全 文 ：微甘菊愈伤组织的诱导及培养研究
廖劲松 ,郭　勇
(华南理工大学食品与生物 工程学院 ,广州　510640)
摘要:本文试验了微甘菊愈伤组织诱导的影响因素 , 结果表明:芽尖和嫩茎作为外植体时诱导率较高;最适诱导培
养基是MS 培养基附加激素 2 , 4-D2.0mg/L+KTl.0mg/ L , pH 值 5.7;于 25±1℃条件下黑暗诱导。另外优化了微甘
菊愈伤组织继代培养条件:浓度为 5.0mg·L-1的抗坏血酸(Vc)对于微甘菊愈伤组织褐变情况有良好的抑制作用;继
代培养基中较好的激素组合为(2 , 4-D1.0mg·L-1+NAA2.0mg.·L-1+KT0.5mg.·L-1+BA0.5mg.L-1;添加 15%新
鲜椰子汁能够明显促进愈伤组织生长 ,而且对褐变有一定的抑制效果。依此反复继代的微甘菊愈伤组织有良好的
增殖效果。
关键词:微甘菊;愈伤组织;诱导;继代培养
中图分类号:Q813　　　文献标识码:A　　　文章编号:1000-2324(2004)04-0521-05
收稿日期:2003-10-29
作者简介:廖劲松(1976-),男 ,博士 ,讲师 , 主要研究方向:酶工程与生物制药。
INDUCTION AND CULTURE OF CALLI FROM MIKANIA MICRANTHA KUNTH
LIAO Jin-song ,GUO Yong
(Food and biological engineering college , SouthChinaUniversity of Technology , Guangzhou 510640 ,China)
Abstract:Factors affecting induction of callus in Mikania micrantha Kunth was studied in the paper.The result
showed that auxiliary shoot and bud tip has a higher level of callus induction ratio:the best callus induction medium
was MS wi th the addition of 2 ,4-D2.0mg/L+KT1.0mg/L , pH 5.7;culture in dark under 25±1℃。While callus
subculture conditions has been optimized , that is cultured with the addition of coconut juice 15%, Vc 5.0mg·L-1 ,
2 , 4-D0.5mg/L+NAA2.0mg/ l+KT0.5mg/L+BA0.5mg/L , and the callus of Mikania micranthaKunth could in-
hibit browning effectively and good growth effect after continuous subculture.
Key Words:Mikania micranthaKunth , callus , induction , subculture
前言
微甘菊(MikaaniamicranthaKunth .)属菊科 ,假泽兰属 ,多年生 ,草质藤本植物 ,善于缠绕和攀附 ,原产热
带中南美洲国家 ,后传入澳大利亚的北部和非洲西南部国家[ 1] 。1997 ～ 1998年在深圳内伶仃岛上的生态
环境考察中发现 ,海拔150m以下 ,有 50%的地区被微甘菊所侵染 ,它对南方经济树林有极大的威胁 ,故称
为植物杀手。目前已从各种途径入手开展微甘菊防治方面的研究[ 2-7] 。微甘菊强大的生长能力引起了研
究者们的关注 ,本研究就是希望通过对微甘菊愈伤组织和悬浮细胞培养体系的研究 ,从细胞学角度了解微
甘菊生长特性 ,研究与微甘菊生长因子有关的生理因素 。
