全 文 ：电子顺磁共振技术研究一枝蒿总黄酮抗氧化作用＊
阿不都热依木　斯拉甫　哈木拉提
(新疆维吾尔医学研究所 ,乌鲁木齐　830001)
2001-05-17收稿 , 2001-08-09修回
＊国家科技部生命科学技术发展中心基金(99-929-02-15)和国家自
然科学研究基金(30060089)联合资助
作者简介:阿不都热依木 ,男 , 30 ,硕士 ,主要从事自由基医学和维吾
尔 药药 理 学 研 究。 T el:0991-2562589 , Fax:0991-
2565663;E-mail:Abdiryim@china.com;
哈木拉提 , 男 , 40岁 , 博士 ,教授, 主要从事中西维医结合
内科临床和基础研究
中国图书分类号 　R-332;R 282.71;R 284.1;R914.4;
R 979.9
文献标识码　A　文章编号　1001-1978(2001)06-0648-03
摘要　目的　探讨一枝蒿总黄酮清除自由基的作用。 方法
　采用电子顺磁共振技术(EPR)分别检测一枝蒿总黄酮对
超氧阴离子自由基(O·2), 羟自由基(·OH)的清除作用。结果
　一枝蒿总黄酮对超氧阴离子自由基 、羟自由基具有不同程
度的清除作用 ,且存在明显的药物浓度—清除效用关系。结
论　一枝蒿总黄酮有明显的抗氧化作用。
关键词　一枝蒿总黄酮;自由基;抗氧化
　　新疆一枝蒿(Artemisia rupest ris L.)是维吾尔
医常用药材 ,临床上常用于感冒 、荨麻疹 、咽炎 、扁桃
体炎 、肝炎等疾病的治疗 ,其中对感冒和肝炎的疗效
更为显著[ 1] 。文献报道一枝蒿全草含有黄酮类 、酮
酸类 、氨基酸 、苷类 、多糖类 、挥发油 、多肽 、生物碱等
化合物 , 其中黄酮类含量为 1.33%, 其次是酮酸
类[ 1] 。我们分析了一枝蒿的黄酮类和酮酸类成分 ,
从中分离出①5 、3′-二羟基-6 , 7 , 8 , 4′-四甲氧基黄
酮;②5-羟基-6 ,7 ,8 ,3′,4′-五甲氧基黄酮;③5 ,3′-二
羟基-6 , 8 , 4′-三甲氧基黄酮等 3种黄酮类化合物及
一枝蒿酮酸 、异一枝蒿酮酸 、一枝蒿酸 、针叶春黄菊
酸等 4种酮酸类化合物 ,在此基础上我们采用电子
顺磁共振方法检测一枝蒿总黄酮对 O·2 、·OH 的清除
作用 ,为阐明该药防治疾病新的科学内涵提供实验
依据 。
1　仪器及试剂
1.1　试剂　5 ,5-二甲基-1-吡咯啉-N-氮化物(DM-
PO)购自美国 Sigma 公司 。二甲基亚砜(DMSO),
化学纯试剂 ,上海硫酸厂产品 。氢氧化钠 ,分析纯试
剂 ,上海试剂三厂产品。NaH2PO4 ,K2HPO4 , H2O2 ,
FeSO4·7H2O , EDTA ,均为国产分析纯试剂。
1.2　仪器　 ER200D-SRC 型电子顺磁共振仪 ,
ER4111-V T 变温装置 ,均为德国 Bruker 公司产品 。
2　实验方法
2.1　样品的制备　一枝蒿总黄酮由中科院新疆分
院化学研究所提供 ,并由中科院上海药物研究所鉴
定 。试验时 ,以 0.1 g·L-1(100%)浓度作为原液 ,
梯度稀释成不同浓度 ,检测 EPR谱。
2.2　对 O·2的清除增抑作用[ 2] 　在室温下 ,将含有
饱和空气的 DMSO 与 H2O 、NaOH 溶液定量混匀。
NaOH一经加入即计时 ,反应 30 min 。测量前 ,定量
吸取反应液于直径 3 mm 的玻璃样品管内 ,在温度
130 K 时进行 EPR测定 ,此时可检测到 O·2 的特征
信号 ,此作为空白对照管 。当检测样品与 O·2 作用
时 ,加入一定量的样品药液(5%～ 100%)于产生 O·2
的模型体系中 ,其它条件同前。
EPR操作参数:测试温度(TE)130 K ,微波频
率(SF)9.67 GHz ,微波功率(SP)20 mW ,调制频率
(MF), 调制幅度(MA)5.0 G , 时间常数(TC)500
