全 文 ：山西省自然科学基金资助项目。
收稿日期:1996-10-07 ,修回日期:1997-07-07。
裸燕麦胚性愈伤组织培养及悬浮系的建立
崔　林　范银燕
(山西省农科院高寒作物研究所　大同　037004)
摘　要　裸燕麦成熟胚在 IN 6 培养基上诱导培养 , 初始愈伤组织为白色 、瘤状 、外软内硬 、易
分化植株的非松脆类型。当在 IM 1 ～ IM 4 培养基上进行循环式调控培养 , 经 7 ～ 8 个月 , 初始
愈伤组织转变为浅黄色 、小颗粒状 、生活力强的松脆型胚性愈伤组织。将胚性愈伤组织置于
液体培养基中悬浮培养 ,得到分散性好 、生长快的悬浮细胞系。悬浮系经分化培养获得了再
生植株 ,移栽成活率达 95%以上。
关键词　裸燕麦 ,成熟胚 , 胚性愈伤组织 ,悬浮培养 , 再生植株
学科分类号　Q78
在组织和细胞培养过程中会出现多种愈伤组织类型。由于不同类型愈伤组织的活力
差异较大 ,直接影响着细胞悬浮培养的效果 ,也影响着植株再生能力的强弱 。王海波曾提
出关于组织培养中细胞状态值的调控方程[ 1] ,随后在小麦上形成了愈伤组织状态调控的
技术体系[ 2] 。本文就裸燕麦近年来在愈伤组织状态调控以及悬浮细胞系培养的研究结
果报道如下。
1　材料与方法
1.1　培养材料的处理
用裸燕麦(Auena nuda L.):晋燕 8号 、8343 、8330 、品 6号 、品 16 号 、20-1 的饱满 、
具有发芽能力的成熟种子 ,采取两步消毒法 ,即取胚前消毒;70%乙醇浸泡 2min后无菌水
冲洗 1次 ,安替福民原液浸泡 2h ,无菌水冲洗 3次 ,无菌水浸泡 14 ～ 16h 。剥取种胚后第
2次消毒:安替福民原液浸泡 30min ,无菌水冲洗 5 次。接种在 IN6 培养基上(N6 附加
3mg/L 2 ,4-D ,1mg/L NAA , 0.5mg/L KT),在人工气候箱中暗培养 ,温度 26 ～ 28℃。
1.2　愈伤组织培养
成熟胚诱导的初始愈伤组织在改进的 IM1 ～ IM 4 4种配方的培养基上继代培养 ,每隔
25 ～ 30d继代一次 。按照 IM2 、IM3 、IM 4 、IM 1 的顺序 ,每种培养基继代 4次后 ,转移到下
一种培养基上培养。根据松脆性和形态愈伤组织分为:松脆型(浅黄色 、颗粒<2mm 、结
构松散 、生长快 ,易产生胚状体)、非松脆型(白色 、瘤状 、外软内硬或致密 ,不易分散 、生长
较快 ,易分化幼芽)、中间型(其它各类愈伤组织)。每次继代前统计 3种类型的愈伤组织
百分率 ,然后挑选松脆型愈伤组织 , 2/4 继续培养 、1/4转移到分化培养基上诱导再生植
14 卷 1 期
1998 年 1 月
生　物　工　程　学　报
ChineseJournal of Biotechnology
Vol.14 No.1
January 1998
DOI :10.13345/j.c jb.1998.01.008
株 ,1/4进行悬浮细胞培养。
1.3　悬浮培养
选择松脆型胚性愈伤组织 1 ～ 2g ,置于 250ml三角瓶中 ,加 50ml的液体培养基(每升
培养基 MS 附加 150mg 谷氨酰胺 、150mg 天冬氨酸 、100mg 酵母提取物 、5g 甘露醇 、3mg
2 ,4 ,-D ,0.5mg KT),于 120r/min的恒温旋转摇床上培养 ,温度为 27 ～ 28℃。1周后用新
鲜的液体培养基更换瓶中 1/3体积的培养液。以后每周一次 ,用新鲜液体培养基更换培
养瓶中 2/3体积的培养液 。
1.4　悬浮细胞的分化和植株再生
悬浮液中形成的细胞团 ,转移到 IM2 、IM 3固体培养基上继代增殖 2次 。然后选择结
构致密的小颗粒状愈伤组织 ,接种到 IM1 培养基上待分化出明显的胚状结构后 ,转入无
激素的 N6 培养基上获得完整的再生小植株 。
2　结果与讨论
2.1　初始愈伤组织状态和调控培养基
裸燕麦成熟胚出愈率各品种差异较大 ,晋燕 8号最高 ,为 95.4%(数据未列)。初始