1　材料与方法
1.1　愈伤组织诱导
微甘菊标本采自广东省广州市华南植物园内
消毒:取微甘菊的嫩枝条 ,流水冲洗 1h ,用2%漂白粉水溶液浸泡 2min ,蒸馏水洗净后用 0.1%的升汞
消毒 5min ,再用无菌水冲洗 5次以上备用 。
山东农业大学学报 (自然科学版), 2004 , 35 (4):521～ 525
Journal of Shandong Agricultural University (Natural Science)　 　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　
接种:将已消毒的嫩枝茎段和芽尖剪成长约 0.5cm的切段 ,叶片剪成 1cm2 左右的方块 ,分别接种。
培养基:诱导培养基为附加不同植物激素的MS 、B5 、White三种培养基 。
诱导:置培养箱中在(25±1)℃温度下 ,一部分黑暗培养 ,另一部分在光照条件下培养 。
1.2　微甘菊愈伤组织的继代培养以及培养基优化
诱导出的愈伤组织每 2周转接1次继续培养。含有不同种类和浓度外源激素 、天然添加物以及 30g/L
蔗糖的 MS培养基经 121℃、0.1MPa 消毒 20min ,将愈伤组织接种于含 30ml固体培养基的 50ml三角瓶中 ,
置培养箱中(25±1)℃暗培养或 24h光照培养 ,二者均为两周继代一次 。
2　结果与讨论
2.1　微甘菊愈伤组织诱导的研究
2.1.1　环境因素对愈伤组织诱导的影响　①光照对愈伤组织诱导的影响　黑暗条件下诱导 ,诱导率明显
较高 ,愈伤组织色泽较浅;光照下培养 ,部分愈伤组织为浅绿色 ,而叶柄 、茎段的愈伤组织为很淡的绿色或
无色 ,但是在光照下微甘菊愈伤组织培养 8天后开始褐变死亡 。这说明 ,黑暗培养有利于愈伤组织的诱
导;光照能够诱导微甘菊愈伤组织产生叶绿体 ,但在光照下培养会促进微甘菊材料褐变。 ②温度对愈伤组
织诱导的影响　培养物生长通常在 20℃～ 25℃。但次生物质生产的最适温度与生长温度不同。改变温
度 ,可能引起次生物质生产数量上或质量上的变化 。不同培养基温度对微甘菊诱导的影响见表 1。由表 1
可知 ,微甘菊愈伤组织诱导温度以 24℃～ 26℃为宜 ,以后培养均采用 25℃。③pH 值的影响　培养基的 pH
值影响细胞膜的通透性 ,进一步影响到营养物质的运输及细胞对内源代谢物流失的控制从而影响到细胞
的生长与代谢产物的合成 。我们试验了不同的初始 pH值对微甘菊愈伤组织的影响 ,结果发现 ,适宜于微
甘菊愈伤组织生长的 pH值为 5.7。
表1　温度对微甘菊愈伤组织诱导的影响
Table 1　Effects of temperature on Calli Induction for Mikania micrantha Kunth.
温度(℃) 15℃ 20℃～ 22℃ 24℃～ 26℃ 28℃～ 30℃
愈伤组织生长情况 几乎无法诱导出愈伤组织 部分外植体能够诱导出愈伤组织 诱导效果较好 ,愈伤组织生长非常明显 诱导时外植体褐变严重 ,72h后多数变黑
　　注:诱导培养基为MS+2 , 4-D2.0mg/ L+KT1.0mg/ L
表 2　pH 值对微甘菊愈伤组织生长的影响
Table 2　Effects of pH on Calli Induction for Mikania micrantha Kunth.
pH值 5.3 5.5 5.7 5.9
愈伤组织生长情况 愈伤组织表面湿润 ,细胞生长较弱 愈伤组织表面湿润 ,细胞生长较弱 愈伤组织表面较干 ,细胞松散 ,生长良好 愈伤组织表面干松 ,细胞生长较弱
　　注:诱导培养基为MS+2 , 4-D 2.0mg/ L+KT1.0mg/ L
2.1.2　不同部位外植体诱导效果比较　由表 3可看出 ,叶柄和茎段诱导率最低 ,只有 40%左右;叶片诱导
率稍高一些 ,在 50%～ 70%之间 ,但由于消毒程度难以控制 ,加上愈伤组织出现 2 ～ 3d后开始容易转向褐
