全 文 ：雪莲果叶片愈伤组织的诱导
王洪习 , 张志轩 , 尚霄丽 , 汪 妮 , 谷延泽 , 李明泽　(濮阳职业技术学院 , 河南濮阳 457000)
摘要　[目的] 研究雪莲果叶片愈伤组织诱导的最佳灭菌方法和最佳培养基。[方法] 以雪莲果叶片为外植体 ,用浓度 0.1%升汞浸泡不
同时间 ,筛选最佳灭菌方法;以MS 为基本培养基 ,比较不同浓度生长调节物质对愈伤组织诱导的影响。[结果] 用浓度 0.1%升汞溶液
灭菌8 min ,外植体污染率为 54.55%,死亡率为3.64%;最佳诱导培养基为MS+6-BA 1.0～ 1.5 mg/L+NAA 0.5～ 1.0 mg/L。[结论] 最佳
灭菌方法为浓度 0.1%升汞对叶片灭菌 8 min;诱导愈伤组织的最佳培养基为MS+6-BA 1.0～ 1.5 mg/L+NAA 0.5～ 1.0 mg/L。
关键词　雪莲果;愈伤组织;诱导
中图分类号　S 661.9　　文献标识码　A　　文章编号　0517-6611(2008)25-10785-02
Callus Induction of Smallanthus sonchifolius Leaves
WANG Hong-xi et al　(Puyang Vocational &Technical Institute, Puyang, Henan 457000)
Abstract 　[Objective] The experiment was carried out to study the optimum sterilizing method and medium in callus induction of Smallanthus sonchi-
folius leaves.[Method] The leaves were sterilized in 0.1%mercuric chloride at different times to seek out the optimum sterilizing method.MS medium
with different concentrations of growth regulating substance was adopted to contrast their effects on callus induction.[ Result] Explants sterilized in 0.1%
mercuric chloride for 8 min had the best effect.The optimum medium for callus was MS+ 6-BA 1.0-1.5 mg/L+NAA 0.5-1.0 mg/ L.[ Conclusion]
The optimum sterilizing method was sterilizing the leaves for 8min in 0.1%mercuric chloride.And the optimum medium for callus was MS+6-BA 1.0-
1.5 mg/L+NAA 0.5-1.0 mg/ L.
Key words　 Smallanthus sonchifolius;Callus;Induction
作者简介　王洪习(1964-),男 ,河南清丰人 ,副教授 ,从事植物组织
培养方面的研究。
收稿日期　2008-06-24
　　雪莲果(Smallanthus sonchifolius),别名 Yacon(亚贡 、雅
贡)、菊薯 、雪莲薯 、地参果 、雅龙果 、雅根等 ,植物学分类上属
于菊科向日葵属双子叶草本植物。雪莲果原产于南美安第
斯山脉 ,是当地印第安人的传统根茎食品 ,种植历史已有 500
多年。近年来 ,我国先后有台湾 、云南 、海南 、贵州 、湖南等地
报道引种 、试种雪莲果获得成功。
雪莲果种子繁殖存在着结实率低 、种子多不育 、难萌发
等问题 ,生产上多以块根作繁殖材料 ,而块根繁殖易引起病
毒病积累 、种质退化等[ 1] 。利用组织培养方法繁殖 ,不仅可
以为生产提供一条在短期内繁殖出大量种苗的途径 ,以加速
新品种的推广 ,而且可以对其种质进行脱毒与复壮。目前 ,
国内有关雪莲果的研究报道多集中于引种 、栽培 、营养成分
及功能分析等方面[ 2-4] ,关于雪莲果组织培养方面的研究较
少。曾慎等对雪莲果离体快繁[ 5] 、试管苗移栽成活因素[ 6] 、
组培脱毒[ 1]等进行了初步研究。以雪莲果幼叶作为外植体 ,
笔者成功诱导出雪莲果愈伤组织 ,为分化培养提供有效材
