全 文 ：食品与发酵工业 FOOD AND FERMENTATION INDUSTRIES
46 2010 Vol. 36 No. 10 (Total 274)
甜叶菊生物发酵制剂抗氧化成分的分离纯化和结构鉴定
于慧，王锡昌，宋仁政，奚印慈
(上海海洋大学 食品学院，上海，201306)
摘 要 分离、纯化了甜叶菊生物发酵制剂 SC3的强抗氧化活性成分，包括以清除 DPPH自由基能力为活性跟踪
指标，选用石油醚、乙醚、乙酸乙酯和正丁醇等不同极性溶剂进行萃取分部，将得到的甜叶菊生物发酵制剂 Scs
强抗氧化活性成分用 GF254薄层色谱分离纯化其抗氧化主活性成分，最终采用 GC-MS对其进行结构鉴定。结果
表明，SC3的 5 种溶剂萃取部在 0. 006 6%、0. 013 2%和 0. 019 8%浓度条件下，以乙醚部和乙酸乙酯部的 DPPH自
由基清除率最高，其中，从乙醚部分离得到的 C1、C2、C3、C4四种抗氧化活性组分对 DPPH自由基的清除能力分别
为 24. 95%、10. 30%、75. 12%和 77. 49%。后对其活性最强的 C3、C4两组分进行结构鉴定，确认 C3 为邻苯二酚，
推断 C4 为 3-异丙氧基-5-甲基苯酚。提示多酚类物质是 SC3强抗氧化作用的主要物质基础。
关键词 甜叶菊，生物发酵制剂，抗氧化活性成分，分离，纯化，结构鉴定，多酚类化合物
第一作者:硕士研究生(奚印慈博士为通讯作者)。
收稿日期:2010 － 05 － 19，改回日期:2010 － 08 － 04
甜叶菊(Stevia rebaudiana)作为一种高甜度、低
热量、无毒、无副作用的天然草本植物，长期以来由其
叶所提取的甜菊糖苷一直作为天然甜味剂被广泛利
用［1 － 2］。同时据报道，该植物还具有抗氧化、抗过敏、
抗菌等多种生物活性［3］，我国甜叶菊生物发酵制剂
具有较高的抗氧化活性［4］，这为开发天然、安全、高
效的抗氧化活性物质提供了重要依据。本研究将对
筛选得到的以甜叶菊生产糖苷时剩余废弃杆茎等为
原料制得的甜叶菊生物发酵制剂 SC3进行分离、纯化
和结构鉴定，旨在揭示该制剂强抗氧化作用的物质基
础。
1 材料与方法
1. 1 实验材料
甜叶菊生物发酵制剂 SC3，制备工艺流程如下:原
料-浸泡-萃取-分离-浓缩-压滤-分段发酵-低温熟成-
包装-成品。
1. 2 主要试剂
甲醇(色谱纯) ，上海国药集团化学试剂有限公
司) ;石油醚、乙醚、乙酸乙酯、正丁醇、甲苯、甲酸甲
酯、甲酸等均为分析纯试剂。
1. 3 主要设备
RE-52A型真空旋转蒸发仪、ZF7-C 型紫外分析
仪、GF254型硅胶薄层板(规格 1. 0 mm ×200 mm × 200
mm)、KUBOTA-5200 型台式低速离心机、气质联用仪
(GC-MS) ;美国 Agilent 公司(GC-6890;MS-5975;色
谱工作站;NIST 谱图库) ;微量进样器，美国 Agilent
公司(10 μL)。
1. 4 实验方法
1. 4. 1 SC3的不同有机溶剂抗自由基物的萃取过
程［5 － 6］
准确量取 50 mL甜叶菊生物发酵制剂 SC3于 250
mL分液漏斗中，加入 100 mL 石油醚，充分摇匀，静
置，待溶液完全分层后，放出下层的生物制剂水溶液，
保留上层石油醚，下层生物制剂水溶液用同法再萃取
2 次，将 3 次的石油醚萃取液合并，在 40℃下减压回
收石油醚，得到无色黏稠油状物，为甜叶菊生物发酵
制剂抗氧化提取物石油醚部后用不同溶剂分别萃取，
溶剂包括乙醚、乙酸乙酯、正丁醇，每种有机试剂共萃
取 3 次，将 3 次上层的有机溶剂萃取液合并，在 40 ～
50℃下减压回收有机溶剂，得到黄色黏稠油状物(乙
醚提取部) ，深红色糖浆状物(乙酸乙酯提取部) ，红
黄色结晶状物(正丁醇提取部) ，棕褐色结晶状物(剩
余水溶液部)。
1. 4. 2 SC3各萃取部对 DPPH自由基清除能力的测定
不同有机溶液制备液:准备称取上述甜叶菊生物
发酵制剂 SC3抗氧化提取物石油醚部、乙醚部、乙酸乙
酯部、正丁醇部和水部样品，分别用相应溶剂定容至
50 mL，后分别将石油醚部、乙醚部和乙酸乙酯部于
－ 18℃下充氮保存，将正丁醇部和水部于 － 4℃下充
氮保存备用。
DPPH自由基清除能力的测定:方法见文献［4］。
试验结果使用 SPSS11. 5 软件进行差异性分析。
1. 4. 3 SC3乙醚部的薄层色谱(TLC)纯化
DOI:10.13995/j.cnki.11-1802/ts.2010.10.045
