全 文 ：书第 43卷 第 5期 东 北 林 业 大 学 学 报 Vol．43 No．5
2015年 5月 JOUＲNAL OF NOＲTHEAST FOＲESTＲY UNIVEＲSITY May 2015
1)国家林业公益性行业科研专项(201304105) ;云南省应用基
础研究计划重点项目(2013FA054);云南省中青年学术技术带头人
后备人才培养项目(2010CI016)。
第一作者简介:耿菲菲，女，1989 年 2 月生，西南林业大学林学
院，硕士研究生。E－mail:lgengfeifei@ 163．com。
通信作者:王娟，云南省林业科学院，教授。E－mail:schima@
163．com。
收稿日期:2014年 11月 13日。
责任编辑:程 红。
思茅松成熟胚的胚性愈伤组织诱导与增殖1)
耿菲菲 肖丰坤 吴涛 陈芳 杨宇明 王娟
(西南林业大学，昆明，650224) (云南省林业科学院)
摘 要 以思茅松(Pinus kesiya var． langbianensis)成熟合子胚为外植体，1 /2MSG 培养基为基本成分，采用正
交试验设计研究 2，4－D、6－BA和 TＲIA 3 种植物生长调节剂对其胚性愈伤组织诱导的影响并获得最优诱导培养
基，通过改变生长调节剂种类和降低其质量浓度的方式研究胚性愈伤组织增殖效果，筛选适宜的增殖培养基。结
果表明:1 /2MSG+2，4－D 5．000 mg·L－1+6－BA 4．000 mg·L－1+TＲIA 0．005 mg·L－1为最佳诱导培养基;2，4－D对思
茅松成熟胚诱导胚性愈伤组织的影响最大，其次是 TＲIA，6－BA的影响最小;最佳的增殖培养基为 P6+NAA 2．0 mg·
L－1+6－BA 0．6 mg·L－1。
关键词 思茅松;成熟胚;体细胞胚胎发生;胚性愈伤
分类号 S339．4;S791．259
Induction and Proliferation of Embryonic Calluses from Mature Zygotic Embryos of Pinus kesiya var． langbianen-
sis / /Geng Feifei，Xiao Fengkun(Southwest Forestry University，Kunming 650224，P． Ｒ． China);Wu Tao，Chen Fang，
Yang Yuming，Wang Juan(Yunnan Academy of Forestry)/ / Journal of Northeast Forestry University，2015，43(5) :59－63．
The embryonic calluses were initiated and proliferated from mature zygotic embryos of Pinus kesiya var． langbianensis
on 1 /2MSG basical medium． The effects of three types of plant growth regulators (PGＲ) ，2，4-D，BA and TＲIA，on callu-
ses induction and proliferation were conducted by orthogonal design experiments． The best medium for the embryonic callu-
ses induction was 1 /2MSG+2，4－D 5 mg·L－1+BA 4 mg·L－1+TＲIA 0．005 mg·L－1 ． Among three PGＲs on embryogenic
callus induction，2，4-D was the most significant one，followed by TＲIA，and 6-BA was minimum． The optimum for prolif-
eration was P6+NAA 2 mg·L－1+6－BA 0．6 mg·L－1 ．
Keywords Pinus kesiya var． langbianensis;Mature embryo;Somatic embryogenesis;Embryonic callus
思茅松(Pinus kesiya var． langbianensis)是松科
松属常绿乔木，主要分布在云南中南部海拔 1 800 m
以下地区，是云南省重要的速生、造林、采脂及用材
针叶树种。思茅松一年可长 2 轮枝条，10 ～ 12 年生
