全 文 ：　文章编号:1007-4961(2010)02-0162-07
响应面法优化山杏仁蛋白提取工艺研究
顾　欣 ,李　莉 ,侯雅坤 ,崔　杰 , 王建中
(北京林业大学生物科学技术学院 ,北京　100083)
摘要:用单因素和响应面分析法确定山杏仁蛋白的提取工艺 , 首先通过单因素试验选取影响因素与水平 ,然后
在单因素试验的基础上采用四因素三水平的响应面分析法 ,依据回归分析确定较优提取工艺条件。试验结果
表明:山杏仁蛋白的等电点为 4.1;其较优工艺条件为:pH 9.0 ,液料比为 14 mL g , 提取温度 37℃, 提取时间 60
min。采用该工艺条件 ,山杏仁蛋白的提取率达到 92.35%。
关键词:山杏蛋白;提取;工艺优化;响应面分析
中图分类号:S 662.2　　　　　　文献标志码:A
Optimization on extraction of protein from apricot
(Armeniaca sibirica)kernel via response surface analysis
GU Xin ,LI Li , HOU Ya-kun , CUI Jie ,WANG Jian-zhong
(College of Biological Sciences and Biotechnology , Beijing Forestry University , Beijing 100083 , China)
Abstract:The optimum extraction of apricot(Armeniaca sibirica)kernel protein were determined with the single factor and
the RSA response surface analysis.First , the affecting factor and the level by single factor experiment were selected , then
the optimum extraction process condition was determined based on the regression analysis on the basis of single factor experi-
ment using a 4- factor , 3- level response surface methodology.The results showed that the optimum extraction condition of
apricot(Armeniaca sibirica)kernel protein were:the isoelectric point(pI)of AKP was at pH 4.1;pH was 9.0 , liquid-solid
ratio was 14 mL g , extraction temperature was 37℃ and extraction time was 60min.Under these optimum extraction condi-
tion , the extraction rate of the protein reached 92.35%.
Key words:apricot(Armeniaca sibirica.)kernel protein;extraction;technology optimization;response surface analysis
收稿日期:2010-04-18;修改稿收期:2010-05-12
基金项目:2009年国家科学技术推广项目“华北地区核桃泞加工与产品升级示范(2009716号)”资助。
作者简介:顾　欣(1983-),女 ,在读硕士研究生 ,主要从事油脂与蛋白质工程学等研究。
通讯作者:王建中(1952-),教授 ,博士生导师 ,主要从事植物资源利用等研究。
　　山杏(Armeniaca sibirica)为蔷薇科杏属植物 ,主
要分布在我国黑龙江 、吉林 、辽宁 、内蒙古 、甘肃 、河
北 、山西等省区 ,俄罗斯的西伯利亚 ,蒙古东部 、东南
