全 文 ：中 国 酿 造
2011年 第 1期
总第 226期
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雪莲果（Smallantus sonchifolium）又叫地参果、亚贡
果，为菊科向日葵属多年生草本植物，原产于南美的安第
斯地区[1]。肉质雪白如玉，肉质甜脆胜过雪莲，故名雪莲
果。雪莲果营养丰富，具有降低血糖、血脂和胆固醇；帮助
消化、改善消化系统的不良状况；抗氧化、抗自由基及清肝
解毒等作用，被认为是缓解糖尿病、肠道功能紊乱等多种
慢性病的药食两用植物之一[2]。在受到机械损伤或其他极
端环境下雪莲果很容易发生褐变，严重影响其运输、储藏
加工等，从而影响其外观品质和商品价值[3]。果蔬褐变的
原因主要有酶促和非酶促2类，在酶促褐变中，多酚氧化酶
（polyphenoloxidase，PPO）和过氧化物酶（peroxidase，POD）
是引起果蔬褐变的关键酶类，可催化内源性酚类物质氧化
生成邻醌，邻醌再相互作用生成高分子聚合物或邻醌与氨
基酸、蛋白质作用生成高分子络合物，从而导致褐色素的
生成，吸附在淀粉颗粒上，使淀粉颗粒色泽变劣，品质下
降，制约其进一步深加工[4-5]。在探讨雪莲果PPO特性的基
础之上，本实验主要研究POD的特性、影响POD活性的因
素，并分析了抑制剂和激活剂对其褐变的影响，旨在为防
止雪莲果加工过程中的酶促褐变提供参考。
1 材料与设备
1.1 材料与试剂
新鲜雪莲果购于天水兰天超市。
L-半胱氨酸、乙二胺四乙酸、柠檬酸、抗坏血酸、无水硫
酸铜、三氯化铁、愈创木酚、聚乙烯吡咯烷酮等均为分析纯。
反应混合液的配制[6]：100mmol/L磷酸缓冲液（pH6.0）
50mL，加入愈创木酚28μL，于磁力搅拌器上加热搅拌至
溶解，待冷却后，加30% H2O2 19μL，混匀。
1.2 仪器与设备
高速冷冻离心机TCL-20M（长沙湘仪离心机仪器有限
公司），722可见分光光度计（上海欣茂仪器有限公司）等。
2 实验步骤
2.1 粗酶液的制备
新鲜雪莲果去皮，精确称取5g，迅速放入-20℃预冷的
研钵中按1 ∶5（w/v）依次加入预冷的30mL磷酸缓冲液
（pH6.8）、2%PVPP研磨3min成匀浆，充分混合，置4℃冰箱
中静置30min，低温搅拌透析24h。期间不断更换外液5次。
将袋内液全部转入离心管中，4℃、5000r/min条件下离心
15min，倾出上清液密封，4℃保存备用。
雪莲果过氧化物酶的特性和抑制研究
周向军，高义霞，张生财
（天水师范学院生命科学与化学学院，甘肃 天水 741001）
摘 要：以新鲜雪莲果为材料，对雪莲果过氧化物酶（POD）的特性进行了研究，并探讨了不同抑制剂及激活剂对酶活性的影响。结果
表明：雪莲果过氧化物酶最适反应pH值为6.0，最适反应温度为35℃，最佳反应底物（愈创木酚）浓度为0.008mmol/L，最大反应速度
Vmax=135U/（min·g），米氏常数Km=0.004182mol/L。在0~200mmol/L范围内，抑制剂对POD的抑制作用为NaHSO3＞L-cys＞柠檬酸＞
VC＞EDTA。在0~10mmol/L范围内，激活剂对POD激活作用为CuSO4>FeCl3。
关 键 词：雪莲果；过氧化物酶；褐变；特性
中图分类号：Q554 文献标识码：A 文章编号：0254-5071（2011）01-0109-03
Characteristic and inhibition of peroxidase from Smallantus sonchifolium
ZHOU Xiangjun, GAO Yixia, ZHANG Shengcai
(College of Life Science and Chemistry, Tianshui Normal University, Tianshui 741001, China)
Abstract: Characteristics and inhibition of peroxidase (POD) from Smallantus sonchifolium were studied. The results showed that the optimum tem-
perature and pH value were 35℃ and 6.0, respectively. The reaction kinetic of enzyme was Michaelis Equation model. Using guaiacol as substrate,
Km and Vmax were 0.004182mol/L and 135U/ (g·min), respectively. In the concentration range of 0~200mmol/L, five inhibitors had different effects
on enzymatic browning and the order of inhibition effect was as follows: NaHSO3, L-cys, citrate, VC and EDTA. In the concentration range of
0~10mmol/L, CuSO4 had better activation effect than FeCl3.
