全 文 ：第 33 卷 第 3 期
2012 年 5 月
内 蒙 古 农 业 大 学 学 报
Journal of Inner Mongolia Agricultural University
Vol． 33 No． 3
May． 2012
向日葵芽期抗旱相关性状丙二醛
含量的 SSR分子标记分析*
张永虎1， 陈 雪2， 于海峰3， 侯建华1* ， 斯日古楞1
(1．内蒙古农业大学农学院，呼和浩特 010018;2．潍坊市农业科学院，潍坊 261041
3．内蒙古农牧业科学院，呼和浩特 010031)
摘要: 以干旱胁迫下丙二醛含量作为抗旱性鉴定指标，对 K55 × K58 杂交组合的亲本、F1、F2:3 家系丙二醛分析结
果表明:自交系 K58 为强抗旱性品种，K55 为弱抗旱性品种，F1 为高抗，F2:3 家系抗、感分离比例符合 3:1。进一步
利用 BSA法 对 60 对 SSR标记进行筛选，其中引物 ORS510 和 ORS317 在抗感基因池间表现稳定的多态性，并且在
F2、F2:3 家系个体中表现出抗性与多态性协同分离的趋势。采用 MAPMAKER 数据分析软件分析，表明 ORS510、
ORS317 距离干旱胁迫下控制丙二醛含量的抗性基因分别为 6． 8cM、9． 7cM。
关键词: 油葵; 丙二醛; SSR分子标记
中图分类号: S565． 534 文献标识码: A 文章编号:1009 － 3575(2012)03 － 0025 － 04
ANALYSIS OF SSR MARKERS FOR MALONDIALDEHYDE
CONTENT ASSOCIATED WITH DROUGHT － RESISTANCE
IN BUDING OF SUNFLOWER
ZHANG Yong － Hu1， CHEN Xue2， YU Hai － Feng3， HOU Jian － Hua1* ， Siriguleng1
(1． College of Agronomy ，Inner Mongolia Agricultural University，Huhhot 010018，China;
2． Weifang Academy of Agricultural Sciences，Weifang 261041，China;
3． Inner Mongolia Academy of Agricultural Sciences，Huhhot 010031，China)
Abstract: We studied on the cross combinational parents of the K55 × K58 and F1，F2:3 family of malondialdehyde content as
drought － resistance identification indexes under drought stress results showed that K58 had drought resistance，K55 had emotional vari-
ety，F1 had the high resistance and F2:3 family resistant and susceptible separation in line with the 3:1 ratio． Using BSA method of 60
pairs SSR markers screening，including primer ORS510 and ORS317 in anti － influenza gene pool had stable performance and in the
F2，F2:3 family individual showed resistance and polymorphism collaborative separation trend． Depending on the software MAPMAK-
ER data analysis showed that ORS510 and ORS317 distances from the MDA chain gene － related sites were 6． 8cM，9． 7cM under
drought stress．
