺参均为４５头，龙须菜分为３个初始密度：０、
１８０、３６０ｇ／ｍ２。
１．２　样品采集
用自制采水器从每个围隔底部采集海水，加入终浓度为２％的无菌甲醛固定，冷藏带回实验室，冷藏保存
并于４８ｈ内用荧光显微镜观察计数细菌数量。
用药匙从波纹板上刮取沉积物于灭菌冻存管中。现场从所取的沉积物中称取０．５ｇ于另一冻存管中用于
细菌数量测定，记号笔编号后在冻存管中加５ｍｌ无菌水，混匀后加终浓度为５％的甲醛，冷藏带回实验室。其
余沉积物样品用于细菌多样性分析。
实验期间水温为１７．２～３０．１℃，盐度在３１．９６～３２．８６之间，ｐＨ值变化范围为７．０９～８．５１。水温、盐度
和ｐＨ值等指标使用美国ＹＳＩ－５５６型水质分析仪现场测定。
０９
　第４期 　　高　菲等：刺参龙须菜混养系统中细菌数量与群落组成
１．３　水体细菌数量测定
养殖水体细菌数量测定采用吖啶橙荧光计数法。取５ｍｌ固定后水样加入１ｍｌ（０．１％）吖啶橙染色３ｍｉｎ。
取适量染色后样品，将细菌抽滤到孔径为０．２２μｍ的去荧光聚碳酸酯滤膜（Ｗｈａｔｍａｎ）上，用荧光显微镜拍照
计数，每个样品随机计数１０个视野，每个视野细菌数在３０～１００个为宜（张　喆　２００８；李　彬等　２０１０）。
１．４　沉积物细菌数量测定
表层沉积物细菌数量采用吖啶橙荧光计数法测定。将固定的样品离心（１　０００ｒ／ｍｉｎ，１０ｍｉｎ）后，取１ｍｌ
上清液４８ｈ内荧光观察计数。荧光计数方法同水体细菌计数方法。
１．５　沉积物ＤＮＡ提取
取冷冻保存的围隔内沉积物样品，解冻后，１０　０００ｇ离心３ｍｉｎ（４℃），弃上清液。搅匀后称取相同质量的
泥样，用Ｅｐｉｃｅｎｔｒｅ土壤ＤＮＡ提取试剂盒进行基因组总ＤＮＡ的提取（高　菲等　２０１０）。提取的ＤＮＡ通过
琼脂糖凝胶电泳（１．０％）检测。
１．６　细菌１６ＳｒＤＮＡ　Ｖ３区ＰＣＲ扩增
以提取的沉积物基因组ＤＮＡ为模板，进行细菌１６ＳｒＤＮＡ　Ｖ３区ＰＣＲ扩增。细菌通用引物序列为：ＧＣ－
３４１ｆ（５’－ＣＧＣ　ＣＣＧ　ＣＣＧ　ＣＧＣ　ＧＣＧ　ＧＣＧ　ＧＧＣ　ＧＧＧ　ＧＣＧ　ＧＧＧ　ＧＣＡ　ＣＧＧ　ＧＧＧ　ＧＣＣ　ＴＡＣ　ＧＧＧ　ＡＧＧ
ＣＡＧ　ＣＡＧ－３’）（Ｍｕｙｚｅｒ　ｅｔ　ａｌ．　１９９３）和９０７ｒ（５’－ＣＣＧＴＣＡＡＴＴＣＭＴＴＴＧＡＧＴＴＴ－３’）（Ａｌａｗｉ　ｅｔ　ａｌ．　
２００７）。ＰＣＲ程序为：９４℃预变性５ｍｉｎ，然后９４℃变性４５ｓ，６５℃退火４５ｓ（每个循环降０．８℃，进行１８个
循环）（Ｔｏｕｃｈｄｏｗｎ　ＰＣＲ），７２℃延伸４５ｓ，然后再进行１２个循环：９４℃４５ｓ，５５℃４５ｓ，７２℃４５ｓ，最后７２℃
延伸１０ｍｉｎ。扩增产物经１％琼脂糖凝胶电泳进行检测。
１．７　ＤＧＧＥ凝胶电泳、条带切割、克隆与测序
取１６ＳｒＤＮＡ　Ｖ３区ＰＣＲ产物用Ｂｉｏ－Ｒａｄ公司Ｄ－ｃｏｄｅ　Ｓｙｓｔｅｍ 电泳仪进行ＤＧＧＥ电泳分离，电泳程序见
高　菲等（２０１０）。从ＤＧＧＥ凝胶上小心切下ＤＧＧＥ条带，用２００μｌ无菌水冲洗３次后，加入５０μｌ无菌水在
４℃过夜。１２　０００ｇ离心５ｍｉｎ，收集上清液。以此作为模板，用引物３４１ｆ（不含ＧＣ－ｃｌａｍｐ）、９０７ｒ进行１６Ｓ
