全 文 ：EDIBLEFUNGI食用菌 2008(3)
裂褶菌液体发酵转化酸枣仁
和黄芪的研究
黄 维 1 金邦荃 1* 吴京燕 1,2 蒋新陵 1,2
杨云峰 2 郁 桦 2
(1南京师范大学,江苏南京 210097;
2江苏吴中大自然生物工程有限责任公司)
摘 要 目的:在含有酸枣仁、黄芪的培养基中加入裂褶菌
(SchizophylumcommuneFr)进行液体发酵,观察其菌丝体和发
酵液中转化的粗多糖和总皂甙含量变化。方法:将裂褶菌接种
到含有酸枣仁和黄芪的液体培养基中,于25℃条件下发酵,分
别于发酵第 0、3、7、11天抽样测定每瓶发酵物中的生物量,分
析裂褶菌菌丝体和发酵液中粗多糖和总皂甙的含量。结果:经
过7～11d的发酵,酸枣仁组、黄芪组和合剂组的菌丝体生物量、
粗多糖和总皂甙含量均比对照组有明显增加(P<0.05orP<0.01)。
结论:利用裂褶菌液体发酵,可将酸枣仁和黄芪中的多糖和皂
甙进行有效菌物转化,从而提高了菌丝体的有效生物量。试验
还提示,在发酵第7天有效生物量出现明显拐点,建议第7天终
止发酵。
关键词 裂褶菌 液体发酵 酸枣仁 黄芪
文章编号 1000-8357(2008)03-0059-03
裂褶菌(SchizophylumcommuneFr.)是一种食药两用的真
菌,而酸枣仁(Semenziziphispinosae)和黄芪(Radixastragali)
又都是常见的中药材,它们都具有味甘、性平、生津等功效,中
医传统上用于镇静、滋补和改善免疫功能等作用[1]-[4]。
为了提高中药材中有效成份的生物转化量,如多糖类和
皂甙类,常用发酵手段来增进发酵物中的有效成份,以提高得
率并降低生产成本。随之发展起来的发酵方法主要有液体发
酵、固体发酵和两者混合发酵等,人们可通过改进培养基基础
配方来提高所要获取成份的得率。近年张英[5]等人为了充分
利用废弃物,采用固体发酵的方法,来进一步转换中药渣剩
余的多糖等,结果发现用裂褶菌发酵含有葛根药渣的培养
基,裂褶菌生长状态良好,并相应增进了葛根有效成份的生
物转化率。
试验前期研究酸枣仁粉对雄性小鼠睡眠的影响,认为可
能是酸枣仁中的皂甙可以改善小鼠的睡眠质量,而复配黄芪
有可能增进酸枣仁的此功效。为此,我们采用单因子试验设
计,设计 4种组合的培养基,观测在裂褶菌液体发酵条件下,
以土豆-葡萄糖为基础碳源的培养基为对照,加入一定剂量
的酸枣仁、黄芪或二者合一于培养基中,其功效成份:多糖和
皂甙含量在发酵液中或菌丝体中的生物转化量和适宜的发酵
周期。
1 材料和方法
1.1 裂褶菌液体培养基的配制 主要材料采用裂褶菌、酸枣
收稿日期:2007-08-31
*通讯作者。
膜、外稻草遮阳,建造简单,通风不良,温度高、湿度大,有利于
盘菌发生。
3.3 杀菌消毒和培养料发酵不过关 主要是培养料建堆(前
发酵)和“二次发酵”(后发酵)技术不过关,老菇房及覆土料杀
菌消毒不彻底,病原菌多。
3.4 生产管理和病害防控技术缺乏 主要是菇床喷水、通风
管理和培养料 pH值略酸等问题。当然,菇农对盘菌了解不
多,认识不足,发生时不懂防控,病害随风、随水迅速传播,任
其发展。
4 盘菌防治技术
姬松茸盘菌的防治工作与农作物病害防治一样,应以“预
防为主,综合防治”为原则。
4.1 栽培区域时间不宜太长 在一个区域内 (方圆 10km)
种植姬松茸不宜超过 5年。每年尽可能更换栽培场地或菇
房。栽培场地尽可能选择水源方便、地势较高、通风较好的
田块。
