全 文 ：吉林农业大学学报 2以刀 , 29 (4) : 378 一 380 , 383
扣阴耐 of 拟认电伦泌毋以 以丽浇几勿 娜
:
/ 珊阮功 .加 .汕 . cn
-E ma 以沙以劝@呻 . 5初 .二
鲜马鹿茸不同部位多肤的提取及含t 比较
郝林琳’ , 刘松财’ , 张明军’ , 程淑琴2 , 吕铁钢’ , 张永亮’ , ’ “
( 1
. 吉林大学畜枚菩医学院 , 长春 13() 肠2 ; 2 .承德职业学院 , 承德 肠 7X( X) ; 3 . 华南农业大学动
物科学学院 ,广州 5一俐 2 )
摘 要 : 采用醋映溶液和乙醉提取 了 6支鲜二杠马鹿茸的主干顶部 (未骨化部分 ) 、中部 (部分骨化 ) 、 根部 (大
部分骨化 ) 3个部位的多肤 ,进行了多肤的 S璐 一 PAG E分析和胶岛素样生长因子 一 1( IGF 一 1) 、表皮生长因子
( EGF )
、 神经生长因子 (NGF )的 w 时e m , u诫吨分析 。 采用考马斯亮蓝 G 一 250 法进行了马鹿茸不同部位总多
肤定 t , R】A 法测定了 IGF 一 l 含 t , 曰 J SA 法比较了不同部位 EGF 、 NG F 的 OD位 。 结果 : S璐 一 PAG E表明鹿茸
敌醉提取多肤为一系列分子 t 低于 17 kD 的混合物 , w 已山 , 卜从如飞 证明其含有 IGF 一 1、 EGF、 N G F等生长因
子。 定 t 分析表明 : 马鹿茸顶部 、 中部、 根部总多肤、 】C下一 1及醉提多肤中 IGF 一 1含 t 均差异显著 ( P < .0 仿 ) ,
E G F
、
N GF IE J SA检测 OD值差异显著 ( P < 0 .仍 ) ,均从顶部到根部递减 。
关. 词 : 马鹿茸 ; 多肤 ; 胶岛素样生长因子 一 ;l 表皮生长因子 ; 神经生长因子
中圈分类号州找玲36 . 1;6 朋 25 文献标识码 : A 文章幼号 : 1X( X) . 5仗抖 (岌刃7)阵 03 7冬仍
D由仙心o n a n d Q肋哪arL 廿ve 灿回y is of OP 蜘pe itP d es Cb n et n st
of D超er er nt se 争ne n st in eC vr us e勿h us L恤an el 拐
日AO Lin一in l , Llu so n g 一 ca i, , z日胡 G M in g 一 ju n , , e日ENG s h u 一q in Z , LO 丁i任卯 n g , , at a一
1
. 肠陇罗 of A瓜碗心 反~
山以 碗把瓦矛协叮 材耐交诚 , 拟认 以丽浇乃勿 , 以四管从叭 13以拓2 , 以奋协 ;
2
. 日让嗯咙 】左朋名如爪以肠价砂 , O钻昭咙 肠7X( X) , hC俪 ; 3 . 肠陇罗 of A成玩以 反犯似 , 勘川六乙从而
彻咸汉饥汉 以丽佣乃勿 , 翻四卿彻“ 51仪抖2 , 以如以 )
月龙t r日改: We e x tn 蛇edt het ac it ve c咖pe n e snt of d ife er in eS g 既 n st ( otP , 而ddl e & 施is) of 血 肠图h
v e lv e t an d e IS
.网即即石des iw ht aC e t i c ac 记 叨 lu it o n (声 3 . 5) adn al co ho l adn 翻目” 记 场 S口导PAG E adn
W白 t e m b lo t ign 初 ht an it . human
IG F 一 1、 EGF 、 NGF as het if lst an t饭汕 es . 马 e t o alt 州解pit des . l d
IGF
一 1 c o n te n st in 山氏此 n t se 创叱 n st of v e lv e t an d e r
~
de tec 目 初ht Q犯 n明 ie ibr il an t bl ue G 一 25()
朋d RIA etC俪qu es . EG F an d NG F O D v al u es we er c om 四初 杭ht E U IS A . Res ul :st hT e 咄ul st of SDS
一 P AGE in 击以山分 tl l a t 山笼 r v e vl et ax ul e r 训1卿p tides ~ a I l l ix w ho 留 明lec ul ar ~ 场爬 r t卜川
17 kD
, 朋d w 份 te m bl o币 gn er v eal ed ht at IG F 一 1 , EGF an d NGF ~
e x切朗囚衍 ht ac 记朋 d alC d扣】.