变死亡 ,因此也不能作为首选的外植体;茎尖和嫩茎诱导率最高 。微甘菊外植体脱分化难易程度与其生理
状况有关 ,虽然因培养基(MS 、B5 、White)成份不同诱导率会有些不同 ,但总的趋势基本一致 ,诱导率按大小
顺序排列为:芽尖和嫩茎≥叶片≥茎段≥叶柄 。在试验过程中 ,芽尖外植体诱导速度最快 48h便可产生愈
伤组织 ,嫩茎单独诱导需要 72h才会出现愈伤组织 ,部分叶片培养 5d左右表面才有愈伤组织开始出现 ,茎
段相同条件下则需要 10d左右 。
表 3　不同部位外植体愈伤组织诱导率
Table 3　Effects of different explant on Calli lnducing rate
部位与器官 接种数 出愈数 诱导率/ %
芽尖和嫩茎 240 214 89.25
叶柄 225 93 41.28
叶片 213 122 56.88
茎段 206 83 38.96
　　注:所有的外植体统一在相同条件下(25±1℃;黑暗培养;添加激素)诱导。
·522· 山东农业大学学报(自然科学版)　　　　　　　　　　　　　　第 35卷
2.1.3　不同培养基和外源激素对微甘菊愈伤组织诱导的影响　从表 4试验结果中可以看出 ,不同培养基
配合不同的激素种类和浓度对愈伤组织的诱导有较大差别 。
在以上三种基本培养基中以MS培养基为最好 ,因此可知高浓度无机盐含量 ,特别是铵态氮及充足的
铁离子供给对微甘菊愈伤组织诱导有利 。同时 ,所附加的激素组合较好的为 2 , 4-D 2.0mg/L +KT
1.0mg/L。但是在后续的培养中发现最佳诱导培养基不适合继代保存 ,褐变较严重;在培养基中附加抗氧
化剂并调整激素种类 ,可以消除褐变现象 ,使细胞保持旺盛生长 。
表 4　不同培养基和外源激素对微甘菊芽尖和嫩茎愈伤组织诱导的影响
Table 4　Effects of Various Hormones and Nature on Calli Induction for Mikania micrantha Kunth
基本培养基种类
附加激素种类及含量
/(mg·L -1) a.诱导率/ % b生长情况 c.质地与色泽 d.褐变情况
MS(1) 2 , 4-D0.5+KT1.0 80 + + 0
Ms(2) 2 , 4-D2.0+KTl.0 95 +++ + 0
MS(3) NAA0.5+KT1.0 40 0 + +
MS(4) NAA2.0+KT1.0 50 + + +
Ms(5) 2 , 4-D0.5+6-BA1.0 55 0 0 +
MS(6) 2 , 4-D2.0+6-BA1.0 80 + + 0
MS(7) NAA0.5+6-BA1.0 40 - 0 -
MS(8) NAA2, 0+6-BA1.0 60 + + 0
B5(1) 2 , 4-D0.5+KT1.0 70 - - 0
B5(2) 2 , 4-D2.0+KT1.0 85 0 0 0
B5(3) NAA0.5+KT1.0 40 - - +
B5(4) NAA2.0+KT1.0 50 - 0 +
B5(5) 2 , 4-D0.5+6-BA1.0 70 0 0 0
B5(6) 2 , 4-D2.0+6-BA1.0 80 + 0 0
B5(7) NAA0.5+6-BA1.0 50 - - +
B5(8) NAA2.0+6-BA1.0 60 0 - 0
White(1) 2 , 4-D0.5+KT1.0 40 - - 0
White(2) 2 , 4-D2.0+KT1.0 60 - - 0
White(3) NAA0.5+KT1.0 30 - - 0
White(4) NAA2.0+KT1.0 35 - - 0
White(5) 2 , 4-D0 , 5+6-BA1.0 40 - - 0
White(6) 2 , 4-D2.0-6-BA1.0 55 - - 0
White(7) NAA0.5+6-BA1.0 20 - - 0
White(8) NAA2.0+6-BA1.0 40 - - 0