部也有分布[ 1] 。山杏的种子俗称苦杏仁 ,营养丰富 ,
特别富含蛋白质 、脂肪 、矿物质和维生素 ,其蛋白质
含量 、氨基酸总量 、必需氨基酸总量在比较几种种仁
(苦杏仁 、核桃仁 、榛子仁 、元宝枫种仁和巴旦杏仁)
中含量较高[ 2] ,有很高的经济价值和药用价值 。山
杏仁蛋白具有抗肿瘤 、降血压 、降血糖 、降胆固醇等
功效[ 3-4] ,但是在国内外利用山杏仁蛋白的研究报
道不多 ,并且山杏仁仅用于榨油 ,大部分加工山杏仁
油的地区将加工剩余的山杏仁粕丢弃[ 5] ,一部分地
区仅作为动物饲料的蛋白源 ,山杏仁蛋白的功能性
并没有得到充分的挖掘和利用。
刘宁[ 6] 、李艳[ 7] 等对杏仁蛋白提取工艺进行了
研究 ,但研究对象均不是山杏仁。本研究在单因素
实验的基础上 ,选取液料比 、pH 、提取温度 、提取时
间等对蛋白质提取率影响显著的因子进行响应面优
化设计 ,旨在为山杏仁蛋白的高效提取和利用提供
工艺技术支撑。
1　材料与方法
1.1　试验材料
脱脂山杏仁粕:露露集团提供(微量凯氏定氮仪
测得其粗蛋白含量为 41.60%);所用试剂均为分析
纯 。
第25卷 第2期 河　北　林　果　研　究 Vol.25 No.2
2 0 1 0年 6月 HEBEI JOURNAL OF FORESTRY AND ORCHARD RESEARCH Jun.2010
1.2　主要仪器
HHS4型恒温水浴锅:上海浦东跃新科学仪器
厂;752紫外可见分光光度计:上海光谱仪器有限公
司;台式离心机:上海安亭科学仪器厂;PHS-25型
pH计:上海精密科学仪器有限公司;JB-1A型磁力
搅拌器:上海精密科学仪器有限公司;冷冻干燥机
FD-1:北京德天佑科技发展有限公司。
1.3　试验方法
1.3.1　试样的制备　将脱脂山杏仁粕于 40℃烘
干 ,BL-05粉碎机粉碎 ,80目过筛 ,存于室内阴凉干
燥处 。
1.3.2　山杏仁蛋白提取工艺　采用碱提酸沉法 ,
准确称取山杏仁粕粉 ,按比例加入去离子水 ,以 50
r min搅拌浸提液 ,用1 mol L NaOH 调节 pH ,在设定
的温度下提取山杏仁蛋白 。浸提液4 000 r min离心
20 min ,取上清液 ,用1 mol L HCl调节pH至等电点 ,
在5 000 r min下离心 15 min ,取沉淀 ,用去离子水洗
一次 ,调 pH值至中性 ,冷冻干燥。
1.3.3　可溶性蛋白含量的测定　采用考马斯亮蓝
法测定 ,计算公式如下:
Y =M1
M2
×100%
式中:Y —蛋白提取率 , %;M1 —上清液中可溶性蛋
白质量 , g;M2 —山杏仁粕中蛋白含量 , g 。
1.3.4　可溶性蛋白提取的单因素试验　分别以不
同的提取温度 、时间 、pH及液料比为单因素 ,考察各
因素对可溶性蛋白提取率的影响。
1.3.5　山杏仁蛋白提取工艺的设计试验　在单因
素试验的基础上 ,运用 design-expert7.1软件程序 ,根
据 Box-Behnken中心组合实验设计原理[ 8] ,采用四因
素三水平的响应面分析法 ,以山杏仁可溶性蛋白的
提取率为响应值 ,通过响应曲面分析(response sur-
face analysis , RSA)对提取条件进行优化。
2　结果与分析
2.1　标准曲线的测定
将牛血清蛋白稀释至不同浓度 ,采用 Bradford
法 ,用紫外分光光度计在 595 nm 处测定其吸光度 ,
绘图制得的标准曲线见图 1。
2.2　山杏仁蛋白等电点的测定
取一定量脱脂山杏仁粉按液料比 13 mL g加入
去离子水 ,用 1 mol L NaOH 调 pH 至 9.0 ,室温搅拌
1 h后 ,在4 000 r min下离心 20 min ,取等量上清液 ,
分别调 pH至 3.42 、4.06 、4.56 、5.05 、5.36 ,使蛋白沉
图 1　蛋白标准曲线
Fig.1　Bio-rad protein assay
淀 , 在5 000 r min下离心 15 min后 ,用Bradford法分
别测定沉淀后上清液中蛋白质含量 ,上清液蛋白残
留率最低时的 pH 即为蛋白的等电点[ 6] 。由图 2可
见 ,山杏蛋白残留率在 pH 4.1时最低。因此 ,山杏