4.2 栽培季节可适当提前 我市中、低海拔地区栽培季节可
安排 3月上、中旬,比以往提前 15～20d,避开因处在 7-8月
高温高湿盘菌高发生期时遇姬松茸出菇高峰期造成的损失。
4.3 抓好培养料堆制发酵 堆料发酵(前发酵)和“二次发
酵”(后发酵)是姬松茸栽培的重要一环。堆料目的是通过高温
发酵,使原料迅速转化,便于姬松茸菌丝的吸收利用,并借助
于微生物作用产生的高热来杀死粪草中的病虫和盘菌等杂
菌。“二次发酵”是指培养料进菇房后,关闭门窗,让其自然升
温2～3d后再通过外热加温使菇房内温度上升到 58～62℃,保
持 10～12h,然后降温到 52～48℃,再保持 4～6d,促使培养料
繁殖大量的嗜热细菌。前发酵和后发酵技术不过关会严重影
响姬松茸产量和盘菌的发生。
4.4 做好消毒灭菌、清除病原菌 凡连续栽培姬松茸的菇
房,当第 1年姬松茸采收结束后,就要把废菌料清理出菇
房,掀去菇房四周和棚顶塑料膜让其日晒雨淋;当第 2年种
植姬松茸时,先提前清理菇房垃圾,开好菇房四周排水沟,
然后围盖塑料膜和遮阳草料、安装通风窗;当姬松茸培养料
进房前 1个星期消毒菇房一次,即在菇房内和菇房外 1～2m
处喷雾多菌灵等杀菌剂并撒上石灰粉;当姬松茸培养料进房
前 2d再消毒菇房 1次,一般 130～150m2菇房用甲醛 2kg,
敌敌畏 0.5kg熏蒸,密封 24h,然后,开门、开窗让药剂味道
退去就可进料。同时,整个长菇期间应保持菇房卫生,及时
清理菇床面死菇、菇头和死菇根,以免盘菌和虫害滋生。尤
其在菇床喷水时和喷水后要开窗,避免高温闷湿不利菌丝生
长而利盘菌发生。
4.5 菇床发病时处理 菇床一旦发生盘菌,要立即停止喷
水,加大菇棚光照和通风,并迅速采取“阻断隔离”措施。即清
除在盘菌发病 (从姬松茸培养料床底面菌丝体可看到被盘菌
危害的黄色菌丝体)与未发病处的姬松茸培养料和覆土料,清
宽 20～30cm,清料时下一层菇床要覆盖塑料膜,否则,在清料
时盘菌掉下来会蔓延。同时,在清沟处和发生盘菌的菇床上撒
碳铵或石灰,可得到抑制。
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仁和黄芪,共设计 4组配方。①对照组:土豆 20%,葡萄糖
2%;②酸枣仁组:酸枣仁 10%,土豆 20%,葡萄糖 2%;③黄芪
组:黄芪 10%,土豆 20%,葡萄糖 2%;④合剂组:酸枣仁 5%,
黄芪5%,土豆20%,葡萄糖2%。
培养基制备:去皮土豆于 400mL水中煮沸 20min,取滤
液为对照组;或先将一定量的酸枣仁、黄芪或酸枣仁 +黄芪
入水煮沸15min,再加入土豆共同煮20min,收集滤液。按组
别,分别在提取液(滤液)内加入等量葡萄糖并稀释至800mL,
分装于锥形瓶中,每瓶100mL。封口,0.12MPa30min高压灭
菌。
1.2 发酵条件 将裂褶菌接种入灭菌后的培养瓶中,置于
25℃145r/min的摇床上连续 11d发酵。各处理分别于发酵
第0,3,7,11天取样,检测每瓶生物量、粗多糖和总皂甙含量。
1.3 发酵产物及鉴定指标 分别测定发酵液和菌丝体中粗
多糖[6](硫酸-蒽酮法,λ=620nm,以葡萄糖为标准制作标准
曲线)、总皂甙[7](分光光度比色测定法,λ=560nm,以人参皂
甙 Re为标准制作标准曲线)及菌丝体干重即生物量 (称量
法,取发酵液过滤,菌丝体经蒸馏水洗涤 3次,置 80℃烘干 6～
8h至恒重[8])。
1.4 实验数据处理及分析 将数据输入 Excel表格,用