研究报告
2010年第36卷第10期(总第274期) 47
抗氧化活性组分样液的制备［7］:将乙醚部样品
真空浓缩后，配成 40%的乙醚溶液。采用 10 块制备
型硅胶薄层板用点样用毛细管进行带状点样，点样宽
度控制在 2 mm左右，每块板点样 8 次，点样总量共 1
mL。实验选用 V(甲苯)∶ V(甲酸甲酯)∶ V(甲酸)=
5. 5∶ 4. 0∶ 0. 5 为展开剂［8］，在层析缸中展开约 50 min
后，挥干溶剂，观察颜色带和各峰分离情况。
后将硅胶薄层板置于紫外分析仪 365 nm 下显
色，根据紫外显色定位，刮下可辨认的色带(从上到
下共有 4 条清晰、易刮的色带) ，合并 Rf 值相同的色
带于 50 mL 离心管中，加入适量甲醇溶解、离心(2
000 r /min，20 min)、洗脱 3 次，收集洗脱后的上清液
并用甲醇定容至 10 mL，得到 C1、C2、C3、C4四组分，于
－ 18℃下充氮保存。
1. 4. 4 抗氧化活性组分的气质联用仪(GC – MS)
分析［9］
取上述 C1、C2、C3、C4四组分，用 0. 2 μm 的有机
相针式过滤器过滤后，采用 10 μL的微量进样器进样
分析。
气相色谱条件:色谱柱为 HP －5MS弹性毛细管柱
(30. 0 m × 0. 25 mm × 0. 25 μm) ;升温程序，从柱箱温
度40℃开始，保持2 min，以20℃ /min上升至250℃，保
持 20 min，运行时间 32. 5 min;载气为氦气，载气流速
l. 5 mL /min;进样口温度为 250℃;进样量 5 μL。
质谱条件:离子源温度为 230℃;四极杆温度为
150℃;扫描范围 20 ～ 550m /z;电离电压为 70eV;溶
剂延迟 3 min。
2 结果与分析
2. 1 SC3各极性部位的 DPPH自由基清除能力比较
甜叶菊生物发酵制剂 SC3的石油醚部、乙醚部、乙
酸乙酯部、正丁醇部和水部的 DPPH自由基清除率随
浓度而改变，5 个萃取部分在各个浓度条件下均具有
一定的 DPPH自由基清除效果，但各部分抗自由基活
性之间存在一定的差异。其中，石油醚部的清除效果
最低，并且随浓度变化并不显著;而乙醚和乙酸乙酯
部的 DPPH自由基清除率在各个浓度条件下均显著
高于石油醚部、正丁醇部和水部(P ＜ 0. 05) ，特别是
在 0. 006 6%、0. 013 2%和 0. 019 8%浓度条件下，这
2 个萃取部的自由基清除率最高，且二者不存在显著
性差异(P ﹥ 0. 05) ;而自由基清除率次之的为水部
和正丁醇部，其中在 0. 000 66%、0. 001 32%、0. 006
6%和 0. 013 2%浓度下，以水部的 DPPH自由基清除
率高于正丁醇部，而在 0. 019 8%浓度条件下，以正丁
醇部的 DPPH自由基清除率高于水部(P ＜ 0. 05) (表
1)。
由此可以得出，在 0. 006 6%、0. 013 2%和 0. 019
8%浓度条件下，乙醚和乙酸乙酯萃取部的 DPPH 自
由基清除率为最高，且二者不存在显著性差异。也就
是说该甜叶菊生物发酵制剂的抗氧化活性成分主要
集中在乙醚和乙酸乙酯萃取部中，且属于中等极性的
物质。因乙醚部的薄层分离效果优于乙酸乙酯部，因
此在后续实验中，选择乙醚萃取部对其进行分离纯
化，以期能够鉴定出抗氧化活性的物质。
表 1 石油醚部、乙醚部、乙酸乙酯部、正丁醇部和水部的 DPPH自由基清除率随浓度变化图
浓度 /% 石油醚 乙醚 乙酸乙酯 正丁醇 水相
0. 000 66 9. 90 ± 0. 17a 30. 81 ± 0. 74b 35. 94 ± 0. 49c 17. 89 ± 0. 61d 25. 71 ± 0. 57e
0. 001 32 10. 21 ± 0. 00a 65. 84 ± 0. 91b 72. 80 ± 1. 00c 34. 90 ± 0. 41d 55. 37 ± 0. 54e
0. 006 60 11. 04 ± 2. 98a 89. 41 ± 1. 27b 90. 44 ± 0. 66b 61. 42 ± 1. 38c 77. 87 ± 0. 29d
0. 013 20 10. 41 ± 0. 53a 92. 31 ± 0. 38b 91. 86 ± 0. 26b 81. 87 ± 0. 53c 84. 71 ± 0. 00d
0. 019 80 12. 50 ± 0. 35a 91. 50 ± 0. 14b 91. 38 ± 0. 14b 87. 62 ± 0. 25c 82. 60 ± 0. 25d