伽朋石iat ve 助目 y s is s h o州妇 山对 即1卿p it des an d IG F 一 1 e x忱朗回 袱 ht ac id an d al e o h o l , 助 d IG F 一 l
e xl 叭蛇阁 初 ht ac 记 in d迁er ern t se , 能 n st of vle vet an Uer we 二 d ife 祀 n t is加 if anC u y (尸 < 0 . 05 ) . 仆 e O D
v al u e d汪er花 n e e of EGF an d NGF con ent st 统幻四 e e n 山氏 er n t se , oe snt of ve lv e t an it e r s how记 场 E口认 is
目的 5 1, iif cant ( P
< 0
.
05 )
,
al het da at 花 v eal ed ht at ht e y aer hi 脚 y co n ce n tr at 司 in het otP of vel vet
朋Ue r ( P < 0 . 05 ) . 布: 油 t of 介找刁 an in et n过 卿庙yt in d e x in s u场ec it on u it l油石on of Q侧 e帅腼
l in 几州us .
eyK wo 吻 : v e lv e t an it e r ; 卯】卿p it des ; i sn ul in . 城e 脚hwt fac otr ;1 ien d e m回 脚袖 触 for ; ~脚 w th 丘比ot r
` 全项目 : 国家自然科学基金资助项 目 (加刀仪刀 3 )
作者简介 : 郝林琳 (】鱿月 . ) , 女 , 博士研究生 ,研究方向 :基因工程及蛋白质的分离纯化 。
收稿日期 : 大幻卜 1压刀 修回日期 : 么刀7仍 一29
二 通讯作者
都林琳等 : 鲜马鹿茸不同部位多肤的提取及含 ! 比较 37 ,
鹿茸为鹿科动物梅花鹿 ( 。 、 川月扣几 介 m -
而 cn k) 或马鹿 (。 、 巴娜肠 u阴朋此 )的雄鹿未骨
化密生绒毛的幼角 ,是一种名贵滋补药〔’ J。 鹿茸
由于其生长迅速性长速度为 1 一 Z c川了d )和再生等特点 ,是一个多种类天然的细胞生长因子库 z[] ,
如 IG F 一 1、 EG F 、 N GF 、 TG F (转化生长因子 )等 , 但
传统的鹿茸加工方法多为热加工 ,破坏了鹿茸含
有的活性肤 、 酶类以及细胞因子 。 近年来人们已
开始重视对鹿茸中具有生物活性的多肤 、 蛋白质
即生长因子的研究【’ ] 。 本研究采用低温酸醇提取
的办法获得了鲜马鹿茸的活性物质— 肤类生长因子 ,对鹿茸酸粗提物及醇提物进行了 SD S -
PA GE 和 w 白 tem 一 bl iot gn 分析 ,采用考马斯亮蓝 G
一
25 0法定量多肤含量 , RIA 法测定鹿茸不同部位
酸粗提物 IG F 一 1 及醇提多肤 IG F 一 1 的含量 ,
EUIS A法比较不同部位 EGF 、 NGF 的 O D值。 此研
究结果可为马鹿茸的合理使用提供理论依据 , 为
鹿茸多肤的工业化生产奠定基础 。
抗体 。
1
.
2
.
3 鹿茸不同部位多肤 、 IGF 一 1、 EGF 、 NGF 含
童的比较 采用考马斯亮蓝 G 25 0法进行不同部
位总多肤定量 [肠〕 , R IA法测定马鹿茸不同部位酸
粗提物及醇提多肤中 IGF 一 1含量〔5刊 , EU` A法
比较不同部位 EGF 、 NGF 的 oD 值图 。
,
.
2
.
4 数据处理及统计 采用 51毛污10 . 0软件对
数据进行方差分析 , 巧D 多重 比较 , 结果用平均
值 土标准误 (
~
土 sE )表示 。
2 结 果
1 材料与方法
,
.