料 ,为进一步快速繁殖与脱毒奠定基础 。
1　材料与方法
1.1　材料　供试雪莲果幼嫩叶片采自濮阳职业技术学院生
物工程与农业经济系雪莲果引种试验示范基地。
1.2　方法
1.2.1　材料处理。将雪莲果幼嫩叶片用自来水流水冲洗2 ～
4 h;用浓度 70%～ 75%酒精表面消毒 10～ 15 s ,无菌水冲洗 3
～ 5次;用浓度 0.1%升汞溶液分别消毒 4、6、8、10 min后 ,用
无菌水冲洗 3～ 5次 ,洗去植物表面的升汞残液 ,以构成不同
的消毒处理;将消毒材料放入无菌培养皿中 ,用无菌滤纸吸
干水分备用 。
1.2.2　愈伤组织诱导培养基。以MS为基本培养基 ,添加不
同种类和不同浓度的6-BA和NAA ,即A1(MS+6-BA 1.0mg/L
+NAA 0.5mg/L)、A2(MS+6-BA 1.0mg/L+NAA 1.0mg/L)、
A3(MS+6-BA 1.5mg/L+NAA 0.5mg/L)、A4(MS+6-BA 1.5
mg/L+NAA 1.0mg/L)。培养基中附加蔗糖 3%,琼脂 0.7%,
用 0.1mol/L NaOH或HCl调 pH值至5.8 ,在温度 121 ℃、压力
98 ～ 108 kPa的条件下 ,高压蒸汽灭菌 20 min左右后置无菌室
保存备用。
1.2.3　接种。无菌条件下 ,将消毒后雪莲果幼嫩叶片切成
约 0.5 cm×0.5 cm大小 ,接种在培养基上。接种时 ,使叶背
面与培养基接触 ,每瓶 1块 。
1.2.4　培养条件 。温度(25±2)℃,每天光照 12～ 16 h ,光照
强度 1 500～ 2 000 lx。
1.3　测定指标与方法
1.3.1　外植体污染率的测定 。外植体接种培养 1周后 ,统计
其污染率。
污染率=发生污染的外植体数目接种外植体总数 ×100% (1)
1.3.2　始愈期的测定。自外植体接种到培养基上起至肉眼
可见愈伤组织发生的时间(d)。
1.3.3　愈伤组织诱导率的测定。外植体培养 30 d后 ,统计其
愈伤组织诱导率。
愈伤组织诱导率=诱导出愈伤组织的外植体数未染菌的外植体总数 ×100%
(2)
2　结果与分析
2.1　外植体消毒方法的筛选　经不同时间处理的雪莲果叶
片接种后 ,培养 2～ 3 d就有不同程度的污染发生;培养 3 ～ 7
d ,出现大量的污染 ,主要由霉菌和细菌引起;培养 3周后 ,极
少数培养物出现污染 ,可能是由外植体携带的内生菌所致 。
由表 1可知 ,随着升汞溶液消毒时间的延长 ,外植体污染率
逐渐降低 ,褐化程度逐渐加深 ,成活率降低 ,主要由汞离子对
叶肉细胞毒害增大所致。因此 ,雪莲果叶片作为外植体进行
培养时 ,消毒处理的较佳选择为:先用浓度 70%～ 75%酒精
表面消毒 10 ～ 15 s ,再用浓度 0.1%升汞溶液消毒 8 min 。
2.2　叶片愈伤组织诱导　由表 2可知 ,雪莲果叶片接种后 ,
安徽农业科学 , Journal of Anhui Agri.Sci.2008 , 36(25):10785-10786　　　　　　　　　　　　　　　　　　　责任编辑　刘月娟　责任校对　傅真治
DOI :10.13989/j.cnki.0517-6611.2008.25.065
除A3 培养基上外植体材料略有延迟外 ,其余处理均在第 5
天就开始形成白色或淡黄色的愈伤组织。由图 1可知 ,愈伤
组织首先出现在叶片的切口边缘部位(较大叶脉周围出现
早),并逐渐扩展到整个外植体表面 ,部分外植体还出现中部
隆起弯曲现象。随着培养时间的增加 ,绝大多数愈伤组织的
颜色逐渐由白色或淡黄色转变为黄绿色或绿色 ,培养 4周后
A2 、A4 培养基上部分培养物表面开始出现红褐色球形突起 ,
其数目最多可达 4个。试验结果表明 ,黄白色愈伤组织能在
各试验培养基上成功诱导 ,诱导率为 100%,各培养基对愈伤
组织的诱导未表现出明显差异。该试验结果与杨绪等研究
结果[ 1]一致。诱导出的愈伤组织在 A3 培养基上生长缓慢 ,
而在A1 、A2 、A4 培养基上生长较快且未表现出明显的差异。
由此可知 ,在以雪莲果幼嫩叶片为外植体进行愈伤组织诱导
时 ,培养基中激素 6-BA 与 NAA 的合适比例应为(1∶1)～
(2∶1),最适宜的诱导培养基是MS +6-BA 1.0 ～ 1.5mg/L+
NAA 0.5～ 1.0mg/L。
表1　不同消毒时间对外植体的影响
Table 1　Effects of different disinfection time on explants
消毒时间
Disinf-
ection
time