时即可采脂，优选的高产脂植株及其它特定培育目
的类型的优株亟待推广。建立无性系可将其遗传增
益最大化，也是解决木材短缺、培育定向工业原料林
的有效途径，其中无性系繁育是前提条件。我国学
者已从扦插［1－2］、针叶束水培［3］、丛生芽诱导［4］、体
细胞胚胎发生［5］等途径对思茅松无性系繁育做了
许多工作。植物体细胞胚胎发生(简称体胚发生)
具有数量多、速度快、结构完整、成苗率高等优点，对
于生长周期较长的松属树种来说，该途径可快速形
成数量多、性状稳定的再生植株，不但是遗传转化最
佳的受体系统，更是最有希望大规模繁殖优良无性
系的方法［6］，该研究将为定向培育高产脂思茅松和
速生优质思茅松个体奠定重要基础。
自 1985年 Hakman和 von Arnold［7］首次报道挪
威云杉(Picea abies)的未成熟合子胚形成体细胞胚
并再生植株以来，体胚发生技术在松科植物中得到
了迅速的发展和广泛的研究。目前已有糖松(Pinus
lambertiana)［8］、湿地松(P． elliottii)［9］和红松(P．
koraiensis)［10］等 10 多种松属树种通过体胚发生途
径获得了再生植株。以成熟种子的合子胚作外植
体，材料容易获得且不受取材时间限制，容易保存并
可全年用于研究，但存在诱导困难或诱导率低的问
题。吴涛等［5］以特定发育阶段的未成熟合子胚为外
植体，获得了思茅松的胚性愈伤组织，但诱导率很低，
不足 2%;而其用成熟胚为外植体未能得到胚性愈伤
组织。由于树种特性，松属植物的体胚发生研究较其
它树种更为困难，胚性愈伤诱导时外植体的选择和诱
导率的提高尚有很大研究空间。为建立思茅松成熟
胚的体细胞胚胎发生体系，提高其胚性愈伤组织诱导
及增殖率，笔者利用正交试验探索成熟胚为外植体诱
导愈伤组织的最适激素质量浓度配比，采用不同培养
方式对胚性愈伤组织进行增殖，以期选择出最优增殖
培养基，为其无性育苗提供技术支持。
1 材料与方法
思茅松成熟种子于 2013 年初采于云南省西双
版纳州普文镇热带林业研究所思茅松种子园内，干
DOI:10.13759/j.cnki.dlxb.20150522.022
燥后密封，于冰箱中 4 ℃保存。使用前先用自来水
浸泡 24～48 h，浮选法筛去空瘪种子，余下的饱满种
子备用。
外植体消毒与接种:用医用剪刀和解剖刀将外
植体种壳去掉后，再用 0．1%升汞溶液分别浸泡并摇
晃 6、8、10、15 min 进行消毒，后用灭菌的纯净水冲
洗 5次。用灭菌解剖刀和镊子划开胚乳，取出种胚
水平接种于培养基表面。每个 9 cm 培养皿接种 15
个外植体，重复 10次。接种 7 d 后记录外植体污染
情况和生长情况，选出最佳消毒时间。
诱导培养基与培养条件:以 1 /2MSG 培养基为
基本培养基，pH=5．7～5．8、添加麦芽糖 15．00 g·L－1、
水解酪蛋白 1．00 g·L－1、肌醇 0．50 g·L－1、硝酸银
0．34 mg·L－1、MES250． 00 mg·L－1、活性炭 50． 00
mg·L－1、植物凝胶 4．00 g·L－1，高温灭菌后过滤加入
谷氨酰胺 750 mg·L－1。附加不同浓度的激素(表 1)
后配置成诱导培养基。黑暗培养，温度为 22～25 ℃。
正交试验设计:利用 L9(3
4)正交表，考察 2，4－
D(2，4－二氯苯氧乙酸)、6－BA(6－苄氨基腺嘌呤)、
TＲIA(三十烷醇)的质量浓度对思茅松成熟胚诱导
胚性愈伤组织的影响，其因素水平见表 1。每试验
接 45个外植体，重复 3次。
表 1 植物激素配比对思茅松胚性愈伤组织诱导的正交设计
水平
因 素
A(2，4－D)mg·L－1 B(6－BA)mg·L－1 C(TＲIA)mg·L－1
1 1 2 0．005
2 5 4 0．010
3 10 8 0．015
愈伤组织形态学与细胞学观察:接种后，每隔 3～
5 d观察记录愈伤组织的诱导情况，包括愈伤组织产
生的时间、部位、形态、质地、大小、颜色，以及污染情
况。20～30 d将诱导出来的愈伤组织挑取到载玻片
上分别用蒸馏水和卡宝品红染液进行压片。用体视
镜(Leica M165FC)和显微镜(Leica DMLS)进行外
植体和组织细胞观察。记录并统计胚性愈伤组织诱
导情况。
愈伤组织的增殖培养:将诱导出的愈伤组织接
种于增殖培养基，为了保证愈伤组织的质量，增殖培
养基采用激素质量浓度逐次递减的方式，即激素含
量依次减为诱导培养基的 1 /2、2 /5、1 /5、1 /10，其中
2，4－D改用 NAA代替。NAA 含量逐渐降低为 1．0、
0．8、0．4、0．2 mg·L－1，TＲIT不添加，肌醇增加到 1．0