　　附注:a ,诱导频率:每种组合接种 40个外植体 ,剔除个别染菌瓶数据 , 统计愈伤组织发生数 ,取平均值。 b生长情况:“ +”细胞生长良
好;“ 0”可以诱导出愈伤组织 ,但生长较慢;“ -”生长迟缓 ,细胞生长不明显。 c.质地与色泽:“ +”表面湿润且结构松散;“ 0”一般;“ -”表面
较干燥 ,愈伤组织较难诱导出来 ,大多数外植体多数只能感觉到变得僵硬一些而已。 d褐变情况:“ +”浅白色或浅绿色或无色水泡状发亮 ,
褐变程度低;“ 0”浅黄色 ,有些干燥;“-”深黄色 ,干燥 ,几天后马上褐变衰亡。
2.2　微甘菊愈伤组织继代培养的研究
微甘菊在适宜的培养基上能诱导出愈伤组织 ,但在随后的继代培养过程中褐变现象极为严重 ,继代培
养相当困难。有人认为 ,继代培养褐变是由于培养基选择不当 ,尤其是激素不合理 ,细胞分裂素 BA 或 KT
有刺激多酚氧化酶活性提高的作用 。因此 ,褐变控制是微甘菊愈伤组织继代培养中要解决的首要问题。
2.2.1　添加抗氧化剂对愈伤组织继代培养的影响　微甘菊愈伤组织的增殖和驯化过程中 ,不同激素组合
均有不同程度的褐化现象 ,即使频繁继代 ,效果也不理想。外植体和愈伤组织褐变是由于其丰富的多酚化
合物在多酚氧化酶的作用下氧化的结果 ,在培养基中加入抗氧化剂 ,对防止某些外植体发生褐变具有一定
的效果。为此 ,将材料转接在附加不同种类与体积质量的抗氧化剂或吸附剂的 MS+2 , 4-D2.0mg/L +
KT1.0mg/L继代培养基上 ,结果(见表 5)表明 ,抗坏血酸(Vc)有良好的抑制微甘菊愈伤组织褐变的作用;
活性炭也有效 ,但不明显;添加 PVP对褐变抑制无作用。试验还设计了不同的水平处理 ,进一步探讨抗坏
血酸控制微甘菊愈伤组织褐变的最佳体积质量的范围 。结果表明 ,Vc最适为 5.0mg·L-1 。
·523·第 4 期　　　　　　　　　　廖劲松等:微甘菊愈伤组织的诱导及培养研究
表 5　添加抗氧化剂对愈伤组织继代培养的影响
Table 5　Comparisons of the Effects of Oxidation-resistant Active Compounds on Callus Subculture
添加三种不同抗氧化剂 愈伤组织生长情况(培养 21d收获)
种类 浓度(mg/ L) 干重增长率 褐变情况
抗坏血酸(Vc) 1 4.24 略浅
5 8.08 浅
10 7.67 浅
聚乙烯吡咯烷酮(PVP) 1000 2.24 深
2000 2.64 深
4000 2.15 深
活性炭 1000 4.48 深
2000 5.91 略浅
4000 6.55 浅
空白对照 2.62 深
2.2.2　继代培养基中激素组合的优化 　将微甘菊愈伤组织从附加激素(MS +2 , 4-D3.0mg·L-1 +
KT1.0mg·L-1)的诱导培养基转接入到附加了其他不同激素组合的 MS培养基进行继代培养 ,培养 2 ～ 5d
左右 ,发现所有材料都产生不同程度的褐变;愈伤组织质地差异也较大 ,有的质地艰硬 ,继续培养困难 ,有
的细胞分散 ,愈伤组织生长良好;而且 21d后收获时愈伤组织的生长量差别较大(见表 6)。总的来看 MS
(15)较好 ,在此培养基上多次继代后 ,形成较为均一稳定的无性系。
表 6　不同激素组合对愈伤组织继代培养的影响
Table 6　Effects of Various Hormones Concentration on Calli Subculture
愈伤组织继代所用的激素组合 干重增长倍数 褐变 质地
MS(9) 2 , 4-D3.0mg·L-1+KT1.0mg·L-1 8.05 ++ 差
MS(10) 2 , 4-D1.0mg·L-1+KT1.0mg·L-1 7.79 + 差
MS(11) NAA2.0mg·L -1+KT1.0mg·L-1 4.22 0 差
MS(12) 2 , 4-D1.0mg·L-1+NAA2.0mg·L -1+KT1.0mg·L-1 8.10 + 差