注:数据后的英文字母表示差异显著性水平，每个浓度条件下的数据进行比较，字母相同表示其间差异不显著(P ﹥ 0. 05) ，字母不相同表
示其间差异显著(P﹤ 0. 05)。
2. 2 SC3乙醚部的薄层色谱(TLC)分离纯化结果
乙醚萃取部经薄层层析后分离得到 8 条色带
(图 1) ，选择显色较清晰、易刮板的其中 4 条色带对
其进行分析。从图 1 可以看出，从原点开始，向展层
前沿一字排开共有 4 条清晰且易刮板的色带，从上至
下依次给予编号 1、2、3、4，它们在可见光和 365 nm
紫外光下分别呈现不同的颜色。其中，第 1、2 号色带
在可见光下分别呈现淡黄和淡粉色，而在 365 nm 紫
外光下却无荧光色;第 3、4 号色带在可见光下分别呈
现绿色和褐色，而在 365 nm 紫外光下分别显现红色
和绿色荧光。(R f =原点至斑点中心的距离 /原点至
展开剂前沿的距离)
2. 3 抗氧化活性组分对 DPPH 自由基清除能力的
比较
食品与发酵工业 FOOD AND FERMENTATION INDUSTRIES
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图 1 乙醚部 TLC分离纯化结果图
图 2 表示的是经薄层层析后，刮板、洗脱、定容后
得到的 C1、C2、C3、C4四组分对 DPPH 自由基清除能
力的比较。从图中可以看出，分离得到的这 4 组分均
具有一定的 DPPH自由基清除能力，其抗自由基活性
强弱顺序为 C3≈C4 ﹥ C1 ﹥ C2。因此，选择了自由
基清除能力最强的组分 C3、C4 进行结构鉴定。
图 2 SC3不同活性组分对 DPPH自由基的清除率
注:数据后的英文字母表示差异显著性水平，字母
相同表示其间差异不显著(P﹥ 0. 05) ，字母不相同表示
其间差异显著(P﹤ 0. 05)。
2. 4 抗氧化活性组分的结构鉴定
2. 4. 1 组分 C3 的 GC-MS结构鉴定
组分 C3 经 GC-MS检测，由化学工作站给出了组
分 C3 的总离子峰。C3 的为单一色谱峰，其保留时间
为 7. 534 min，杂质干扰较小，说明硅胶薄层板对该组
分具有较好的分离效果。图 3 表示的是组分 C3 的质
谱图，通过计算机检索并与结构库对照，推断出该化
合物为邻苯二酚，相似度为 94%。
另选取邻苯二酚标准品，将其配成 1%的甲醇溶
液，进样分析。其质谱图如图 4 所示。从图中可以看
出，邻苯二酚标准品的保留时间为 7. 588 min，和组分
C3 的保留时间极为接近，仅相差了 0. 054 min。同
时，二者的质谱图也极为相似，均可观察到 m/z
110. 1 的基峰和 m/z 64. 1 等特征离子峰。由此可以
确定该 C3 组分为邻苯二酚。
本研究从甜叶菊生物发酵制剂 SC3乙醚部中首次
将其分离得到，并确认了其对 DPPH自由基具有较高
的清除能力，证明了其是甜叶菊生物发酵制剂表现强
抗氧化能力的主要原因物质之一。佐藤实［10］等也曾
报道了甜叶菊日本抽提液中抗氧化活性成分含有邻
苯二酚，且具有较强抗自由基活性，本工作与佐藤实
等的结果相近。
图 3 组分 C3 的质谱图
图 4 邻苯二酚标准品的质谱图
2. 4. 2 C4 组分的 GC-MS结构鉴定
组分 C4 经 GC-MS检测，由化学工作站给出了组
分 C4 的总离子峰图(图 5)。图中显示 C4 为一个主
要组分色谱峰，其保留时间为 11. 364 min，杂质干扰
较小，说明硅胶薄层板对该组分也具有较好的分离效
果。C4 组分的质谱图(图 6) ，通过计算机检索并与
结构库对照，得出该组分为 3-异丙氧基-5-甲基苯酚，
相似度为 53%。因此近似推断该组分为 3-异丙氧
基-5-甲基苯酚。
3 结论
本研究从甜叶菊生物发酵制剂 SC3乙醚部中首次
分离和鉴定相关物质，并确认了其对 DPPH自由基具
有较高的清除能力，证明了其是甜叶菊生物发酵制剂
表现强抗氧化能力的主要原因物质之一。与佐藤
实［10］等报道的甜叶菊日本抽提液中抗氧化活性成分
含有邻苯二酚结果一致。
研究报告
2010年第36卷第10期(总第274期) 49
图 5 组分 C4 的 GC-MS总离子峰图
图 6 组分 C4 的质谱图
甜叶菊生物发酵制剂 SC3的极性分部萃取试验结
果表明:在 0. 006 6%、0. 013 2%和 0. 019 8%浓度条
件下，乙醚部和乙酸乙酯部的 DPPH自由基清除率最