Key words: Oil sunflower; Malondialdehyde; SSR molecular markers
向日葵芽苗期发生水分缺乏，主要影响成苗率，
造成弱苗、缺苗，导致单位面积上植株数量减少，进
而造成群体产量的损失，同时苗期干旱还可导致生
育期的滞后，从而带来不必要的损失［1］。
培育并推广向日葵耐旱新品种是解决干旱环境
下产量损失的重要而有效的途径。而传统育种方法
进行耐旱性遗传改良的效率不高，且耐旱性需要特
殊的环境才能被鉴定。AFLP、SSR 等分子标记技术
基础上发展起来的分子标记辅助选择育种，提高了
传统育种效率，为耐旱性育种带来新的途径［2，3］。定
位耐旱基因及筛选与耐旱基因紧密连锁的分子标记
是实施分子辅助选择育种的前提和基础。截止到目
* 收稿日期: 2011 － 07 － 11
基金项目: 内蒙古自治区自然科学基金重点项目(编号:2010zd06) ;国家科技支撑计划项目(2009BADA8B04)
作者简介: 张永虎(1986 －) ，男，硕士研究生，主要从事作物抗性遗传改良方面的研究．
* 通讯作者: E － mail:Houjh68@ 163． com
前，有关向日葵苗期干旱胁迫下的耐旱相关性状基
因的定位及分子标记的研究报道不多［4，5］。丙二醛
(MDA)作为膜脂过氧化产物，其含量可以反映细胞
膜脂过氧化程度和作物对逆境胁迫抗耐性的强
弱［11］。本试验旨在利用 SSR标记技术，通过对耐旱
性不同亲本自交系及其杂交后代群体分析，找到与
向日葵芽期干旱胁迫下丙二醛含量紧密连锁的分子
标记，以期为向日葵抗灾减灾新品种的培育和分子
标记辅助育种研究提供基础研究和技术支持。
1 材料和方法
1． 1 材料
研究材料由内蒙古农牧业科学研究院提供。
2007 年向日葵亲本自交系 K55 × K58 杂交收获 F1，
2008 年 F1 单株自交获得 F2 群体。2009 年 F2 单株
自交收获 300 个 F2:3家系。
1． 2 实验方法
1． 2． 1 丙二醛含量测定 采用赵世杰等的方法［6］
分别取对照和干旱处理(20% PEG －6000)发芽第 14
天的幼芽，将其剪碎，称量 1g，加入 2ml l0% TCA 和
少量石英砂，研磨至匀浆，再加 8ml TCA 进一步研
磨，匀浆在 4 000r /min 离心 10min，上清液为样品提
取液。吸取离心的上清液 2ml(对照加 2mlTCA) ，加
入 2ml 0． 6% TBA 溶液，混匀物于沸水浴上反应
15min，迅速冷却后再离心。取上清液测定 532nm、
600nm和 450nm波长下的消光度。实验设置 3 个重
复。
根据下列公式计算丙二醛含量:
MDA(mmol· g －1 FW)=［6． 452 × (D532 －
D600)－ 0． 559 × D450］×
1． 2． 2 DNA提取及抗感池的建立
1． 2． 2． 1 油葵叶片 DNA 的提取 采用 CTAB 真叶
法提取 DNA，用 RNA酶解液降解 RNA。样品放入 －
20 ℃冰箱中保存备用。
1． 2． 2． 2 BSA(Bulked Segregant Analysis)分池 参
照 Michelmore［7］提出的 BSA 方法，根据 F2:3群体干
旱胁迫下丙二醛含量的抗旱性鉴定结果，提取 F2 群
体的单株 DNA 建立了抗、感基因池。选取 15 株极
强抗旱的 F2 单株 DNA 等量混合建成 DNA 抗池，选
取 15 株极弱抗旱的 F2 单株 DNA 等量混合建成
DNA感池，利用亲本间有多态性的 SSR 引物对抗、
感基因池进行引物筛选，记录扩增情况。
1． 2． 3 SSR 分析 SSR 引物来源:根据 genbank 网
址和 S． Tang等［8，9］提供的 SSR 引物序列，由上海生
物工程公司合成。
PCR 反应体系:25μl 反应体系中含有基因组
DNA1μl (50ng) ，2 × Taq Master Mix 12． 5μl，10μM
引物 1． 0μl，ddH2O10． 5μl，PCR 反应程序:94℃预变
性 3min，94℃变性 3s，54℃退火 30s，72℃延伸 1min，
循环 30 次后，72 ℃延伸 10min ，然后于 4 ℃下保存。