ｒＤＮＡ　Ｖ３区ＰＣＲ扩增。克隆与测序程序参考高　菲等（２０１０）。
１．８　１６ＳｒＤＮＡ序列分析
所得序列用ＢＬＡＳＴ程序进行同源性比对，获得与本研究所得序列相似性最高的序列。将这些序列与本
研究获得的１６ＳｒＤＮＡ序列一起，使用ＣＬＵＳＴＡＬ　Ｗ 工具进行多序列比对，然后使用 ＭＥＧＡ中的Ｋｉｍｕｒａ双
参数修正模型进行系统发育树的构建（Ｌｉ　ｅｔ　ａｌ．　２００８）。
２　结果与分析
２．１　刺参和龙须菜的生长情况
刺参和龙须菜的生长情况见表１。龙须菜初始养殖密度为３６０ｇ／ｍ２的处理组，刺参的特定增长率最高，其
次是龙须菜初始养殖密度为１８０ｇ／ｍ２的处理组，未混养龙须菜的围隔中的刺参特定增长率最低。而初始养殖
密度为１８０ｇ／ｍ２处理组中龙须菜的特定增长率高于初始养殖密度为３６０ｇ／ｍ２的处理组。
２．２　混养系统底层水体细菌总数的变化
图１显示的是实验期间不同配比的刺参龙须菜混养系统底层水体的细菌总数的变化情况。实验过程中，
１９
　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　渔　业　科　学　进　展 第３３卷　
不同处理的混养系统中底层水体的细菌数量均呈增长趋势。实验结束时（７月７日）Ｌ０处理组的细菌总数显
著高于初始值（Ｐ＜０．０５），６月１７日，Ｌ１８０处理组细菌数量显著高于初始值，而后细菌数量又下降，Ｌ３６０处理
组的细菌数量在实验过程中持续增加，在实验结束时显著高于初始值（Ｐ＜０．０５）。
表１　刺参和龙须菜的生长情况
Ｔａｂｌｅ　１　Ｔｈｅ　ｇｒｏｗｔｈ　ｐｅｒｆｏｒｍａｎｃｅ　ｏｆ　Ａ．ｊａｐｏｎｉｃｕｓ　ａｎｄ　Ｇ．ｌｅｍａｎｅｉｆｏｒｍｉｓ
组别
Ｇｒｏｕｐ
刺参Ａ．ｊａｐｏｎｉｃｕｓ
初始平均湿重
Ｉｎｉｔｉａｌ　ｗｅｔ　ｗｅｉｇｈｔ（ｇ）
终平均湿重
Ｆｉｎａｌ　ｗｅｔ　ｗｅｉｇｈｔ（ｇ）
特定增长率
ＳＧＲ（％／ｄ）
龙须菜Ｇ．ｌｅｍａｎｅｉｆｏｒｍｉｓ
初始湿重
Ｉｎｉｔｉａｌ　ｗｅｔ　ｗｅｉｇｈｔ（ｇ）
终湿重
Ｆｉｎａｌ　ｗｅｔ　ｗｅｉｇｈｔ（ｇ）
特定增长率
ＳＧＲ（％／ｄ）
Ｌ０　 ８．０１±０．０２　 １８．６２±１．２９　 ０．９９±０．０８ ／ ／ ／
Ｌ１８０　 ８．０２±０．０１　 １７．４７±０．３７　 １．０３±０．０４　 ４０５．０６±６．２３　 ６８５．２１±２３８．６１　 １．０１±０．７０
Ｌ３６０　 ８．０１±０．０１　 １８．６３±２．４９　 １．１７±０．１３　 ８１０．２６±８．９４　 １　２４２．０８±１０２．７５　 ０．８９±０．１８
２．３　混养系统沉积物细菌总数的变化
６月１７日和７月７日不同配比的刺参龙须菜混养系统沉积物中的细菌数量见图２。６月１７日Ｌ０、Ｌ１８０、
Ｌ３６０处理组的细菌数量分别为３．３９×１０８、１．５５×１０８、１．５６×１０８　ｃｅｌｓ／ｇｄｗ，７月７日Ｌ０、Ｌ１８０、Ｌ３６０处理组
的细菌数量分别为１．６１×１０８、１．８９×１０８、３．３２×１０８　ｃｅｌｓ／ｇｄｗ。
２．４　沉积物细菌１６ＳｒＤＮＡ　Ｖ３区特征片段ＤＧＧＥ指纹图谱分析
