全 文 ：山东中医杂志 2015 年 3 月第 34 卷第 3 期
呼吸道合胞病毒（RSV）是婴幼儿下呼吸道感染
的最主要病原体，同时也是致使某些免疫抑制人群
和老年人群发病和死亡的重要原因 ［1］。 目前能有效
治疗 RSV 感染的药物很少，美国食品药品管理局
（FDA） 批准治疗 RSV 的药物只有 2 种： 利巴韦林
（病毒唑）和 RSV免疫球蛋白。 但因利巴韦林毒性较
大和近年来对其疗效的争议 ［2］，使其临床应用受到
极大限制。而 RSV免疫球蛋白由于治疗费用高和存
在血清制品的安全问题，在预防和治疗 RSV 感染
时，仍需谨慎考虑［2］。 因此，临床急需高效廉价安全
的 RSV感染防治药物。
荆芥穗为唇形科植物裂叶荆芥 Schizonepeta
荆芥穗提取物体外抗呼吸道合胞病毒有效部位研究
张 霞 1，周长征 2，姚梅悦 1，陈 飞 1
（1.山东中医药大学 2012年级硕士研究生，山东 济南 250355； 2.山东中医药大学药学院，山东 济南 250355）
［摘要］ 目的：研究荆芥穗提取物不同部位对呼吸道合胞病毒（RSV）的体外抗病毒活性。方法：荆芥穗提取液经过 D101 大孔
树脂吸附后，依次用水、25%乙醇、50%乙醇、75%乙醇进行洗脱。采用 MA-104 细胞感染模型，以利巴韦林为阳性对照药，初步检测
其体外抗病毒活性。 在显微镜下观察细胞病变，酶标仪测中性红染色 OD 值，计算治疗指数（TI）。 结果：水洗脱液的 1，2，3 号均
有抗 RSV 的效果，其中尤以 2 号最为有效，其 TI 为 63.55。 结论：荆芥穗的水溶性成分对 RSV 病毒有明显的抑制作用。
［关键词］ 荆芥穗；呼吸道合胞病毒；体外抗病毒；有效部位
［中图分类号］ R284.2 ［文献标志码］ A ［文章编号］ 0257-358X（2015）03-0213-03
Study on Antiviral Components in vitro of Schizonepeta tenuifolia Briq.
ZHANG Xia1，ZHOU Changzheng2，YAO Meiyue1，CHEN Fei1
（1.Master Degree Candidate of Grade 2012，Shandong University of Traditional Chinese Medicine，Jinan
250355，China；2.Shandong University of Traditional Chinese Medicine，Jinan 250355，China）
Abstract Objective：To study antiviral activities of different components extracted from Schizonepetae
tenuifolia Briq. on respiratory syncytial virus（RSV） in vitro. Methods：The extraction solution of Schiznepeta
tenuifolia Briq. was absorbed by D101 macroporous resin，and then washing it with water，25% ethanol，50%
ethanol and 75% ethanol respectively. Through MA-104 cells infection model and using Ribavirin as a posi-
tive control，anti-RSV activity was detected in vitro. Cytopathic effect was carried out by microscope，neutral
red staining OD value was measured by ELIASA and therapeutic index（TI） was calculated. Results：The
washing liquid of No. 1，2，3 had the effects of anti-RSV. The most effective liquid was No.2，its TI was
63.55. Conclusion：Water-soluble components of Schizonepeta tenuifolia Briq. has obvious effects of anti-RSV.
Key words Schizonepeta tenuifolia Briq.；respiratory syncytial virus；antiviral in vitro；effective parts
［收稿日期］ 2014-05-06
［通信作者］ 周长征（1966-），教授，硕士研究生导师，主要从事
药物新剂型与新技术研究 ，Tel：15552563267，E-mail：zcznfj@sina.