愈伤组织呈白色 、外部质地较软 ,内部有一些较小的愈伤组织硬核 ,表面为瘤状结构 ,生长
旺盛 ,易分化出芽(图版Ⅰ-1)。此类愈伤组织难以进行细胞悬浮培养 。为使初始愈伤组
织状态转变为颗粒状 、松脆型的胚性愈伤组织 ,我们以 MS 为基本培养基 ,通过改进 、设计
出 IM1 ～ IM 4 培养基(表 1)。其特点为从 IM1 到 IM4 中生长激素含量呈逐渐上升趋势 ,
分裂激素含量呈逐渐下降的趋势。
表 1　愈伤组织继代培养基配方
Table 1　Compositions of media for callus subculture
Combinat ion of hormones IM 1 IM 2 IM 3 IM 4
2 , 4-D 0 3 6 8
NAA 0.5 1 0 0
KT 0 0 0.5 0.5
6-BA 2 1 0 0
KC l 0 0 1000 1000
Note:Major elements w ere 2/ 3 of MS;Trace elements and organic compounds w ere double of MS;Contained 150mg/ L glu-
t amine , 150mg/ L aspartic acid , 50mg/ L yeast ext ract , 8% agar;other composi tions w ere as much as MS in four media(mg·
L-1)
2.2　愈伤组织状态调控
从表 2看出 ,初始愈伤组织转移到 IM2 培养基 ,其表面长出少量浅黄色 、分散性好 、
颗粒状态的松脆型愈伤组织。继代 4次后 ,松脆型愈伤组织比最初增加了 54.4%。挑选
松脆型愈伤组织转移到 IM3 培养基上 ,颗粒状愈伤组织比例大幅度提高 ,但仍有非松脆
型愈伤组织出现 。继续选择颗粒状愈伤组织转移到 IM4 培养基上 ,在前 2次继代中松脆
型愈伤组织仍能很好地维持生长 ,当继代 3 ～ 4次后 ,愈伤组织生活能力开始衰退 ,逐渐长
471 期 崔　林等:裸燕麦胚性愈伤组织培养及悬浮系的建立
出质地软而韧性大的白絮状愈伤组织 ,并有部分愈伤组织变褐死亡。经严格挑选生长好
的颗粒状愈伤组织转移到 IM1 培养基上 ,发现松脆型愈伤组织具有明显的恢复趋势 ,但
在第 3 ～ 4次继代时 ,松脆型愈伤组织的比例再次下降 ,一部分愈伤组织转变为非松脆型 ,
随后分化出植株 。一般由初始愈伤组织过渡到松脆型愈伤组织达 50%以上约需 5 ～ 6个
月时间 ,稳定在 95%以上约需 7 ～ 8个月时间。
表 2　继代过程中愈伤组织状态的变化
Table 2　Variations of callus state during subcultures
M edia No.of subculture Number of
alli
Callus types/ %
a b c
IM 2
1 763 　　　75.3 　　　15.4 　　　 9.3
2 228 36.5 37.4 26.1
3 253 10.1 23.1 66.8
4 271 7.2 30.4 62.4
IM 3
1 392 　　　 3.8 　　　13.3 　　　82.9
2 436 3.2 2.1 94.7
3 474 1.9 2.5 95.6
4 439 1.6 3.2 95.2
IM 4
1 455 　　　 0.0 　　　 2.9 　　　97.5
2 463 0.0 4.7 95.3
3 418 0.0 13.1 86.9
4 462 0.0 21.5 78.5
IM 1
1 365 　　　 0.0 　　　 4.6 　　　95.4
2 427 0.0 3.8 96.2
3 351 4.3 12.2 83.5
4 338 13.4 13.8 72.8
Note:a.Nonf riable state;b.In termediate state;c.Friable state.