1 材料与仪器
本试验所选用的 6支新鲜二杠带血马鹿茸由
本溪天山鹿业新技术有限公司提供 ; IG F一 1放免
试剂盒购自第二军医大学 ;玲 H一 n型高速电动
匀浆器 , 江苏金坛金城国胜实验仪器厂产品 ;高速
冷冻离心机 , 日本 KBU 口TA公司产品 ;预染蛋白标
准 , NE B 产品 ;抗人 IGF 一 1 、 EGF 、 NG F 抗体 ( CY ·
m L AB 公司 ) ;浓缩型 D AB 试剂盒 、辣根酶标记山
羊抗兔够 ,北京中杉产品 。
,
.
2 方法
,
.
2
.
1 鹿茸多肤的分离纯化 马鹿茸多肤粗分
离参照文献【-4 5] 的方法 。 取鲜马鹿茸顶部 (未骨
化部分 ) 、 中部 (部分骨化 )、 根部 (大部分骨化 )各
2 9
,剁成小块 , 用预冷蒸馏水 ( 4 ℃ )冲洗至无血
色。 添加预冷匀浆液 ( p3H . 5 醋酸溶液 )匀浆 , 离
心 ,取上清 , 留展少量提取液备用 (酸粗提物 ) ;其
余 4 ℃醇沉 ,取上清 , 留取少量样品备用 (醉提多
肤 ) ;剩余冻干备用 。
1
.
2
.
2 鹿茸酸提物及醉提多肤的 SDS 一 P AGE 和
w ` t e m 一bilot gn 分析 s sD 一以GE 电泳按文献【6]的方法 , 5% 浓缩胶 , 巧% 分离胶 , 考马斯亮蓝 R 一
250 染色 。 w ` et m 一 b lo t吨 鉴定参照文献【6」操
作 ,分别用抗人 IG F 一 1 、 EG F 、 NGF 抗体作为识别
2
.
1 马鹿茸多肚的 S DS 一 尸AG E 和 W es et m ·
bI Ot ign 分析
由图 1可见 , SD6 一 P AGE 分析表明马鹿茸酸
粗提物为分子量不等的各种蛋白质 、多肤的混合
物 , 而醇提物只存在 17 kD 以下的一些多肤 。 从
SsD
一 P AG E条带的深浅来看 , 乙醇提取过程中 ,
鹿茸多肤的含量有一定损失 ,但损失不大。 IG F -
I W` t e m七扬` 飞 在酸粗提物被检样品中于分子
量 150 kD 和 7 . s kD 处均有特异杂交带出现 , 且
150 切处杂交带明显亮于 7 . 5 kD处 ,醇提多肤只
在 7 . s kD 处出现了特异杂交带 。 醉提多肤中
EGF
、
NG F 的 w ` et m 一bl o tit 飞 分别在分子量6 . s kD
和 10 kD 附近出现了特异杂交带 。
1
.蛋 白标准 卜叹 e in 目 . 目坛d ; 2 . 醉提多肤 川`过幻 l 。 巾曲0t 司
闷甲户如 ; 3 . 酸粗提物 凡山即石. 袱ht ac ;id 4 . 醉提多肚
】C万一 1 川co 肠 1 . 比门 tC司 IGF 一 1 ; 5 .酸粗提物 IGF 一 1 cA id ex -
切目目 IGF 一 1 ; 6 .醉提多肤 N GF IA司目 . 由两d 司 NGF ; 7 .醉
提多胶 EG F 川司阎 。加 . 囚 EGF
圈 1 马鹿茸多肚的 W跳阳 n } 以以价习圈
内 . 1 . W睡阳价以喊加习 比心叫九湘甲湘 口 C日” 岛
日妇口加巧 nU .龙阳目S 沐匆阵材廿拍
吉林农业大学学报 oJ 明汉 of 拟认 彻成诚初树 玩自. 勿
吉林农业大学学报 2( X刀年 8 月
鹿茸不同部位吸粗提物 IG F 一 1 及醉提总
多肚 、 IG F 一 1 含一的比较
由表 1 可见 , 马鹿茸主干顶部 、 中部 、 根部 3
0
.
0一) 、 284
.
83% ( 尸 < 0 . 0 1 ) , 中部 比根部高
168
.
93 % ( P < 0
.