从ＤＧＧＥ图谱的ＵＰＧＭＡ树状结构聚类分析图，可以得到不同处理组养殖系统细菌群落组成的相似性
关系（图３）：６月１７日的所有样品聚集到一个分支上，７月７日的所有样品聚在另一个分支上。在６月１７日的
样品中，３个刺参单养围隔内的样品又聚为一簇，表明刺参单养组内细菌群落组成相似度最高；Ｌ１８０－２和
Ｌ１８０－３的细菌组成相似度很高（８６％），但与Ｌ１８０－１的相似度较低；比较而言，Ｌ３６０处理组内细菌组成的相似
度最低。
２．５　沉积物细菌１６ＳｒＤＮＡ序列分析
刺参龙须菜混养系统沉积物的细菌１６ＳｒＤＮＡ　Ｖ３区特征片段经ＤＧＧＥ分离、条带切割，共得到３２条
ＤＧＧＥ条带。将条带进行克隆、测序，所得到的序列大小在５５９～５８９ｂｐ范围内。
将所得序列输入ＧｅｎＢａｎｋ，用Ｂｌａｓｔ程序进行检索和同源性比较。结果表明，绝大多数最相似序列均为来
２９
　第４期 　　高　菲等：刺参龙须菜混养系统中细菌数量与群落组成
自于海洋环境的细菌克隆（３０条，表２），其余的两条来自于淡水或土壤环境。其中１７条来自海洋或河口沉积
物，４条来自海水，１条来养鱼场的外排水，３条来自海绵组织，１条来自大型藻类，１条来自甲藻。
图３　刺参龙须菜混养系统沉积物细菌群落的ＵＰＧＭＡ聚类分析
Ｆｉｇ．３　ＵＰＧＭＡ　ｃｌｕｓｔｅｒ　ａｎａｌｙｓｉｓ　ｏｆ　ｂａｃｔｅｒｉａｌ　ｃｏｍｍｕｎｉｔｙ　ｆｒｏｍ　ｔｈｅ　ｓｅｄｉｍｅｎｔｓ　ｉｎ
ｔｈｅ　ｃｏ－ｃｕｌｔｕｒｅ　ｓｙｓｔｅｍ　ｏｆ　Ａ．ｊａｐｏｎｉｃｕｓ　ａｎｄ　Ｇ．Ｌｅｍａｎｅｉｆｏｒｍｉｓ
２．６　沉积物细菌１６ＳｒＤＮＡ系统发育分析
系统发育分析（图４）可以看出，获得的３２条序列分别归属于４个细菌类群：拟杆菌纲（Ｂａｃｔｅｒｏｉｄｅｔｅｓ）、γ－
变形菌纲（γ－ｐｒｏｔｅｏｂａｃｔｅｒｉａ）、δ－变形菌纲（δ－ｐｒｏｔｅｏｂａｃｔｅｒｉａ）和α－变形菌纲（α－ｐｒｏｔｅｏｂａｃｔｅｒｉａ），其中１６条序列
（ｈｙ１、ｈｙ２、ｈｙ３、ｈｙ４、ｈｙ６、ｈｙ８、ｈｙ９、ｈｙ１２、ｈｙ１３、ｈｙ１４、ｈｙ１５、ｈｙ１６、ｈｙ１８、ｈｙ１９、ｈｙ２０、ｈｙ２５）属于拟杆菌纲，１０条
序列（ｈｙ１１、ｈｙ２１、ｈｙ２３、ｈｙ２４、ｈｙ２６、ｈｙ２９、ｈｙ３０、ｈｙ３１、ｈｙ３２、ｈｙ３４）属于γ－变形菌纲，３条序列（ｈｙ２２、ｈｙ２７、
ｈｙ３３）属于δ－变形菌纲，１条序列（ｈｙ２８）属于α－变形菌纲。
３　讨论
３．１　刺参龙须菜混养水体的细菌数量
实验期间，围隔内底层水体中的细菌数量在２．１４×１０６～４．２７×１０６　ｃｅｌｓ／ｍｌ之间。细菌数量与李　彬等
（２０１０）调查的秋、冬季节刺参养殖池塘底层水体的细菌数量在相同的数量级。与山东沿岸海域包括日照沿海、
威海沿海及青岛沿海（丁字湾、小岛湾、胶州湾、唐岛湾及琅琊湾）夏季及秋季浮游细菌丰度相当（分别介于
２．７４×１０６～９．６０×１０６ｃｅｌｓ／ｍｌ和１．７６×１０６～５．２６×１０６ｃｅｌｓ／ｍｌ之间）（赵三军等　２００５；张　喆　２００８）。
这一结果远高于采用培养法测定的刺参养殖池塘水体细菌数量（１０．８×１０３～３．２×１０４　ｃｅｌｓ／ｍｌ）（关晓燕等　
２０１０）。