Data were averaged over the three variet ies(GY-8 ,8343 and 8330)
　　表 2结果表明 ,颗粒状愈伤组织的发生和维持与外源激素含量关系极大。从 IM2 到
IM4培养基中生长激素逐渐增加 ,分裂激素逐渐减少 ,当愈伤组织在 IM4 上继代 4次后 ,
外源生长激素含量达到高峰 ,这时愈伤组织内部生长激素由于积累也达到高峰 ,如果再继
续在此培养基上培养 ,外源激素(主要是 2 ,4-D)将起到抑制作用 ,因而愈伤组织生活力开
始衰退 。当转入 IM 1培养基上后(继代不超过 2次),外源生长激素骤减 ,分裂激素增加 ,
调整了愈伤组织内源生长激素与分裂激素的比例 ,因而激活了颗粒状愈伤组织的生长 。
如此循环式调控培养 ,使松脆型愈伤组织能稳定地维持在 95%以上(图版 Ⅱ-2),有效地
缓减了愈伤组织生活力衰退的速度 。
2.3　体细胞胚胎发生
3种类型愈伤组织在附加 2mg/L 2 ,4-D的 MS培养基上培养 8 ～ 9周后 ,多数松脆型
愈伤组织在其表面形成体细胞胚(图版 Ⅰ-3)。由表 3可知 ,不同品种松脆型愈伤组织产
生体细胞胚的频率差异较大 ,晋燕 8 号为 78.3%,品 16号最低 ,为 52.9%。将带有体细
胞胚的愈伤组织转移到无激素的 N6培养基上培养 8 ～ 10周后 ,获得再生小植株 。6个品
种的体细胞胚再生植株频率为 38.9%～ 43.1%。结果表明 ,松脆型愈伤组织是具有体细
胞胚胎发生能力的胚性愈伤组织 ,邢登辉等也曾有此论述[ 3] 。表 3中非松脆型和中间型
48 生　　物　　工　　程　　学　　报 14 卷
愈伤组织虽然也产生个别体细胞胚 ,可能是由于这些愈伤组织仍带有胚性细胞所致 。
6个品种经循环培养后 ,晋燕 8号 、8343 、8330的松脆型愈伤组织稳定地维持在 95%
左右 ,而 20-1 、品 6号 、品 16号的胚性愈伤组织在 47.9%～ 71.5%之间 ,说明不同基因
型具有不同的胚性愈伤组织发生能力。
表 3　不同品种 3 种愈伤组织形成的体细胞胚和再生植株
Table 3　Somatic embryos and plantlets formed from three types of callus in different varieties
Genotype
No.of
calli
a
1 2 3
b
1 2 3
c
1 2 3
GY-8 85 0 0 0 2 0 0 83 65 28
8343 48 0 0 0 3 1 0 45 29 12
8330 63 1 0 0 2 1 0 60 41 17
20-1 59 6 1 0 11 3 1 42 23 9
P-6 42 6 1 0 9 2 0 27 14 6
P-16 71 15 3 0 22 3 1 34 18 7
Note:1.Callus types formed by the circulate-culture.
2.Callus w ith somat ic embryos.
3.Plantlets formed f rom somatic embryos.
a.Nonf riable state;b.In termediate state;c.Friable state.
2.4　培养时间对植株再生能力的影响
采用循环调控继代的愈伤组织经植株再生能力测定表明(见表 4),培养 96周后它的
再生植株能力没有降低 ,为 40%左右。当培养时间延长到 128周 ,愈伤组织植株再生率
比培养 96周降低 12.5%,培养到 160周后下降了 27%,以至培养 192周后 ,再生植株的
能力完全丧失。愈伤组织经循环调控继代比在 IN6上连续继代的植株再生能力维持时间
延长了 1倍。
表 4　培养时间与愈伤组织植株再生
Table 4　Plant regeneration from different week number of callus cultures
Time/ w eek Number of calli Green plant let s
Number %
Albino plants
Number %
16 254 120 47.2 29 11.4
32 84 33 39.2 12 14.3
48 131 55 42.0 21 16.0
64 145 53 36.6 20 13.8
80 158 59 37.3 24 15.2
96 146 56 38.4 21 14.4
112 152 45 29.6 36 23.7
128 139 36 25.9 45 32.4
144 122 20 16.3 36 29.5
160 142 16 11.4 29 20.4
176 117 6 5.1 13 11.1
192 113 0 0.0 4 3.5
Date were averaged over the three variet ies(GY-8 ,8343 and 8330).