01 ) ;经醇提后 ,大分子蛋白质 ,包
括与结合蛋白结合形式存在的部分 IG F 一 1等被
沉淀 ,故测得的为多肤中游离 IG F 一 1的含量 。 各
部位之间 IGF 一 1含量差异显著 ,其中顶部 ICF 一 1
含量分别比中部和根部高 42 . 3 % ( p < 0 . 05 ) 、
1科 .供% ( P < 0 . 01 ) , 中部比根部高 85 .狱 % (尸 <
0
.
05 )
。
80.232
个部位 ,经酸醇提取后 ,各部位之间总多肤含量差
异显著 ,其中顶部总多肤含量分别比中部和根部
高 71 . 1% ( P < 0 . 05 ) 、 1以 . 3% ( P < 0 . 05 ) ;各部位
之间酸粗提物中 IG F 一 1含量差异显著 ,其中顶部
IGF
一 1含量分别比中部和根部高 43 . 10 % ( P <
衰 , 马启聋各部位吸粗提物 GI F一 ,及醉握总多肚、 GI F一 1含 , 比较
.介由相 1 . 众翔阵内闭 讨冈卯喇廿洲 田侧 IG F一 1以拍 ten et 如喇怕旧以 跳口而知怕 ot G. 讥 . 幽户月 L如 . a .
李目
1加口
马鹿茸部位 “ 压爪斌 倪 . 口 . .
顶部帅
州 IGF 一 1酸粗提物 ) (/ gn
·
g
一 ’
)
Q时曰之成 IC下一 l( in侧如川 . 杭 ht ac 记 27
.
6 1士 1
.砚 ^
中部 瑙 d』 e
19
.扮 士 2 . 3沪
根部 日. .
7
.
17土 0 .种 c
斌 IGF 一 醉提多肚 ) (/ 伟 · g一 l)
O” t印 t J IGF 一 l( in 倒比面 . 衍山 ac id . 日 目司闷 ) 刀 9
.
71 土 1仍 .叨抽 又 7 .即 士 4 .以 ` 湘 5 . 30 大解 . 84 `
注 : 纵列标有不同小写字母表示差异显着 ( P < 0 .佑 ) ,不同大写宇母表示差异极显著 ( P < 0 . 01 )
Nd 比: 肠任, 如 . 回 11d 加 . 公. 翻妇 in 此 伪山山此 加山份妞阮 d i瓜 . 仿 , 如山曲企 at .o 仍 】峨妇 , 动川 e d进扮. t l网`回 】d 加 n i司i侧吐e 阮
击石 , . . . 目护苗。 . . 吐 .0 01 lve山
2
.
3 马鹿茸不同部位醉提多肚中 E G F、 NG F含 供了新思路。
, 的 EU弘 比较 胰岛素样生长因子 1( 1G F一 l) 是胰岛素样生
由表 2 可见 , 鹿茸顶部 、 中部 、 根部 EG F 、 卜
N GF E口认 检测 o 值差异显著 ,从顶部到根部递
减 ( P < 0 .仍 ) 。
衰 2 马鹿茸醉提多肚中GE F j 怕 F 的 UE SA 比较
T比触 2 . Q瀚阵目溯 份 GE F曰记 r怕「伪咖的怕 如 d祝日 . 附
鱿口附的怕 d C日认月 幽户月 口. 怕自月 洲防 EUSA
项目 只典苹部位
~ ~腼 顶部肺 中部 捕d己e 根部脚。
OD (EGF) 2
.
34 全 0
.仍 ^ 0 . 8 土 0 . 16k 0 .弱 士 0 . 1户
OD (NGF ) 0
.