com。
74.1%，平均值为 74.44%；煅石蟹主成分 CaCO3含量
最高值为 90.8%，最低值为 84.35%，平均值为 88.48%。
可见，经过炮制后，CaCO3的含量稍有增加，考虑到
不同地区样品收集的差异性，故暂规定石蟹及煅石
蟹中 CaCO3含量限度定为不得少于 70%。
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DOI:10.16295/j.cnki.0257-358x.2015.03.026
山东中医杂志 2015 年 3 月第 34 卷第 3 期
tenuifolia Briq.的干燥花穗，其芳香气烈，性微温，味
辛，入肝、肺经，常用来治疗感冒、头痛、麻疹、风疹、
疮疡等，为常用的疏风解表药［4］。 现代药理研究也证
明其成分有良好的抗病毒、抗炎、镇痛作用。 本文采
用细胞病变抑制实验对荆芥穗体外抗 RSV 进行了
研究。
1 实验材料与仪器
1.1 细胞株与病毒株 MA-104 细胞（山东省医学
科学院基础医学研究所微生物室）；RSV（中国疾病
预防控制中心病毒研究所流感病毒研究室）。
1.2 药品与试剂 荆芥穗干品由山东中医药大学
提供。 MEM 培养基（GIBCO 公司），蒸馏水，95%乙
醇，1640 细胞培养液（美国 GIBCO 产品，含 10%牛
血清），中性红染液，1640 细胞维持液（美国 GIBCO
产品，含 2%牛血清），pH 7.4 的磷酸盐缓冲液（PBS）
（含 NaCl 8 g、KCl 0.2 g、KH2PO4 0.2 g、Na2HPO4 2.9 g，
加三蒸水至 1 000 mL，除菌，分装，置 4℃备用），D101
大孔树脂，中性红脱色液，其他化学试剂均为分析
纯。
1.3 实验仪器 高速台式离心机（TD5M 型，长沙
湘智离心机仪器有限公司），MK3 酶标仪（Lab sys-
tems 公司），低温冰柜（-40 ℃，三洋公司），隔水式二
氧化碳培养箱（美国 Forma公司产品），水浴锅（黄骅
市综合电器厂），超低温冰柜（-80 ℃，725 型，Thermo
Forma 公司），微量移液器（法国 GILSON 公司），荧
光倒置显微镜（日本奥林帕斯公司）。 旋转蒸发仪（上
海亚荣生化仪器厂），高压灭菌锅（上海申安医疗器
械厂），超净工作台（上海力申科学仪器有限公司），
CKX-31倒置显微镜（Olympus公司）。
2 实验方法
2.1 荆芥穗提取液的制备 称取荆芥穗 100 g，粉
碎成细粉，用 15 倍的蒸馏水加热回流提取 2 h，过
滤；药渣用 10 倍量水回流提取 1 h，合并两次滤液，
趁热抽滤，浓缩至一定体积，作为上样液，备用。
2.2 D101 大孔树脂预处理及装柱 取一定量的大
孔树脂，先用体积分数 95%乙醇充分浸泡 24 h，用蒸
馏水洗净乙醇，然后用 4 倍柱体积的 5%HCl 溶液浸
泡 3 h，用蒸馏水洗至中性，接着用 4 倍柱体积的
50 g/L NaOH 溶液浸泡 3 h，最后用蒸馏水洗至中
性，以湿法装柱，再以 95%乙醇清洗，直到流出液澄
清为止，用蒸馏水洗至无乙醇味［5］。
2.3 上样及洗脱 将荆芥穗提取液以一定流速通
过 D101 大孔树脂进行动态吸附，依次用 3 倍柱体
积的蒸馏水、25%乙醇、50%乙醇以及 2 倍柱体积的
75%乙醇进行洗脱，收集每一树脂流出的体积，共收
集 11 份。 将 11 份流出液减压浓缩，装入 EP 管备
用。
2.4 体外抗病毒实验
2.4.1 细胞复苏穿代 ［6］ 取出液氮冻存的 MA-104
细胞立即放入 37 ℃的水浴中，不断晃动细胞瓶以使
其快速融化悬浮于培养液中，后将细胞培养瓶置于
37 ℃、5% CO2条件下静止培养，细胞 24 h 后长成单
层，用 0.25%胰酶消化后进行 1∶2 传代，等细胞长成
单层时即可用于实验。
2.4.2 提取物处理 将荆芥穗提取液装入小青瓶
中，高压灭菌。
2.4.3 抑病毒实验 ［6］ 将荆芥穗的 11 份收集液用
2%1640细胞维持液分别作 2倍系列稀释共 12 个稀
释度，按稀释度顺序以每孔 100 μL 的量横向接种于
96板孔中的单层 MA-104细胞上，每孔再加入用 2%
1640（1∶500）稀释的呼吸道合胞病毒 100 μL，同时设
病毒组、利巴韦林组、正常组。 37℃、5%CO2培养，每
日观察细胞病变。 病毒组出现 90%以上的病变后，
用倒置显微镜观察，将 96 孔板中的培养液拍出，每
孔加入 100 μL 中性红染液，放入 37 ℃培养箱反应
1 h，取出，倒出染液，用小水流自来水冲洗 3～5 遍，
甩干，每孔加入 100 μL 脱色液，37 ℃恒温箱放置
15 min 后，再用酶标仪于 540 nm 处测定 OD 值。 见
表 1、2。
3 实验结果
实验细胞存活率=实验组 OD值-空白 OD值/细
胞对照组 OD 值 -空白 OD 值×100%，若 > 50%，则
视为有效。 结果见表 3。
按照 Reed-Muench氏法分析以上数据，计算药物
半数中毒浓度（TC50）和药物半数有效浓度（EC50）。治疗
指数（TI）=TC50/EC50，其中 EC50=Antilog（log 高于 50%
存活率药物稀释度的值-比距），TC50=Antilog（log高
于 50%病变率药物稀释度的值 -比距）。 得出经过
不同体积分数乙醇洗脱的部位，结果显示抑毒效果
不明显，水洗脱部位均有抗 RSV 的作用，其中水 1，
2，3 抗病毒效果显著 ，其 TI 分别为 39.14，63.55，
34.25。 阳性对照药物利巴韦林的 TI为 92.96。
4 讨论
荆芥穗为银翘散抗流感病毒的主要药物，但对
其抗 RSV 作用的研究尚未见报道，本文用细胞培养
的方法，以利巴韦林为阳性对照，初步检测了荆芥穗
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山东中医杂志 2015 年 3 月第 34 卷第 3 期
表 1 荆芥不同部位的 OD 值
0 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11