SPSS13.0软件进行分析,进行单因素方差分析 (One-way
ANOVA),采用 Homogeneity-of-variance进行方差检验,若方
差齐,则采用 LSD进行实验组与对照组均数间两两比较;若
方差不齐,则采用 Tamhane,sT2进行实验组与对照组均数间
两两比较,P<0.05说明两组均数具有差异显著性,P<0.01说
明两组均数差异极显著[9]。
2 结果与讨论
随着发酵天数的增加,菌丝体干重、粗多糖和总皂甙含量
逐渐增加,而发酵液中粗多糖和总皂甙逐渐减少,表明粗多糖
和总皂甙在发酵过程中呈现从发酵液向菌丝体内转化;在含
有酸枣仁或黄芪或合剂的液体培养基中,经过裂褶菌发酵更
有利于中药中粗多糖和总皂甙向菌丝体中转移。
2.1 液体发酵中菌丝体干物质含量的变化 试验表明,接种
当天(0天)4组生物量(即菌丝体干重,M-DM)在85～145mg/瓶
之间,组间比较接近。经过3、7、11d的发酵,对照组菌丝体增
长相对缓慢,但也分别增加了 5～10倍,至第 11天菌丝体达
到约890mg/瓶;其它3组实验组第3、7、11天的菌丝体增加
量明显高于对照组,分别增加了 10～24倍;除第 3天的黄芪
组外,第 7天 3组有效菌丝体即达到初始阶段的 12～18倍;
第 11天平均菌丝体酸枣仁组达到 2090mg/瓶,黄芪组为
2120mg/瓶,合剂组为2370mg/瓶(图1)。
经过发酵,酸枣仁组、黄芪组和合剂组的菌丝体干重明显
高于对照组,表明将酸枣仁、黄芪加入液体培养基中,可以促
进裂褶菌菌丝体的生长,但3组间无明显差异。
2.2 4种培养基中多糖含量的比较 未发酵前(0天)菌丝体
粗多糖含量在(2.58±0.58)～(4.41±0.09)mg/瓶,黄芪组最高,
依次为酸枣仁组、合剂组、对照组。随着发酵时间的增加,菌丝
体中多糖含量随之增加,然而对照组第11天菌丝体多糖增加
量为(5.32±0.93)mg/瓶,极显著低于其它 3组(P<0.01,酸枣
仁组为(38.30±2.53)mg/瓶,黄芪组为 32.43±6.03mg/瓶,合剂
组为(37.79±4.05)mg/瓶,图2、图4)。
与此同时,发酵液中的粗多糖含量0天也以黄芪组最高,
达到(339.10±15.30)mg/瓶,明显高于其它 3组(P<0.05)。酸
枣仁组、对照组和合剂组分别为(57.09±3.08)mg/瓶、(87.17±
9.31)mg/瓶和(139.00±19.15)mg/瓶。经过发酵,第 3天起发
酵液中粗多糖含量迅速减少,并以黄芪组下降最为显著
(P<0.01);而组间差异明显缩小;至发酵第11天,酸枣仁组发
发
酵
液
粗
多
糖
/(
m
g·
瓶
-1
)
图1 发酵期间菌丝体生物量的变化(n=2×2)
瓶
菌
丝
体
生
物
量
/g
时间/d
图2 4组菌丝体粗多糖含量
时间/d
菌
丝
粗
多
糖
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瓶
-1
)
图3 4组发酵液粗多糖含量
时间/d
粗
多
糖
净
增
量
/(
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g·
瓶
-1
)
图4 11天4组菌丝体粗多糖净增重
时间/d
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图7 4组菌丝体总皂甙净增重
时间/d
菌
丝
体
总
皂
甙
净
增
重
/(
m
g·