7 1土 0 . 49’ 0 . 4 全 0 . 1护 0 . 25 土 0 .仍 `
3 讨 论
鹿茸传统的加工方法是热加工 ,其缺点之一
就是加热过程中破坏了鹿茸中的不耐热的活性
肤 、 酶类以及细胞因子 。 目前多数对鹿茸的化学 、
药理研究的报告中所用的鹿茸均为热加工饮片提
取物 , 因此大部分不耐热的活性成分被忽略 ,代表
鹿茸药理及临床效果的主要成分依然不清。 因
此 ,有效提取鹿茸中的蛋白质及多肤成为解决上
述问题的途径 。 本试验采用低温酸醇提取方法获
得了鲜马鹿茸活性多肤 ,操作简便易行 ,条件容易
控制 ,为鹿茸深加工及鹿茸多肤的工业化生产提
长因子家族中的活性最强的成员 , 具有非常广泛
的生物学活性 , su it e 等 8[] 曾报道 , 在鹿茸顶部非
骨化部位存在大量的 IG F及受体 , 是软骨生长的
调节因子 。 江润祥 9j[ 等在梅花鹿和马鹿鹿茸的表
皮层组织中分离出表皮生长因子 ,提出鹿茸表皮
再生及上皮细胞增生作用可能与 EGF 的刺激有
关 。 每年鹿茸的再生 ,除骨组织外 ,一些支持组织
如神经也会再生 。 C毗认 等 [’ 0] 用半定 t RT -
此 R检测了在鹿茸顶部不同组织中 NT 一 3( Neu ·
m加 p h in 一 3) 耐州A 的相对表达 ,能刺激神经纤维
的生长 , 诱导分化期细胞形态发生变化及影响
代 一 12 细胞的 ND A合成 。 本试验经 W比 et m . blo t-
血 g证明鹿茸中存在 IG F 一 1、 EGF 、 N GF 等生长因
子 ,定量分析表明马鹿茸顶部 、 中部 、根部各部位
之间总多肤 J GF 一 1 、 EGF 、 NG F 含量差异显著
( p < 0
.
05 )
,从根部到顶部递增 ,此结果与鹿茸的
生长规律分不开 。 马鹿茸的生长点在其顶部 , 从
其生长发育角度来看 , 鹿茸的生长与骨化相伴行 ,
骨化程度越高 ,矿物质含量就越高 ,有机成分比例
就相应下降〔” 〕。 从每支鹿茸的纵切面外观上可
以清楚看到 ,从茸根部到顶部骨化程度逐渐减小 。
对鹿茸不同部位的分析研究有助 (下转第 383 页 )
oJ un
.川 of 拟认 月脚汕少以 以丽浇” 匆 2仪刀 , A绍. `
张少斌等 : 螺旋藻藻胆蛋白不同提取方法的比较 38 3
藻蓝蛋白 , 都是以反复冻融法提取时纯度最高。
反复冻融法的最大缺点是需要时间较长 , 而且需
要冷冻设备 , 比较适合于在实验室进行小规模实
验 ,但在生产上应用成本较高 ;超声波法虽然有处
理时间短 、 藻胆蛋白提取量大等优点 ,但由于叶绿
素等色素被大量提取出来 ,造成藻胆蛋白纯度低 ,
给后续的纯化过程带来困难 , 在生产上用于破碎
细胞 , 而不用于进一步纯化藻胆蛋白时较为适合 ;
相对于其他 2 种方法 ,溶胀法不需要特殊的设备 ,
提取藻胆蛋白的纯度和处理时间也界于上述 2 种
方法之间 ,虽然提取的藻胆蛋白含量略低 ,但可通
过扩大纯化规模进行弥补 , 因此是一种具有广阔
应用前景的藻胆蛋白提取方法 。 在实际应用上常
常是冻融法和超声波法 、 溶胀法和冻融法等多种
方法结合使用 ,这样的提取效果会更好。
.076.543210
ǎō日,,日í`a飞
圈 3 C a C贬溶胀法提取燕胆蛋白
内 . 3 . 阳 p xet la d曰 by 栩 厅旧卜团 时 Ca C贬州山卜
麒阳朋阅目
衰 1 蕊胆班白不同提取方法的比较
下吐触 , . 白 ,脚牙加 1 of d州陌er 川 厅旧巾以妇 ot Xet la d帅 尸日p
提取方法 处理时间 /
燕胆蛋白含 t /
燕蓝蛋白 别藻蓝蛋白纯度 纯度
且由侧无飞
n州 1曰
山 (叱· mL 一 l) 人动 /鲡 ).篇篇 . 黔 馏忠`一 嗬 . A夔妙加址 . t . 呀 . ` , . 份 .砰 m寸 p j n yt
(人. /
A娜 )
汕呐界介
参考文献 :
反复冻蔽法
R-e 6~
, 位抽” 1
.闷创】6 0 .砧 2 9 0 .洲万 7
[ l ]
[2〕
超声波法
切饰以丽 c 洲油司
Q口 2溶胀法
伪口 2
反山阎 e . p 助曰闭
0
.如7 9 0 . 1 12 9 0 .伪7 9
加 . 0 0 .酬 6 6 0 .洲 5 8 0 . 12 1 4
由表 1 可知 , 3 种处理方法各有利弊 。 从处
理时间上看 , 以超声波法需要的时间最短 ;从提取
的藻胆蛋白含量上看 , 以反复冻融法提取时含量
最高 ;从蛋白质纯度上看 , 无论是藻蓝蛋白还是别
[4〕
[5 ]
杨立红 ,邹宁 , 孙东红 ,等 . 鱼腥燕燕蓝蛋白的提取【J] . 食
品与发醉工业 , 么笼巧 , 31 ( 2) : 135 一 138 .