ms ,扫场时间(TI)100 s ,中心磁场(CF)3 360 G ,扫
场宽度(SW)300 G 。
2.3　对·OH的清除作用[ 3] 　利用 Fenton 反应产
生·OH 自由基 , 反应体系中 DMPO 终浓度 100
μmol·L-1 , pH 7.4 NaH2PO4/K2HPO4 缓冲液终浓
度 40 mmol·L-1 ,H2O2 终浓度 100 mmol·L-1 ,样品
药液(注:作为标准时则加 100 μl H2O)5%～ 100%,
FeSO4·7H2O +EDTA 混和液终浓度 300 μmol·
L
-1 ,操作时在塑料管依次加入 DMPO , 缓冲液 ,
H2O2 ,药液(或水),最后加 Fe2+引发反应 , 5 min后
进行 EPR测量。
EPR操作参数:SW =100 G , SF =9.82 GHz ,
MF =100 kHz ,MA=0.8 G , TE=297 K 。
2.4　增抑作用的计算　根据所测信号幅度的变化 ,
可计算样品对自由基的增抑情况。定义 E 为样品
与自由基之间的相互作用因子。E的数值可通过下
式计算:
E =(h -h0)/h 0
上式中 h 表示加入样品后 EPR谱中信号强度
·648· 中国药理学通报　Chinese Pharmacological Bulletin　2001 Dec;17(6):648～ 50
的测量平均值 , h 定义为峰与峰间垂直距离 ,即信号
强度。 h0 为空白体系 ESR谱中信号强度的测量平
均值。若所得 E 为正值 ,表明样品对体系中产生的
自由基具有增强能力;E 为负值 ,则表明样品对体
系中产生的自由基具有清除能力。
3　实验结果
根据所测得 EPR波谱信号 ,计算样品与自由基
之间的相互作用因子 E 。根据 E 的变化情况 ,判断
样品各浓度对自由基的增抑作用 。结果见表 1 、图
1。
Tab 1　Scavenging activi ties of artemisia flavonoids to O·2 and ·OH
(Relationship between the concentration and interaction factor E)
Artemisia flavonoids
/ kg·L-1
Interact ion factor E
Superoxide anoin radical Hydroxyl radical
0.10 -0.9999 -0.9889
0.08 -0.9999 -0.9885
0.06 -0.4858 -0.9577
0.04 -0.3053 -0.9020
0.02 0.9655 -0.7327
0.01 0.8963 -0.6659
0.005 0.4825 -0.4855
Fig 1　Relationship between the concentration
and interaction factor E
　　由表 1 、图 1 可见 ,一枝蒿总黄酮对 O·2 的作用
表现为高浓度清除 、低浓度增加的作用 。但对·OH
自由基表现为浓度依赖性地抑制作用 ,浓度(M)与
相互作用因子(E)之间的回归关系为:E=-1.4199
～ -0.1709 lnM (r=0.9887), IC50=4.60 g·L-1 。
4　讨论
黄酮类化合物广泛存在于蔬菜 、水果 、植物 、茶
叶等多种天然产物中 。因它们具有抗过敏 、抗炎 、抗
病毒 、抗心脑血管疾病 、抗癌等多种功效 ,从而引起
科学家们浓厚的兴趣 ,尤其是作为一种有效的天然
抗氧化剂 ,它们清除自由基 、抗氧化 、保护细胞的功
能更受关注[ 4 ～ 5] 。
本文中我们采用 EPR技术研究一枝蒿总黄酮
对 O·2 、·OH 自由基的清除作用 。研究结果表明 ,一
枝蒿总黄酮对 O·2 的作用表现为高浓度清除 ,低浓
度增强的双向作用 ,但低浓度增强作用也不是绝对
的 ,当浓度稀释到 20 g·L-1时表现为很强的增强作