在春、夏季，随着养殖时间的延长，养殖水体异养细菌数量呈增加趋势（高尚德等　１９９５；郭　平等　１９９４）。
本研究在５～７月进行，实验期间，刺参单养组及不同配比的刺参龙须菜混养组水体中细菌数量都呈增高趋势。
实验期间正处于水温上升阶段，养殖池塘水温从实验开始时的１７．２℃逐渐上升到实验结束时的３０．１℃，水温升
高可能是引发养殖水体细菌数量增加的一个主要因素，已有很多学者报道养殖水体的细菌数量随水温的升高而
升高（郭　平等　１９９４；晏荣军等　２００２；关晓燕等　２０１０）。在春、夏季养殖系统中水温呈上升趋势，随着养殖池
塘水温的上升，物质循环也加快，水体中营养丰富，异养细菌繁殖越来越旺盛，细菌的数量在水体中呈上升趋势。
３９
　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　渔　业　科　学　进　展 第３３卷　４９
　第４期 　　高　菲等：刺参龙须菜混养系统中细菌数量与群落组成 ５９
　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　渔　业　科　学　进　展 第３３卷　
节点处的数字为Ｂｏｏｔｓｔｒａｐ　１　０００个循环的置信度（只显示在５０％以上的置信度）
Ｂｏｏｔｓｔｒａｐ　ｔｅｓｔ　ｗａｓ　ｂａｓｅｄ　ｏｎ　１，０００ｒｅｐｌｉｃａｔｅｓ　ａｎｄ　ｔｈｅ　ｂｏｏｔｓｔｒａｐ　ｖａｌｕｅｓ　ｌｅｓｓ　ｔｈａｎ　５０％ ｗｅｒｅ　ｏｍｉｔｔｅｄ
图４　刺参龙须菜混养系统沉积物细菌１６ＳｒＤＮＡ系统发育树
Ｆｉｇ．４　Ｐｈｙｌｏｇｅｎｅｔｉｃ　ａｎａｌｙｓｅｓ　ｏｆ　ｂａｃｔｅｒｉａｌ　１６ＳｒＤＮＡ　Ｖ３ｆｒａｇｍｅｎｔｓ　ｒｅｔｒｉｅｖｅｄ　ｆｒｏｍ　ＤＧＧＥ　ｂａｎｄｓ　ｏｆ　ｔｈｅ
ｓｅｄｉｍｅｎｔｓ　ｉｎ　ｔｈｅ　ｃｏ－ｃｕｌｔｕｒｅ　ｓｙｓｔｅｍ　ｏｆ　Ａ．ｊａｐｏｎｉｃｕｓ　ａｎｄ　Ｇ．ｌｅｍａｎｅｉｆｏｒｍｉｓ
６９
　第４期 　　高　菲等：刺参龙须菜混养系统中细菌数量与群落组成
　　在实验结束时，混养龙须菜数量最多（Ｌ３６０组）的围隔底层水体的细菌数量高于刺参单养组，Ｌ１８０组的底
层水体的细菌数量低于刺参单养组，但无显著差异。这一结果表明，水温对细菌数量的影响作用可能大于养殖
生物。中国对虾和黑鲷混养系统水体中的异养细菌、弧菌和硝酸盐还原菌的数量在５月１６日～６月２６日也
没有显著差异（李秋芬等　２００２），然而到７月底，中国对虾和黑鲷混养系统水体中的异养细菌、弧菌和硝酸盐
还原菌的数量显著低于对虾单养池（李秋芬等　２００２）；虾－蟹混养体系以及虾－罗非鱼混养系统水体中异养细
菌的数量也出现相似的变化规律（钟硕良等　１９９７），作者分析认为养殖体系中有机物的含量是影响异养细菌
总数的另一重要环境因子。
３．２　沉积物的细菌组成
６月１７日和７月７日不同刺参龙须菜配比的养殖系统内沉积物中的细菌数量在１．５５×１０８～３．３９×１０８
ｃｅｌｓ／ｇｄｗ之间，比水体中的细菌数量高两个数量级。凡纳滨对虾养殖池塘沉积物中可培养异养细菌数量通常
比水体中高２～３个数量级（１．０×１０６～２．２×１０７　ＣＦＵ／ｇ）（李烁寒等　２００９）。中国对虾和黑鲷混养池塘底泥