曾获杰 ,林启山 ,蒋丽金 . 红旅坛紫菜中 -R 燕蓝蛋白的分离
和特性【J〕. 生物化学与生物物理学报 , 1兜 , 24 ( 6) : 54 -
5 1
.
王仲孚 , 赵谋名 ,彭志英 , 等 . 燕胆蛋白研究【J] . 生命的化
学渭洲刃 ,加(2) :刀刀5 .
郑江 . 藻胆蛋白的提取纯化研究进展〔J〕. 食品科学渭刃 2 ,
刀 ( 11 ) : 159 一16 1 .
张少斌 ,燕安 ,刘慈 ,等 . 声值对螺旋燕突变株 ( -SP 压 )生长
及燕胆蛋白含 t 的影响〔J〕 . 安徽农业科学 , 么又巧 , 33 ( 8 ) :
!肠 2. 156 3 .
(上接第 380 页 )
于进一步探明鹿茸的某些疗效及机理 , 以便根据
不同需要选择不同部位 , 将其加工成各种用途的
药品或滋补品 。 本试验证明 , 鹿茸不同部位的多
肤及生长因子含量差异显著 , 可作为评判鹿茸片
质量的内在指标之一 。
今考文献 :
李时珍 . 本草纲目 (校点本 )【M〕. 北京 : 人民出版社 , 1982 :
2别吞2 8 53 , 28肠 .
王秋玉 . 论鹿茸生长因子【J〕. 中医药学报渭】刃 ( 6) : 1压 12 .
郝林琳 ,刘松财 , 夏青娟 , 等 . 鹿茸多肤的生物学活性研究
【J] . 吉林农业大学学报 , Z lx万 , 28 ( 3 ) : 285 . 28 8 .
王丰 ,梅子青 , 周秋丽 , 等 . 鹿茸多肤的分离纯化及药理活
性【J] . 吉林大学学报 :理学版浏刀3 , 41 ( l) : 1 卜 1 14 .
【5〕 郝林琳 ,刘松财 ,任晓蔽 ,等 . 马鹿茸不同部位 IGF 一 1 含 t
的比较分析〔J] . 经济动物学报 J 班巧 , 9( 4) :加1一如 .
【6」 萨姆布奋克 J , 拉塞尔 D w . 分子克隆实脸指南【M」. 3 版 .
北京 :科学出版杜渗刃2: 171 3一17汤 , 17力卜 l伪 .
【7〕 奥斯伯 F , 布伦特 R ,金斯顿 R E , 等 . 精编分子生物学实
脸指南【M〕. 北京 : 中国科学出版社 , 1姗 : 123 一 l公 ,川一25 1 .
8[ 1 5叨厅IE J M . h 刘加 . ilke 脚wd l . d or (I lG -F )I 即 d. 侧湘川川 -
`叼巨斌姗 [J ] . 】曰d 犯山d 呵 , l哪 , 1 16 ( 2 ) : 创吞 ,阳 .
【g J 江润祥 , 高锦明 , 叶大同 . 鹿茸表皮生长因子【J〕. 动物学
报 , l佣7 , 3 ( 4) : 30 卜引月 .
〔10 」 C ARC IA L R L . 公脚幽 .` ` 舔 3 in hat , 洲 11唱耐袱 adn er `
hat m阳 er
~
日咖训【J」. J撇 D问匕州加 l , l期 , 19 ( 2 ) :
173
一
1脸 .
【川 高志光 . 梅花鹿鹿茸生长与骨化关系的研究【J] . 特产研
究 , 19卯 ( 3 ) : 5 1· 5 3 .
ù .J工工
!
1lJ es
l几`,J4
r.L工es户e工.
吉林农业大学学报 oJ 明d of 拟认 彻愉诚初耐 玩自的勿