Key words: Smallantus sonchifolium; peroxidase; browning; characteristics
收稿日期：2010-08-13
作者简介：周向军（1980-），男，甘肃镇原人，讲师，主要从事生物化学与分子生物学研究与教学工作。
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Serial No．226 China Brewing
2.2 雪莲果POD反应进程曲线
参照张志良的方法[6]。反应体系为3mL pH6的磷酸缓
冲液、1mL 0.05mol/L愈创木酚、0.02mL 2% H2O2、0.5mL酶
液，波长470nm处测定，以吸光度值的变化表示酶活力。以
反应时间为横坐标，吸光度值为纵坐标制作反应进程曲线，
确定最佳反应时间。
2.3 温度对酶促反应速度的影响
取12个试管，加入缓冲液各1.95mL，保温10min，然后
分别加入0.5mL邻苯二酚溶液，加入0.5mL酶液，在15℃、
20℃、25℃、30℃、35℃、40℃、45℃、50℃、55℃、60℃、65℃、
70℃条件下测定吸光度值，制作温度和POD活性的关系曲
线，确定最佳酶促反应温度。
2.4 pH值对酶促反应速度的影响
取pH值为3.5、4.0、4.5、5.0、5.5、6.0、6.5、7.0、7.5和8.0的
磷酸缓冲液配制的反应混合液3.0mL，加入粗酶液0.5mL，
摇匀，20℃条件下于波长470nm处测定OD值，制作pH值和
POD活性的关系曲线，确定最佳酶促反应pH值。
2.5 底物浓度对酶促反应速度的影响
在35℃、pH6.0时测定底物浓度为0.0001mol/L、0.0002mol/L、
0.0004mol/L、0.0006mol/L、0.0008mol/L、0.001mol/L时的吸光
度值，制作不同底物浓度随时间的变化曲线，并拟合各直
线斜率，即为反应初速度，计算Vmax和Km。
2.6 不同抑制剂和激活剂对酶促反应速度的影响
各反应体系中分别加入不同浓度的半胱氨酸、抗坏
血酸、亚硫酸氢钠、EDTA及柠檬酸5种抑制剂和硫酸铜、
氯化铁2种激活剂，同时以相同体积的蒸馏水为对照，测定
POD活性，以对照POD活性为100%相对活力，计算各抑制
剂和激活剂对POD活性影响。
3 结果及分析
3.1 酶反应进程的确定
曲线的斜率表示单位时间内产物生成量的变化，曲
线上任一点的斜率表示该时刻的反应速度。从图1可知，
雪莲果POD酶促反应速度在3min内几乎维持恒定，产物的
生成量几乎与反应时间成正比，随着时间的延长，因底物
减少和产物增加使逆反应加速，产物的抑制作用和会影响
酶自身活性，故产物生成量与时间不再成正比例关系，反应
速度逐渐变慢。为了正确测定酶促反应速度并避免各种
因素的干扰，必须测定酶促反应初速度[7]。实验确定所测
时间为3min。
3.2 最适pH值的确定
由图2可知，随着pH值的升高，POD活性开始增加，当
pH值为6.0时活性最高，为雪莲果POD最适pH值，而后随
着pH值不断升高，POD酶活发生小范围下降。推测其原因
是在酸性条件下，由于POD的血红素和蛋白质部分分离，导
致酶蛋白从天然状态转变成可逆变性状态，因而酶的活
力下降。在中性和碱性条件下，酶逐步恢复天然状态[8]。酶
的最适pH值受多种因素影响，如酶的来源、同工酶的组
成、底物和缓冲液的种类和浓度、温度、反应时间长短等，
最适pH值不是酶的特征常数，只在一定条件下才有意义。
故在雪莲果的加工和贮运保鲜中，适当降低pH值应作为抑
制褐变发生的必要措施。
3.3 最适温度的确定
由图3可知，在20℃~35℃时随着温度的升高，POD活性
急剧上升，35℃达到最高，为雪莲果POD最适温度；随后
POD活性持续下降，70℃时酶相对活力仅为14.3%。温度升
高，酶促反应速度加快，温度过高酶蛋白变性，酶失活，反
应速度下降。最适温度同样不是酶的特征常数，不同来源
的POD最适温度存在很大差别，酶在短时间内能耐受较高
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温度，当反应时间延长时，最适温度向温度降低方向移动，所
以只有在规定了反应时间的情况下，才有最适温度[9]。
3.4 最适底物浓度的确定
由图4可知，雪莲果POD催化的酶促褐变反应描述的反
应初速度随底物浓度的变化曲线类似于米氏方程所描述
的反应初速度随底物浓度的变化规律[10-11]。将米氏方程V=
Vmax[S]/（Km+[S]）转化为V-1=（Km/Vmax）/（[S]-1+Vmax）形式，
对实验结果进行处理并制作V-1-S-1[12]，见图4B。根据直线斜
率和截矩可求得该反应的米氏常数Km=0.004182mol/L，
最大反应速度Vmax=135U（min·g），相应雪莲果POD酶促褐
变反应动力学方程为V=135[S]/（0.004182+[S]）。
3.5 抑制剂对POD活性的影响
由图6A可知，抑制剂浓度为0mmol/L~10mmol/L时，
L-cys、VC、EDTA抑制作用由强到弱依次为：VC＞L-cys＞
EDTA。由图6B可知，抑制剂浓度为0mmol/L~200mmol/L
时，柠檬酸和NaHSO3抑制作用由强到弱依次为柠檬酸＞
NaHSO3，综合以上可知，柠檬酸、L-cys、VC、NaHSO3、EDTA
五种抑制剂对雪莲果POD均有一定的抑制作用，其强到
弱依次为VC＞L-cys＞EDTA＞柠檬酸＞NaHSO3。抗坏血