仁蛋白的等电点为 pH 4.1。
图2　蛋白等电点测定
Fig.2　The isoelectric point assay
2.3　单因素试验结果
2.3.1　提取温度对山杏仁蛋白提取率的影响　在
保持其他条件不变(提取时间为 60 min 、pH为 9.0 、
液料比为 13 mL g),改变提取温度 ,山杏仁蛋白提取
率随温度的变化如图 3所示 。从图 3可以看出 ,提
取温度超过 35℃时 ,随着温度的升高提取率降低的
较显著。随着温度的升高 ,山杏仁蛋白的氮溶解指
数变低 ,温度过高 ,会使浸提液的粘度增加 ,使溶出
困难[ 9] ,从而影响山杏仁蛋白的提取率。因此 ,山杏
仁蛋白最佳提取温度应控制在 35℃左右。
2.3.2　提取时间对山杏仁蛋白提取率的影响　在
保持其他条件不变(提取温度为 40℃、pH为 9.0 、液
163　第 2期　　　　　　　　顾　欣等:响应面法优化山杏仁蛋白提取工艺研究　　　　　　　　　　
图 3　提取温度对提取率的影响
ig.3　Effect of extracting temperature on the extracting rate
料比为 13 mL g),改变提取时间 ,山杏仁蛋白提取率
随时间的变化如图 4所示。从图 4 可以看出 ,提取
率于 60 min时到达最高点。一定条件下 ,浸提时间
越长 ,山杏仁蛋白质的溶出率越高 ,但是超过 60 min
溶出率则不再提高而是呈减少趋势 ,可能由于蛋白
质分子溶胀饱和导致可溶性蛋白溶出率降低 。因
此 ,山杏仁蛋白的最佳提取时间应控制在 60 min 左
右。
图 4　时间对提取率的影响
Fig.4　Effect of extracting time on the extracting rate
2.3.3　pH 对山杏仁蛋白提取率的影响　pH 对山
杏仁蛋白提取率的影响见图 5 ,从图可以看出 ,保持
其他条件不变(提取温度为 40℃、时间为 60 min 、液
料比为 13 mL g),pH为 8.5时山杏仁蛋白的提取率
最高 ,pH>9.0 时提取率几乎不变 。由于碱性太强
会引起“胱赖”反应 ,把氨基酸转变为有毒化合物 ,因
此浸提的 pH 控制在 8.5左右为佳。
2.3.4　液料比对山杏仁蛋白提取率的影响　在一
定的条件下 ,加水量多 ,有利于蛋白质的溶解 ,液料
比达到一定程度 ,蛋白的溶出率达到了动态平衡 ,若
加水量过多 ,料液浓度就低 ,母液的体积大 ,不仅增
图 5　pH 对提取率的影响
Fig.5　Effect of pH on the extracting rate
加了水的消耗 ,而且增加了后续工作的难度和物料
消耗。从图 6可以看出 ,保持其他条件不变(提取温
度为40℃、时间为 60 min 、pH 为 9.0),液料比为 13
mL g时山杏仁蛋白的提取率最高。因此 ,选取液料
比为13 mL g左右为佳。
图 6　液料比对提取率的影响
ig.6　Effect of water to material ratio on the extracting rate
2.4　响应面分析法对山杏仁蛋白提取工艺的优化
2.4.1　响应面分析因素水平的选取　根据 Box-Be-
hnken中心组合实验设计原理 ,以 X 1(温度)、X2(时
间)、X 3(pH)、X4(液料比)为自变量 ,以山杏仁蛋白
的提取率为响应值 ,设计四因素三水平的响应面分
析试验 。试验的因素和水平的取值见表 1。
表 1　响应面分析因素与水平
Table 1　Analytical factors and levels for RSA
因素水平
Factor level
温度 ℃
Temperature
时间 min
Time
pH
液料比 (mL·g-1)
Liquid-solid ratio
-1
0
1
30
35
40
45
60
90
8.0
8.5
9.0
12
13
14
2.4.2　响应面模型的建立及结果　响应面分析的
试验结果见表2。
164　　　　　　　　　　　　　　　　　河　北　林　果　研　究　　　　　　　　　　　　　　第 25卷
表 2　响应面分析的试验结果