聚丙烯酰胺凝胶电泳:用 6%的变性聚丙烯酰胺凝胶
电泳分离扩增产物。用快速银染法对凝胶进行染
色，统计带型，电脑扫描。
1． 2． 4 数据统计 用抗感亲本和抗感池一起进行
扩增反应，找到扩增时抗亲与感亲、抗池与感池之间
存在差异，同时抗亲与抗池、感亲与感池之间又完全
一致所用的引物，再用这些引物与整个 F2 群体中每
个个体进行 PCR反应，观察是否与 F2:3 家系抗性鉴
定结果一致，并记录谱带位置
1． 2． 5 连锁分析 采用 MAPMAKER数据分析软件
进行数据处理。每个 SSR 位点以 A 和 B 记录等位
基因的有无，计算标记与目标基因之间的遗传距离。
2 结果与分析
2． 1 F2:3群体、F1 及亲本丙二醛含量的表现
抗旱性分类采用干旱处理条件下的群体逐级分
类法［10］分为 5 个等级(表 1)。
表 1 抗旱类型与分类标准
Tab． 1 Drought － resistant classification
and classification standards
抗旱类型 丙二醛含量(mmol·g －1)
极强抗旱(0 级) ＜ 0． 283
强抗旱(1 级) ≥0． 283 ＜ 0． 367
中度抗旱(2 级) ≥0． 367 ＜ 0． 556
弱抗旱(3 级) ≥0． 556 ＜ 0． 631
极弱抗旱(4 级) ≥0． 631
表 2 中看出，亲本 K55 为弱抗旱(3 级抗旱) ，
K58 为极强抗旱(0 级抗旱) ，F1 表现强抗旱(1 级抗
旱)。F2:3群体变异系数较低，表现出了较小的变幅。
干旱胁迫下的丙二醛含量广义遗传力较高，为 0． 991
9。
2． 2 F2:3群体单株的抗旱性鉴定结果及 χ
2 分析
F2:3家系的 300 个单株抗旱性分布如图 1 所示:
干旱胁迫处理下的丙二醛含量显示有 63 个极强抗
旱类型，53 个强抗旱类型，107 个中度抗旱型，35 个
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弱抗旱类型，42 个极弱抗旱类型。经 χ2 测验结果
(表 3 )表明:以丙二醛为抗旱相关性状分级后的抗
株和感株符合 3:1 分离比例。结合亲本、F1 在丙二
醛含量上的表现以及遗传力大小(0． 991 9)和 χ2 测
验结果，初步认为模拟干旱胁迫下丙二醛含量是 1 ～
2 对主效基因控制的性状，属于简单遗传的质量性状
或主效基因控制的数量性状，受环境影响小。
图 1 F2:3 家系抗旱性分布图
Fig． 1 The distribution of resistant and
susceptible line in F2:3 population
2． 3 引物筛选
2． 3． 1 亲本筛选结果 利用均匀分布于向日葵 17
个连锁群上的 60 对引物在亲本间进行全基因组的
差异性筛选，结果发现:52 对引物能扩增出清晰的谱
带，只有 8 对引物没有扩增产物，表明选用的引物及
优化的 SSR技术对于亲本材料遗传差异的 SSR标记
研究是适宜的。在 52 对具扩增带的引物中，亲本间
有明显多态性的引物共有 7 对，多态性频率为 13．
5%。
2． 3． 2 抗、感池间的引物筛选结果 利用亲本间有
多态性的 7 对引物对抗、感基因池进行筛选，只有 2
对引物 ORS510、ORS317 在抗、感池间有多态性(图
2、图 3)。从 ORS510 在抗、感基因池和混合池的扩
增结果看出(图 2) ，1 道为抗池的扩增谱带，差异片
段约为 820bp，2 道为感池的扩增谱带，差异片段约
为 860bp。同样，从 ORS317 在抗、感基因池间的扩
增结果看出(图 3) ，1 道为抗池的扩增谱带，差异片
段约为 380bp，2 道为感池的扩增谱带，差异片段约
为 440bp。
表 2 F2:3群体丙二醛含量的表型分析
Tab． 2 The phenotypic analysis of MDA content in F2:3 population
性状 变幅 平均值 变异系数 K55(♀) K58(♂) 平均值
杂种优势
指数
广义遗传力
(Hb2)
丙二醛 0． 0767 ～ 0． 927 0． 457 ± 0． 174 0． 381 0． 576 0． 129 0． 351 1． 020 0． 9919