酸是一种良好的还原剂，本身并不能抑制POD活性，而是使
POD氧化生成的有色物质醌类立即还原成酚类，降低了初
产物的量，从而阻止了黑色素的生成，又可以作为酶分子中
Cu2+的螯合剂，降低酶的活力，而不呈色泽[13]；NaHSO3在食
品的添加中有严格的限量，其抑制褐变主要是通过不可
逆地与醌类生成无色的加成产物，与此同时，降低了POD
作用于一元酚和二元酚的活力[5]。较低的pH值能显著的提
高其作用效果，同时与柠檬酸或苹果酸联用效果更佳；醌
类物质能与半胱氨酸形成无色的复合物，中断其聚合形成
色素；并且半胱氨酸可通过与POD活性中心的Cu2+不可逆
结合而抑制酶的活性；另外半胱氨酸并非阻止了POD氧化
酚类，而是阻止酚类聚合[14]。EDTA主要作为金属离子螯合
剂使POD被抑制[15]；柠檬酸是依赖于降低反应体系的pH，
并螯合酶活性中心的Cu2+而使酶失活[16]。
3.6 激活剂对POD活性的影响
由图7可知，在FeCl3或CuSO4存在的条件下，随着浓度的
逐渐升高，POD活性显著上升。在相同浓度条件下，FeCl3
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的激活效果明显的强于激活剂CuSO4。所以在雪莲果加工
过程中要避免该类物质的存在。
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虫草是名贵中药材，为传统的滋补强壮药[1-2]。虫草菌 经过液体培养后得到大量的菌丝生物体，可添加到蔬菜
响应面法优化虫草培养的研究
周广麒，戴 娜
（大连工业大学生物工程学院，辽宁 大连 116034）
摘 要：利用响应面分析法，研究蔗糖、牛肉膏和pH值对虫草菌生长生物量的影响。结果表明：营养源的种类和浓度对虫草菌生物量
有很大的影响，在所选用的蔗糖、葡萄糖、柠檬酸铵、淀粉和牛肉膏、蛋白胨、硫酸铵七种营养源中，蔗糖和牛肉膏最利于虫草菌的生
长，浓度以2%左右为宜；当蔗糖的浓度为2.74%、牛肉膏浓度为1.86%、pH值为7.37时，虫草菌C. FFCC5124的生物量为10.2g/L。响应面
试验的方差分析表明：一次项对响应值的影响很显著，其次为平方项，而交互项影响较为微弱。
关 键 词：虫草菌；液体培养；响应面；碳源；氮源
中图分类号：Q935 文献标识码： 文章编号：0254-5071（2011）01-0112-04
Optimization of cultivation conditions for Cordyceps by response surface methodology
ZHOU Guangqi, DAI Na
(School of Biological Engineering, Dalian Polytechnic University, Dalian 116034, China)
Abstract: Effect of sucrose, beef extract and pH value on biomass of Cordyceps was studied with response surface methodology. The results showed
that varieties and concentration of nutrient had significant effects on biomass of Cordyceps. Among seven ingredients selected, which were i sucrose,
glucose, citric acid, ammonium, starch and beef extract, peptone, ammonium sulfate seven nutrition source, sugar and beef extract were the most
conducive to the growth of bacteria, and the optimum concentration was 2%. Production of biomass of Cordyceps fungus C. FFCC 5124 reached
10.2g/L under the conditions of sucrose 2.74%, beef extract 1.86% and pH value 7.37. Variance analysis of response surface test showed that the first
degree terms significantly affected the response values, followed by the square terms, and the interaction of factors was weak.
Key words: Cordyceps fungus; liquid cultivation; response surface; carbon source; nitrogen source
收稿日期：2010-09-16
基金项目：辽宁省教育厅科学技术研究项目资助（20061194）
作者简介：周广麒（1957-），辽宁大连人，副教授，研究方向为微生物技术与产业化研究。
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