用 ,浓度从 40 g·L-1开始这种增强作用也逐渐降
低 。一枝蒿总黄酮对·OH 自由基的作用始终表现
为浓度依赖性地清除作用 ,而且清除作用很强。文
献报道 ,黄酮类化合物的生物活性主要与其抗氧化
作用有关 ,而且抗氧化作用主要通过结构中的芳香
簇羟基来实现 ,结构中芳香簇羟基的疏水性质 、数目
及位置决定它们的抗氧化功能[ 6～ 9] 。提示一枝蒿
总黄酮抗氧化作用表现以上变化规律也可能与一枝
蒿总黄酮的成分和各单体成分中芳香簇羟基的疏水
性质 、数目及位置密切相关 。因此 ,我们认为一枝蒿
总黄酮的抗氧化功能可能通过以下 3 条途径来实
现:一是通过结构中含有的高活性抗氧化基团芳香
簇羟基来直接消除或修饰攻击性有害物质(如 ,O·2 、
·OH),使之转变成危害小的芳氧自由基的多种消旋
结构 ,以防止自由基链式反应的形成和进一步损害;
二是可能通过清除 、捕捉链延伸自由基反应 ,使之中
断;三是通过蟹合体系中 Fe2+、Cu2+等微量元素 ,阻
止·OH 的产生 ,从而间接发挥其抗氧化作用。
至于一枝蒿总黄酮单体成分的抗氧化作用与其
结构中芳香簇羟基的疏水性 、数目及位置之间的关
系及变化规律尚待我们去探讨。
本实验部分内容的完成得到了复旦大学分析测
试中心顺磁共振实验室陈士明教授 、严小敏教授的
协助 ,在此表示感谢。
参考文献
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　 flavonoids is governed by number and location of their aromatic
·649·中国药理学通报　Chinese Pharmacological Bulletin　2001 Dec;17(6)
金喜素诱导 HL-60细胞凋亡依赖 caspase活化
陈协群　万幼峰　曹云新
(第四军医大学西京医院血液内科 ,西安　710032)
中国图书分类号　R-332;R 329.24;R 329.25;R 73-351;
R 733.71;R 979.1
文献标识码　A　文章编号　1001-1978(2001)06-0650-04
摘要　目的　探讨金喜素诱导急性白血病细胞凋亡的生化
机制。方法　采用 MTT 法测定金喜素对 HL-60 细胞的杀
伤作用;通过形态学 、DNA 凝胶电泳及 Annex in V F ITC 染
色 ,研究金喜素对靶细胞的促凋亡活性;采用 caspase-8、3 特
异性抑制剂 IETD-fmk、DEVD-CHO ,分析金喜素介导的靶细
胞凋亡与 caspase活化的关系。结果　经 0.1 μmol·L-1金喜
素处理至 8 、12 及 16 h 时 , HL-60 细胞的存活率依次降至
62%±12%、、43%±15%及 32%±10%, 低于对照(P <
0.05),同时 , 靶细胞逐渐出现磷脂酰丝氨酸外化 , 并产生梯
状DNA及凋亡小体;经 caspase 抑制剂与金喜素联合处理
12 、16 h 时 ,HL-60细胞的存活率高于单用金喜素组 , 分别为
77%±14%、65%±16%(IETD-fmk 组)与 74%±12%、
60%±11%(DEVD-CHO 组),同时 ,靶细胞的梯状 DNA 与
凋亡小体的诱生也明显受抑。结论　金喜素对 HL-60 细胞
具有较强的促凋亡作用 ,该过程可能依赖 caspase-8 、 caspase-
3 的活化。
关键词　金喜素 ,HL-60 细胞;凋亡;Caspase
2001-05-23收稿 , 2001-07-26修回
作者简介:陈协群 , 男 , 39 岁 ,博士 ,副教授 , 副主任医师 ,硕士生导
师 ,科主任 ,现为中国人民解放军血液学专业委员会副主
任委员。 Tel:029-3375199 , E-mail:xiequnchen@sina.com
　　喜树碱类药物可选择性抑制拓朴异构酶 Ⅰ