高，且二者无显著性差异，它们明显强于水部、正丁醇
部和石油醚部。
对乙醚部进行 TLC 分离纯化试验，并对分离得
到的 C1、C2、C3、C4 四组分进行活性鉴定的结果表明:
这四个组分均具有一定的 DPPH自由基清除能力，其
清 除 率 分 别 为 24. 95%、10. 30%、75. 12% 和
77. 49%。
对 C3、C4两组分进行结构鉴定后确认:C3 为邻苯
二酚，并推断 C4 为 3-异丙氧基-5-甲基苯酚。提示甜
叶菊生物发酵制剂 SC3中具有一定的多酚类物质，且
它们具有抗氧化活性。
参 考 文 献
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Separation，Purification and Structural Identification of
Antioxidant Compositions from a Biological Fermentation
Preparation of Native Plant Stevia rebaudiana
Yu Hui，Wang Xi-chang，Song Ren-zheng，Xi Yin-ci
(College of Food Science ＆ Technology，Shanghai Ocean Vniversity，Shanghai 201306，China)
ABSTRACT This research was to separate，purify and structurally identify the high antioxidant compositions from a
fermentation preparation of a Chinese plant Stevia rebaudiana (SC3)． The DPPH assay was used as an antioxidant ac-
tivity monitoring parameter，and different fractions were obtained with different polar solvents such as petroleum ether，
ether，ethyl acetate and normal butyl alcohol． The main antioxidant components from the highest antioxidative frac-
tions were separated and purified by a GF254 TLC assay，and their chemical structures were further analyzed by GC-
MS． The results indicated that scavenging effect of the ether fraction and ethyl acetate fraction from SC3 on DPPH radi-
cal was the highest at the concentrations of 0． 006 6%，0． 013 2% and 0． 019 8% respectively． Four main antioxida-
tive components C1，C2，C3，C4 were separated by ether，fraction and their scavenging effect on DPPH radical
reached 24． 95%，10． 30%，75． 12% and 77． 49% respectively． The structural analysis indicated that C3 was cate-
chol，and C4 maybe 3-isopropoxy-5-methyl-phenol． It suggests that the polyphenols might be the main constitutes in
SC3 with high antioxidant activity．
Key words Stevia rebaudiana，biological fermentation，antioxidant composition，separation，purification，structural
identification，polyphenols