水 1 0.112 0.219 0.396 0.445 0.488 0.525 0.461 0.326 0.242 0.194 0.145 0.122
水 2 0.109 0.405 0.454 0.489 0.505 0.464 0.412 0.308 0.268 0.190 0.140 0.125
水 3 0.104 0.403 0.469 0.49 0.514 0.419 0.321 0.329 0.222 0.189 0.152 0.120
25%乙醇 1 0.115 0.126 0.201 0.268 0.309 0.289 0.256 0.204 0.169 0.130 0.124 0.110
25%乙醇 2 0.107 0.149 0.256 0.279 0.318 0.287 0.234 0.210 0.189 0.163 0.128 0.123
25%乙醇 3 0.112 0.175 0.217 0.269 0.299 0.318 0.274 0.230 0.179 0.152 0.132 0.114
正常组 0.582 0.65 0.68 0.701 0.689 0.712 0.585 0.723 0.654 0.661 0.643 0.705
病毒组 0.105 0.101 0.112 0.099 0.105 0.110 0.108 0.102 0.093 0.105 0.098 0.092
表 2 荆芥不同部位的 OD 值
0 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11
50%乙醇 1 0.109 0.139 0.221 0.270 0.316 0.320 0.283 0.243 0.182 0.162 0.133 0.112
50%乙醇 2 0.110 0.137 0.187 0.201 0.264 0.289 0.273 0.230 0.199 0.152 0.136 0.111
50%乙醇 3 0.102 0.128 0.169 0.195 0.238 0.279 0.300 0.285 0.241 0.179 0.143 0.113
75%乙醇 1 0.120 0.147 0.236 0.274 0.293 0.301 0.276 0.241 0.182 0.153 0.132 0.102
75%乙醇 2 0.115 0.121 0.143 0.179 0.201 0.264 0.289 0.300 0.265 0.200 0.156 0.120
利巴韦林 0.112 0.416 0.446 0.498 0.501 0.498 0.462 0.399 0.157 0.141 0.134 0.124
正常组 0.643 0.709 0.639 0.696 0.662 0.593 0.695 0.658 0.66 0.631 0.685 0.671
病毒组 0.111 0.094 0.104 0.093 0.098 0.102 0.110 0.095 0.099 0.105 0.106 0.103
表 3 荆芥各部位对应的细胞存活率（%）
0 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11
水 1 16.84 32.93 59.55 66.92 73.38 78.95 69.32 49.02 36.39 29.17 21.80 18.34
水 2 16.39 60.90 68.27 73.53 75.94 69.77 61.95 46.31 40.30 28.57 21.05 18.79
水 3 15.64 60.60 70.53 73.68 77.29 63.00 48.27 49.47 33.38 28.42 22.86 18.04
25%乙醇 1 17.29 18.95 30.22 40.30 46.47 43.46 38.49 30.68 25.41 19.55 18.65 16.54
25%乙醇 2 16.09 22.4 38.49 41.95 47.82 43.16 35.18 31.58 28.42 24.51 19.24 18.49
25%乙醇 3 16.84 26.32 32.63 40.45 44.96 47.82 41.20 34.59 26.92 22.86 19.85 17.14
50%乙醇 1 16.46 20.99 33.38 40.78 47.73 48.34 42.75 36.71 27.49 24.47 20.09 16.92
50%乙醇 2 16.62 20.69 28.24 30.36 39.88 43.66 41.24 34.74 30.06 22.96 21.54 16.77
50%乙醇 3 15.41 19.33 25.53 29.45 35.95 42.14 45.32 43.05 36.40 27.04 21.60 16.89
75%乙醇 1 18.13 22.20 35.65 41.39 44.26 45.47 41.69 36.40 27.49 23.11 19.94 15.4
75%乙醇 2 17.37 18.27 21.60 27.04 30.36 39.88 43.65 45.32 40.03 30.21 23.56 18.13
利巴韦林 16.92 62.84 67.37 75.23 75.68 75.23 69.79 60.27 23.72 21.30 20.24 18.73
体外抗呼吸道合胞病毒的作用。结果显示在 MA-104
细胞上荆芥穗和利巴韦林的抑毒指数分别为
63.55，92.96。 但是利巴韦林的毒性较大，使其临床
应用受到极大的限制。 荆芥穗为天然中草药，抗 RSV
效果与利巴韦林相差不大。 本实验结果表明，荆芥穗
中抗 RSV 的效果最为显著的是其水溶性部位，可以
对该部位进一步分离纯化，以便更好地应用于临床。
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