表 3 抗性分布的 χ2测验
Tab． 3 χ2 test of resistant and susceptible distribution
丙二醛含量 总株数 抗株(0 ～ 2) 感株(3 ～ 4) 期望比 χ2
实际株数(0) 300 223 77 3:1 0． 071
理论株数 (E) 300 225 75
注:χ20． 05，1 = 3． 84 χ20． 01，1 = 6． 63
2． 3． 3 F2 代群体验证 利用在抗、感基因池间有多
态性的引物 ORS510、ORS317，进一步对所有 F2 分离
群体的 300 个单株进行 PCR 扩增，其扩增产物具有
三种带型:抗旱基因型、F1 杂合基因型和感型基因
型，引物 ORS510 感型差异片段约 860bP，抗旱差异
片段约 820bp(图 4) ，引物 ORS 317 感型差异片段约
440bP，抗旱差异片段约 380bp(图 5)。F2 代扩增带
型与 F2:3家系抗旱性表现的比较结果表明:F2:3家系
群体中干旱胁迫下丙二醛含量鉴定的抗旱株、不抗
旱株与 F2 代 300 个单株 PCR 扩增带型表现基本一
致。说明 ORS510、ORS317 与控制丙二醛的基因相
连锁。
2． 4 连锁分析
根据 F2:3家系群体在干旱胁迫下丙二醛的 5 级
抗旱性表现，将 0 ～ 2 级定义为抗旱性，标记为 A;3、
4 级定义为不抗旱性，标记为 B;同样将 ORS510、
ORS317 两对引物 F2 群体扩增的 SSR 条带进行统
计，抗性带记为 A，感性带记为 B。采用 MAPMARK-
ER软件进行数据分析。结果表明控制干旱胁迫下
丙二醛含量的抗旱相关基因与 ORS510、ORS317 的
连锁距离为 6． 8cM和 9． 7cM。
72第 3 期 张永虎等: 向日葵芽期抗旱相关性状丙二醛含量的 SSR分子标记分析
图 2 ORS510 抗感池筛选
Fig． 2 Screening for resistance
and perceptual pool ORS510
图 3 ORS317 抗感池筛选
Fig． 3 Screening for resistance
and perceptual pool of ORS317
图 4 引物 ORS510 的 SSR标记结果
Fig． 4 The primer ORS510＇s SSR marker results
图 5 ORS317 的 SSR标记结果
Fig． 5 The primer ORS510＇s SSR marker results
3 讨论
很多研究表明，作物抗(耐)旱性是一个复杂的
多基因控制的数量性状。作物抗旱性的表现是许多
抗旱相关性状的综合表现，正如作物产量性状一样，
其产量的表现是由产量构成因素的综合作用决定
的。众所周知，作物抗(耐)旱性是多基因控制的复
杂数量性状。但抗旱性组成因素中的各基础性状的
遗传力明显不同，从本试验的研究结果分析得出，向
日葵芽期中抗(耐)旱相关性状丙二醛含量的遗传力
较高，属主效基因控制的遗传性状。而且，从连锁分
析的数据推断出，与 ORS510、ORS317 标记位点连锁
的丙二醛合成有关的基因很可能是主效显性基因。
MDA是膜脂过氧化的终产物，其含量反映细胞
膜膜脂过氧化程度和植物对逆境条件反应的强弱。
目前对丙二醛的研究多局限于生理生化水平。但随
着 QTL 定位技术的发展。定位的基因已从农艺、产
量性状逐步深入到生理生化和酶活性等性状。蒋靓
等［11］利用 RIL 群体成功地检测到冷诱导下控制水
稻叶片 MDA含量的 2 个主效 QT L。
目前我国对作物抗旱性状分子标记的研究较
少，特别是对向日葵抗旱性分子标记研究还未见报
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道。本研究首次利用 SSR标记技术对向日葵芽期模
拟干旱胁迫下的丙二醛含量进行了标记分析，研究
鉴定出了两个具有多态性的标记 ORS510 和 ORS317
可能是与丙二醛合成有关的主效基因相连锁的分子
标记。本试验研究结果对作物抗旱性状分子遗传的
认识和进一步深入研究提供了初步试验依据。
参 考 文 献:
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