2.5　悬浮细胞培养和悬浮系的建立
选择颗粒状胚性愈伤组织转移到液体培养基中 ,经一周的悬浮培养后 ,整个培养液看
491 期 崔　林等:裸燕麦胚性愈伤组织培养及悬浮系的建立
起来比较混浊 ,并有一些分散的小细胞团变褐死亡 。用新鲜的培养液及时更换瓶中的培
养液 ,当更换 3 ～ 4次后 ,培养物逐渐适应了液体培养条件 ,并开始生长。在摇床的振荡下
不断释放出单细胞和细胞团。用 300目不锈钢网筛过滤 ,滤液继续振荡培养 ,5 ～ 7d更换
1次培养液 ,大约 2月后得到了浅黄色 、澄清 、均一 、由胞质浓厚的细胞组成的悬浮系(图
版Ⅰ-4 , 5)。
2.6　悬浮细胞的分化和植株再生
将悬浮培养物接种在 IM2 固体培养基上进行培养 ,当形成 2mm 的愈伤组织后 ,接种
在 IM 3 固体培养基上 。形成颗粒状愈伤组织后 ,转移到 IM1 分化培养基上进行植株分
化。约经 1月左右 ,在愈伤组织上形成许多浅白色 、似心状的胚状体 ,这些胚状体进一步
发育 ,先由下端产生许多根 ,然后由顶端分化出幼芽 ,形成小植株(图版Ⅰ-6)。此途径成
苗约占再生植株的 80%。另一种途径是在愈伤组织上直接形成很多绿点 ,随后发育成幼
芽。将产生许多幼芽的愈伤组织进行分芽 ,然后接种在无激素的 N6 培养基上约 20d左
右 ,可获得完整的小植株 。
当再生植株长以 4 ～ 5cm时 ,可出瓶移栽到装有细砂土的小烧杯中 。一周左右 ,当根
系进一步发育到健壮时 ,再移栽到花盆或温室定植 。再生植株移栽成活率达 95%以上 。
参 考 文 献
1　王海波.作物杂志 , 1991 ,(3):3～ 6
2　王海波 ,石西平 ,范云六.全国第二届青年农学学术年会论文集 ,北京:中国农业科技出版社 , 1995 , 772～ 775
3　邢登辉 ,吴琴生 ,刘大钧.生物学通讯 , 1994 , 29(7):1～ 3
The Culture of Embryogenic Calli and the
Establishment of Suspension Cell Line of Naked Oats
Cui Lin　Fan Yinyan
(Inst itute of Cold Crops , Shanxi Academy of Agricultural Sciences , Datong 037004)
Abstract　The mature embryos of six naked oats variet ies(Avena nuda L.)were cultured
to induce callus in IN medium.The frequency of callus formation of variety “GY-8” was the
highest (95.4%)among the six genotypes.The ini tial callus f rom the mature embryos of
naked oats w as w hite , nodular , outside sof t and inside hard , easier differentiated plantlet .
This st ructure w as regarded as nonfriable state.To improve its regeneration properties , the
callus w as cultured in IM1 , IM2 , IM3 , IM4 media successively.After seven or eight months ,
embryogenic callus became w ish yello-white , granular , finely divided , and relatively friable.
Frequencies of embryogenic calli were maintained steadily over 95%.However ,decline speed
of callus vitality w as slow ed down.The cell suspension cultures w ere established from friable
calli.The plant lets were induced from the suspension cell line in dif ferentiation medium .The
survival rate of plant let t ransplantation w as over 95%.
Key words　Naked oat ,mature embryos , embryogenic callus , suspension culture , regenerating
plants
50 生　　物　　工　　程　　学　　报 14 卷