(Topoisomerase Ⅰ ,Topo Ⅰ),与其他常用的抗癌剂
无交叉耐药 ,且能增加耐药逆转剂环孢素 A 的血药
浓度[ 1] ,故该类药物对耐药的恶性肿瘤有效 。金喜
素(Topotecan , TPT)作为一种新型 、高效的水溶性
喜树碱类药物 ,近年广泛用于难治性急性白血病 、骨
髓增生异常综合征(MDS)、慢性粒单细胞白血病
(CMML)等造血系统恶性肿瘤的治疗[ 2 ,3] 。虽然药
理研究提示 , TPT 的广谱抗癌作用可能与其促凋亡
活性有关[ 4] ,但其触发细胞凋亡的具体机制迄今尚
无定论。鉴于 caspase 链逐级活化是众多凋亡刺激
信号的共同转导通路[ 5 ,6] ,故本研究拟采用人早幼
粒细胞白血病细胞株 HL-60 为实验对象 ,观察 cas-
pase-3 、caspase-8特异性抑制剂对 TPT 诱导的 HL-
60细胞凋亡的影响 ,以浅析 TPT 触发的细胞凋亡
过程与 caspase信号转导通路的关系 。
1　材料和方法
1.1　主要材料　金喜素购自贵州汉方制药有限公
司;核糖核酸(RNA)酶 、 噻唑蓝(MTT)分别为
Promega、Sigma 产品;IETD-fmk(caspase-8 抑制剂
)、DEVD-CHO(caspase-3抑制剂)为 Clontech 产品;
Annexin V FITC Kit(Cat.No 2375)源自 Im-
muno tech公司 ,该试剂盒由异硫氰酸荧光素(FITC)
标记的 Annexin V 、碘化丙啶(Propidium Iodide , PI)
　 hydroxyl groups.Chem Phys Lipid s , 1996;79:157～ 74
9　Cao G , Sofic E , Prior RL.Antioxidant and prooxidant behavior of
flavonoids:St ructu re-activity relat ionships.Free Rad ic Biol Med ,
1997;22:749～ 60
An electron paramagnetic resonance study on the
antioxidant effects of artemisia flavonoids
Abdiryim , Israpil , Halmurat
(Inst itute of Traditional Uighur Medicine of X inj iang , Urumqi　830001)
ABSTRACT　AIM　To study the f ree radical scav-
enging effects of artemisia f lavonoids.METHODS　
Scavenging activi ties to supero xide anion radical(O·2)
and hydroxyl radical(·OH)were measured by elec-
tron paramagnetic resonance(EPR).RESULTS 　
Artemisia f lavonoids has dif ferent scavenging activity
to O·2 and ·OH , and there is a parallel dependent rela-
tionship between the concentration and the scaveng-
ing effects.CONCLUSION　Artemisia flavonoids has
anti-oxidant activity.
KEY WORDS 　artemisia flavonoids;f ree radicals;
antioxidant
·650· 中国药理学通报　Chinese Pharmacological Bulletin 　2001 Dec;17(6):650 ～ 3