min
接种外植体数
Number of
inoculated ex-
plants∥块
污染外植体数
Number of
polluted
explants∥块
污染率
Pollution
rate%
褐化死亡外植体数
Number of brow-
ning and dying
explants∥块
褐化死亡率
Rate of
browning
and dying
explants∥%
4 40 35 87.50 　　　0 　0
6 45 38 84.44 1 2.22
8 55 30 54.55 2 3.64
10 45 13 28.89 19 42.22
表 2　雪莲果叶片愈伤组织诱导情况
Tabel 2　The callus induction situations in Smallanthus sonchifolius leaves
组别
Group
接种外植体数
Number of
inoculated
explants
污染外植体数
Number of
polluted
explants
污染率
Pollution
rate∥%
褐化外植体数
Number of
browning
explants
褐化率
Browning
rate∥%
愈伤组织块数
Block
number
of calli
愈伤组织诱导率
Callus
induction
rate∥%
始愈期
Callus
formation
stage∥d
愈伤组织状态
Callus status
A1 40 27 67.50 7 　17.50 　　6 100 5 淡黄色或黄绿色 ,疏松,块大 ,中部弯曲隆起
A2 50 34 68.00 5 10.00 10 100 5 淡黄色或黄绿色, 疏松 ,块较大 ,中部弯曲隆起 ,部分出现红褐色球形突起
A3 45 30 66.67 4 8.89 2 100 8 黄绿色 ,块小,致密
A4 50 32 64.00 6 12.00 12 100 5 淡黄色或黄绿色, 疏松 ,块较大 ,中部弯曲隆起 ,部分出现红褐色球形突起
图 1　雪莲果叶片愈伤组织
Fig.1　The calli of Smallanthus sonchifolius leaves
3　讨论
在利用雪莲果幼嫩叶片诱导愈伤组织时 ,用浓度 0.1%
升汞进行外植体消毒的最佳时间为 8 min 。消毒时间越长 ,试
验材料受汞离子的毒害程度越大 ,褐化死亡率越高。试验发
现 ,有少数外植体被内生菌污染 。如何减少或防止该现象的
发生有待进一步研究。
该试验以 6-BA与NAA组合诱导愈伤组织 ,但未见其分
化形成不定芽。要获得试管苗 ,可考虑调整培养基中激素比
例配方或选用其他激素组合 ,进一步进行愈伤组织的分化诱
导试验。愈伤组织表面形成的红褐色球形突起是芽原基还
是其他结构 ,有待进一步培养观察。
参考文献
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与生命科学版, 2006 ,32(1):51-55.
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析[ J] .物质资源与环境学报, 2004 ,13(1):56-57.
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2007 ,9(6):41-43.
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[ 6] 李广平.影响亚贡组培苗成活的几个因素[ J] .林业实用技术 , 2005(6):
26.
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找到适宜的培养基种类及组培条件 ,可有效提高其繁殖效
率 ,广泛应用于观赏 、医药 、环保等领域可获得更高的经济
价值[ 1-2] ;还可以作为保存蜈蚣草种质资源的手段;另外 ,
通过组织培养对其孢子的发生发展过程进行研究 ,可为其
生理生化特性 、遗传和基因转化等的研究打下基础 。
参考文献
[ 1] 尹怀约.蜈蚣草叶片愈伤组织的诱导和植株再生[ J] .植物生理学通
讯 ,1990, 26(1):50-51.
[ 2] 徐艳,石雷 ,刘燕 ,等.砷超富集植物———蜈蚣草孢子的无菌培养[ J] .
植物生理学通讯, 2004 ,40(6):713-716.
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