中的可培养异养细菌数量高于同期水中菌量ｌ～２个数量级（７月底的最高值为１．０７×１０６　ＣＦＵ／ｇ）（李秋芬等
　２００２；查广才等　２００６）。
从ＤＧＧＥ图谱的ＵＰＧＭＡ树状结构聚类分析图可以看出，不同取样时间（６月１７日、７月７日）的沉积物
细菌组成差异较大，这种差异大于不同处理组的细菌组成差异。而在混养实验进行到３０ｄ时的沉积物样品
中，刺参单养组与刺参龙须菜混养处理组的沉积物组成差异较大，刺参单养组内细菌群落组成相似度最高。这
一结果表明，刺参养殖系统沉积物中的细菌群落组成受水温、养殖生物组成等多种因素的影响。关晓燕等
（２０１０）采用ＰＣＲ－ＤＧＧＥ技术研究了不同季节、不同刺参养殖池塘水体的细菌群落组成，他们的研究结果也表
明，不同取样时间养殖水体的细菌群落组成大于不同池塘间的差异。
本研究发现，刺参单养围隔或刺参龙须菜混养围隔内沉积物的优势细菌主要归属于γ－变形菌纲、δ－变形菌
纲、α－变形菌纲和拟杆菌纲。海水养殖系统细菌群落普遍归属于这几个纲，另外比较常见的还有厚壁菌门
（Ｆｉｒｍｉｃｕｔｅ）和放线菌门等。底播刺参栖息地底泥的细菌群落主要归属于γ－变形菌纲、δ－变形菌纲、ε－变形菌
纲、α－变形菌纲、拟杆菌纲和放线菌纲（未发表）。马　英等（２００９）研究发现，对虾养殖池沉积物的优势细菌主
要归属于γ－变形菌纲细菌、δ－变形菌纲、α－变形菌纲、酸杆菌纲、放线菌门和厚壁菌门。李　可（２００７）通过１６Ｓ
ｒＤＮＡ文库技术发现对虾养殖环境表层沉积物的细菌主要有变形细菌（５２．３％），拟杆菌门（Ｂａｃｔｅｒｏｌｄｅｔｅｓ，
９．３％），浮霉状菌 （Ｐｌａｎｃｔｏｍｙｃｅｔｅ，４．７％），厚壁菌类群（Ｆｉｒｍｉｃｕｔｅ，１．９％）和放线菌门 （Ａｃｔｉｎｏｂａｃｔｅｒｉａ，
０．９％）。
刺参为沉积食性，主要靠楯状触手扒取底质表面的沉积物为食，其消化道比许多海洋生物都简单。脂肪酸
标志法分析表明，细菌是刺参重要的食物来源之一（高　菲等　２０１０），刺参超过７０％的能量需求来自于细菌
（隋锡林　１９８８）。本实验中，龙须菜初始养殖密度为３６０ｇ／ｍ２的养殖系统中刺参的特定生长率最高；而且实验
结束时，该配比的混养系统表层沉积物中的细菌含量也最高。因此作者推测Ｌ３６０组刺参的特定生长率较高
可能与沉积物中细菌含量较高有关。在实验的中后期，随季节变化，养殖环境水温逐渐升高，龙须菜的脱落碎
屑也逐渐增多，脱落的龙须菜碎屑一方面直接作为刺参的食物来源，另一方面被细菌分解，增加了沉积物中细
菌的数量，为刺参提供了更多的细菌性食物来源。本研究表明，刺参与龙须菜混养能更加有效地利用水体空间
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Ｖａｎｄｅｍｅｕｌｅｎ，Ｈ．，ａｎｄ　Ｇｏｒｄｉｎ，Ｈ．１９９０．Ａｍｍｏｎｉｕｍ　ｕｐｔａｋｅ　ｕｓｉｎｇ　Ｕｌｖａ（Ｃｈｌｏｒｏｐｈｙｔａ）ｉｎ　ｉｎｔｅｎｓｉｖｅ　ｆｉｓｈ　ｐｏｎｄ　ｓｙｓｔｅｍｓ：ｍａｓｓ　ｃｕｌｔｕｒｅ　ａｎｄ　ｔｒｅａｔｍｅｎｔ
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