MS(13) 2 , 4-D1.0mg·L-1+NAA2.0mg·L-1 6.53 + 一般
MS(14) 2 , 4-D1.0mg·L-1+NAA2.0mg·L -1+KT1.0mg·L-1 7.91 + 一般
MS(15) 2 , 4-D1.0mg·L -1+NAA2.0mg·L-1+KT0.5mg·L -1+BA0.5mg·L-1 8.34 - 好
MS(16) 2, 4-D1.0mg·L-1+NAA2.0mg·L-1+BA1.0mg·L-1 7.38 0 好
　　附注:“ +”表示褐变程度深;“ 0”表示一般;“ -”表示褐变程度浅。
根据表中数据分析 ,生长素是微甘菊愈伤组织生长的重要激素 ,不同种类生长素对愈伤组织诱导及生
长有差异 ,2 ,4-D生理活性强 ,诱导快 ,但也易使细胞老化;NAA 生理活性弱;分裂素中 KT 效果明显 ,但
长期单独使用易导致细胞结团性严重 ,质地不够松散 ,不利于增殖。所以 ,各种激素配合使用 ,能调节生理
平衡 ,有利于愈伤组织保持良好生长。
2.2.3　添加天然物质对愈伤组织生长的影响　试验了添加酵母抽提物和椰汁对愈伤组织生长的影响 ,结
果见表 7。适量添加新鲜椰子汁(培养基重量的 15%)能够明显促进愈伤组织生长 ,而且对褐变有一定的
抑制效果;酵母抽提物作用则不明显。
3　结论与展望
(1)微甘菊愈伤组织的诱导的较佳方法为:采用微甘菊芽尖或嫩茎作为外植体;接种于附加激素(2 ,4
-D2.0mg/L+KT1.0mg/L)的MS培养基;pH5.8;25±1℃;黑暗诱导。
表 7　添加各种天然物质对愈伤组织生长的影响
Table 7　Effects of Various nature substance on Calli lnduction
继代培养基(2 , 4-D0.5mg/ L+NAA0.5mg/ l+KT0.5mg/ L) 干重增长倍数 褐变情况
未添加 8.03 灰褐色
添加酵母抽提物 7.96 灰褐色
添加 15%新鲜椰汁 11.73 浅灰色
(2)通过对微甘菊愈伤组织继代培养条件的优化试验发现 ,抗坏血酸(Vc)对于微甘菊愈伤组织褐变情
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况有良好的抑制作用;Vc最适浓度为 5.0mg·L-1;各种激素配合使用 ,能调节生理平衡 ,有利于愈伤组织
保持良好生长;试验结果表明继代培养中较好的激素组合为:(2 ,4-D 1.0mg·L-1+NAA 2.0mg.·L-1+KT
0.5mg·L-1+BA 0.5mg·L-1);继代培养基中添加 15%新鲜椰子汁能够明显促进愈伤组织生长 ,而且对褐
变有一定的抑制效果 。
通过对微甘菊愈伤组织的诱导和继代培养试验 ,已经获得初步的培养条件;而且在和实验室现有的玫
瑰茄愈伤组织生长对照观察中 ,发现微甘菊愈伤组织生长明显快过玫瑰茄 。下一步将进行微甘菊细胞悬
浮培养试验 ,分析液体条件下不同营养因子对微甘菊细胞生长速率的影响 ,摸索微甘菊细胞悬浮培养的生
长特性。
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嗜热乳酸链球菌有明显杀菌或抑菌作用。当蒜中硫化二丙烯在 pH 值为 7以上经 60℃以上高温处理 1h
以上时 ,蒜辣素会大量损失 ,随着温度和 pH值的升高以及时间的延长 ,蒜中硫化二丙烯会全部损失 ,从而
失去杀菌或抑菌作用 ,这时菌数大量增加 。反之 ,在 pH7以下 ,温度 50℃以下 ,蒜辣素损失较小 ,杀菌或抑
菌明显 ,其菌数明显减少 。因此 ,在服用微生态制剂时 ,尽量不要与大蒜同时使用 。但在大蒜经碱和高温
处理后 ,可使蒜中硫化二丙烯杀菌或抑菌作用大大减弱甚至完全丧失 ,这种情况下 ,微生态制剂不受影响 。
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