Table 2　Program and experimental results of RSA
试验序号
Experiment number
X1 X2 X3 X4
提取率 %
Extracting rate
试验序号
Experiment number
X1 X2 X 3 X 4
提取率 %
Ext racting rate
1 0 1 0 1 43.86
2 -1 -1 0 0 54.32
3 0 0 1 1 92.91
4 1 0 0 1 74.52
5 0 -1 0 -1 40.74
6 0 1 0 -1 60.02
7 0 1 -1 0 80.25
8 1 0 -1 0 76.62
9 0 -1 -1 0 45.64
10 -1 0 0 -1 43.13
11 0 0 0 0 75.72
12 1 -1 0 0 55.26
13 -1 0 1 0 66.26
14 0 -1 1 0 79.19
15 0 0 -1 -1 68.28
16 1 0 1 0 82.04
17 -1 0 0 1 48.47
18 0 0 1 -1 52.95
19 -1 1 0 0 43.11
20 1 1 0 0 79.67
21 -1 0 -1 0 41.88
22 0 0 0 0 75.21
23 0 0 -1 1 50.34
24 0 0 0 0 76.12
25 1 0 0 -1 51.37
26 0 -1 0 1 43.48
27 0 1 1 0 78.92
　　采用 design-expert7.1软件程序对试验数据进
行回归分析 ,得出山杏仁蛋白提取率的回归方程如
下:Y =75.68 +10.19X 1 +5.60X 2 +7.44X3 +
3.09X 4+8.90X 1X2 - 4.74X 1X 3 + 4.45X1X 4 -
8.72X 2X 3 -4.72X2 X4 +14.47X 3X4 -8.81X1 2 -
10.34X22+3.52X 3 2-14.63X4 2
其决定系数 R2=0.922 7 ,说明回归方程适用于
提取山杏仁蛋白的理论预测值。
对回归方程做显著性检验与方差分析 ,结果见
表 3。
表 3　二次响应面回归模型方差分析
Table 3　ANOVA for response surface quadratic model analysis of variance table
方差来源 自由度 DF 平方和 SS 均方 MS F值 Pr>F 显著性
Variance source Degree of freedom Sum of squares Mean square F value Pr>F Signifi cance
X 1 1 1 246.64 1 246.64 28.86 0.000 2 ＊＊
X 2 1 376.32 376.32 8.71 0.012 1 ＊
X 3 1 663.95 663.95 15.37 0.002 0 ＊＊
X 4 1 114.64 114.64 2.65 0.129 2
X1X2 1 317.20 317.20 7.34 0.019 0 ＊
X1X3 1 89.87 89.87 2.08 0.174 8
X1X4 1 79.30 79.30 1.84 0.200 4
X2X3 1 304.15 304.15 7.04 0.021 0 ＊
X2X4 1 89.30 89.30 2.07 0.176 0
X3X4 1 838.10 838.10 19.40 0.000 9 ＊＊
X 21 1 414.11 414.11 9.59 0.009 3 ＊＊
X 22 1 569.71 569.71 13.19 0.003 4 ＊＊
X 23 1 65.97 65.97 1.53 0.240 1
X 24 1 1 142.18 1 142.18 26.44 0.000 2 ＊＊
总回归 14 6188.21 441.87 10.23 0.000 1 ＊＊
总残差 12 518.29 43.19
总离差 26 6704.50
失拟差 10 517.87 51.79 248.94 0.004 0
注:＊代表 5%显著水平 , ＊＊代表 1%显著水平。
165　第 2期　　　　　　　　顾　欣等:响应面法优化山杏仁蛋白提取工艺研究　　　　　　　　　　