瓶
-1
)酵液中粗多糖未检测到,对照组、黄芪组和合剂组还有少量存
在 ,分别为:(0.19±0.34)mg/瓶、(12.46±11.90)mg/瓶 和
(22.42±1.55)mg/瓶 (图3)。
由此表明,随着发酵,各组发酵液中的粗多糖逐渐向菌
丝体中转移,使菌丝体的粗多糖含量明显增加。试验结果
发现,酸枣仁多糖比黄芪多糖更易于从发酵液中向菌丝体
转移;合剂组中由于黄芪的存在,多糖向菌丝体内的富集
量比单一酸枣仁发酵要少,该转化特征有待进一步试验论
证。
2.3 4种培养基中皂甙含量的比较 初始时,发酵液和菌丝
体中皂甙含量各有不同。发酵液中,黄芪组较高,(32.39±
2.41)mg/瓶;酸枣仁组和合剂组较低,分别是 (19.44±2.76)
mg/瓶和(13.54±1.31)mg/瓶,对照组最低(3.43±0.27)mg/瓶;
但前3组皂甙含量极显著高于对照组(P<0.01)。经过发酵,发
酵液中皂甙含量逐渐减少,第11天时约减少了8～14倍;且4组
间已十分接近(图5)。
0天,各组菌丝体中皂甙含量比较接近,依次为黄芪组
(0.83±0.05)mg/瓶、合剂组(0.83±0.05)mg/瓶、酸枣仁组(0.72±
0.09)mg/瓶和对照组(0.68±0.13)mg/瓶。发酵后,菌丝体中皂
甙含量明显增加,第7～11天时达到高峰。其中对照组和酸枣仁
组在第7天时菌丝体皂甙含量达到最高值,分别是初始阶段的
13.4倍和 223.5倍 (7.44±3.12)mg/瓶,(17.86±3.86)mg/瓶;
而黄芪组和合剂组在第 11天时菌丝体皂甙含量达到高峰,
分别是初始阶段的 17.4倍和 23.5倍 (18.89±2.31)mg/瓶,
(18.57±1.88)mg/瓶,图6。
试验结果表明,培养基中加入酸枣仁或黄芪或二者合用,
均有助于皂甙向菌丝体中的转移,使菌丝体中皂甙的净增加
量显著或极显著高于对照组 (4.41±0.37)mg/瓶,分别达到
(14.42±3.74)mg/瓶(P<0.05),(17.74±2.31)mg/瓶和(17.45±
1.78)mg/瓶(P<0.01),(图7)。
2.4 发酵周期的选择 试验以 11d为一个发酵周期进行研
究,在发酵第 7天各产物生成量出现明显的拐点。发酵 7d
后,产物生成曲线趋于平坦或下降(图2-3,5-6)。从生产成本
中的水电消化、设备折旧和人工支付等角度进行分析,选择发
酵第7或8天为生产终止点比较理想。
综上所述,在培养基中加入酸枣仁、黄芪或二者合剂,用
裂褶菌进行液体发酵,可以增加发酵瓶中的生物量(即菌丝体
干物质含量)及菌丝体中粗多糖和总皂甙的含量。
发酵液中的有效成分随着发酵逐渐降低,提示裂褶菌液
体发酵可以帮助有效成分向菌丝体中转移;酸枣仁和黄芪可
以加快总皂甙和粗多糖在菌丝体中的蓄积,经过综合考量,酸
枣仁似乎对有效成分的生物转换贡献更高;而黄芪经过裂褶
菌液体发酵的生产成本则比较低。
参 考 文 献
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图5 4组菌丝体总皂甙含量
时间/d
菌
丝
体
总
皂
甙
/(
m
g·
瓶
-1
)
图6 4组发酵液总皂甙含量
时间/d
发
酵
液
总
皂
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-1
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