　　从方差分析结果可知 ,模型在 P ≤0.01时水平
差异显著 ,因变量与所有自变量之间的线性关系显
著(R2=0.922 7),说明该模型能够较好地描述试验
结果 ,回归方程的一次项 、二次项都显著 ,说明响应
值的变化相当复杂 ,试验因子对响应值的影响不是
简单的线性关系;失拟项 F 值很小 ,说明方程对试
验的拟合情况好 ,试验误差小。通过对 Y 的回归系
数的检验可知 ,各因素对山杏仁蛋白提取率影响的
大小顺序为:液料比(X 4)>提取时间(X 2)>提取温
度(X 1)>pH(X3)。
2.4.3　响应面与等高线　根据回归方程 ,作出响
应面和等高线图 ,考察拟合响应曲面的形状 ,分析液
料比 、pH 、提取温度和提取时间对山杏仁蛋白提取
率的影响 ,如图 7 ～ 12所示 。等高线的形状可以反
映出交互相的强弱 ,椭圆形表示两因素交互作用显
著 ,而圆形则与之相反[ 10] 。比较图 7 ～ 12可知 ,液
料比(X4)对山杏蛋白提取率的影响最为显著;而提
取温度(X 1)、提取时间(X2)、pH(X 3)次之 。
图 7　Y=f(X1 , X2)的响应面与等高线
Fig.1　Responsive surfaces and contours of Y=f(X1 , X2)
图 8　Y=f(X1 , X3)的响应面与等高线
Fig.8　Responsive surfaces and contours of Y=f(X1 , X3)
2.4.4　提取工艺条件的确定　为进一步确定最佳
点 ,利用 design-expert7.1软件程序对工艺条件进行
优化 ,可得山杏仁蛋白提取率的最佳方案为:提取温
度为 37.09℃,提取时间为 58.11 min , pH 为 9.0 ,液
料比为13.68 mL g ,在此工艺条件下 ,软件程序对山
杏仁蛋白提取率的预测值为 93.98%。为了实际的
操作方便 ,将山杏仁蛋白的提取工艺参数修正为:提
取温度为 37℃,提取时间为 60 min , pH 为 9.0 ,液料
比为 14 mL g 。在此条件下实际测得的平均提取率
为 92.35%,与理论预测值相比相对误差在 1.64%
左右。因此采用修正后的方法得到的提取参数准确
可靠 ,具有实用价值。
166　　　　　　　　　　　　　　　　　河　北　林　果　研　究　　　　　　　　　　　　　　第 25卷
图 9　Y=f(X1 , X4)的响应面与等高线
Fig.9　Responsive surfaces and contours of Y=f(X1 , X4)
图 10　Y=f(X2 , X3)的响应面与等高线
Fig.10　Responsive surfaces and contours of Y=f(X2 , X3)
图 11　Y=f(X2 , X4)的响应面与等高线
Fig.11　Responsive surfaces and contours of Y=f(X2 , X4)
167　第 2期　　　　　　　　顾　欣等:响应面法优化山杏仁蛋白提取工艺研究　　　　　　　　　　
图 12　Y=f(X3 , X4)的响应面与等高线
Fig.12　Responsive surfaces and contours of Y=f(X3 , X4)
3　结论
利用响应面法对山杏仁蛋白的提取工艺进行了
优化 ,得到碱溶酸沉法提取山杏仁蛋白的最佳工艺
条件为碱溶 pH 9.0 ,液料比为 14 mL g ,提取温度
37℃,提取时间 60 min。在最佳工艺条件下 ,山杏仁
蛋白提取率可达 92.35%。在山杏仁蛋白等电点 pH
4.1进行酸沉 ,将沉淀水洗至中性并冷冻干燥 ,得到
的山杏仁蛋白中粗蛋白质量分数为 89.93%。说明
响应面优化后的碱提酸沉法提取山杏仁蛋白不仅大
大缩短了提取时间 ,而且提高了有效成分的提取得
率 ,节约了物料和溶剂 ,提高了经济效益 ,该方法是
一种极具应用前景的工艺 。
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(编辑　郭丽娟)
168　　　　　　　　　　　　　　　　　河　北　林　果　研　究　　　　　　　　　　　　　　第 25卷