g·L－1，其它成分不变［11］。每 2 周继代一次，每次
转接时均选取新分化的愈伤组织，并在其周围放置
少量原培养基［12］。愈伤组织增殖初步效果不理想，
所以另设计 4种增殖培养基，以期寻找更适合增殖
培养的基本培养基和激素处理。从继代 3次的 8 号
增殖培养基中，即激素质量浓度降为诱导培养基的
1 /5，选出一个增殖缓慢的胚性细胞系，并取出大小
约为 1 cm3 的 8 块愈伤组织，分别接于 A、B、C、D 4
种培养基上，每种培养基接种 2 块。这 4 种培养基
应用了两种基本培养基，并添加了不同质量浓度的
2，4－D、NAA和 6－BA。具体处理见表 2。其它成分
不变。
表 2 新增的 4种增殖培养基和原增殖培养基的成分配比
编号
基本培
养基
2，4－D /
mg·L－1
NAA /
mg·L－1
6－BA /
mg·L－1
A DCＲ 5．0 1．0
B P6 5．0 1．0
C P6 1．1 0．6
D P6 2．0 0．6
8号 1 /10 1 /2MSG 0．2 0．4
2 结果与分析
2．1 消毒时间对污染率的控制效果
试验最开始直接使用带种壳的思茅松种子进行
消毒，发现将消毒时间从 5 min 延长至 30 min，均不
能很好的降低污染率，真菌和细菌污染都较为严重，
推测可能是种子暴露在外界环境中时间较久，简单
漂浮清洗后直接用 HgCl2 消毒并不能有效抑制或去
除表面微生物。因此，将浮选法挑选出的种子去掉
种壳后，再用 0．1% HgCl2 溶液进行不同时间的消毒
处理，结果见表 3。当消毒时间小于 8 min 时，污染
率明显偏高;大于 8 min 时，污染率基本不变，但部
分外植体活力降低，40 d后不膨大也不生长。据此，
最佳消毒时间选定为 8 min。
表 3 消毒时间对思茅松外植体灭菌效果的影响
消毒时间 /min 接种 /个 污染 /个 污染率 /% 无活力的外植体
6 150 67 45 无
8 150 37 25 无
10 150 39 26 有
15 150 37 25 有
2．2 激素对愈伤组织诱导率的影响
9组正交试验的胚性愈伤诱导率依次为 26．75%、
27．07%、12．50%、86．67%、79．26%、87．77%、24．79%、
43．22%、18．25%。由表 4 可见，影响胚性愈伤组织
诱导率的因素由大到小依次为:A、C、B，即 3 种激素
对思茅松成熟胚诱导胚性愈伤组织影响最大的是
2，4－D，其次是 TＲIA，6－BA 的影响最小。其中，A
因素影响极显著，B 因素和 C 因素影响不显著。正
交试验最优组合为 A2B2C1，即 2，4－D为 5．000 mg·
L－1、6－BA 为 4． 000 mg·L－1、TＲIA 为 0． 005 mg·
L－1。为了验证所得结论的正确性，选择正交试验中
06 东 北 林 业 大 学 学 报 第 43卷
胚性愈伤诱导率最高的 6 号与最佳组合条件比较，
进行胚性愈伤诱导率的对照试验，结果表明其胚性
愈伤诱导率分别为 87．77%和 88．35%，最佳组合条
件下的胚性愈伤诱导率高于 6号条件下的胚性愈伤
诱导率，说明正交试验优选出的较优条件是正确的。
2．3 胚性细胞系的增殖培养
将产生的愈伤组织进行增殖培养，每 14 d 选取
新分化的愈伤组织转接至质量浓度逐步降低的增殖
培养基，胚性愈伤组织生长缓慢，部分出现褐化。
20 ～ 30 d 后，部分褐化的愈伤组织上会重新长出白
色丝状的胚性愈伤组织。重新形成的胚性愈伤组织
分裂能力强，生命力旺盛，可快速增殖。不同类型愈
伤组织增殖情况见表 5。胚性愈伤组织如不及时进
行增殖培养，即在含高质量浓度激素的诱导培养基
中培养 15 d后，愈伤组织开始褐化。但即使及时继
代，胚性愈伤组织也很容易褐化死亡。
表 4 植物激素配比对思茅松胚性愈伤组织诱导的正交试
验结果
指标 A(2，4－D) B(6－BA) C(TＲIA)
K1 22．11 46．07 52．58
K2 84．57 49．85 44．00
K3 28．75 39．51 38．85
Ｒ 62．46 10．34 13．73
表 5 思茅松不同愈伤组织类型的增殖培养情况
类型 愈伤组织外观 增殖情况
1 红色或白色半透明丝状 大部分褐化小部分增殖，增殖速度缓慢，部分褐化的愈伤上还会长出半透明的丝状愈伤
2 浅绿色或白色质地松软 小部分形成了胚状体大部分褐化
3 黄白色或黄褐色质地较坚硬 增殖较慢
4 白色透明松软，产生于子叶 增殖较慢并逐渐褐化
5 透明浅黄褐色质地松软 不增殖并逐渐褐化
6 褐化的愈伤上产生半透明的丝状愈伤 增殖较快
由于胚性愈伤组织在初始设计的 NAA和 6－BA
质量浓度递减试验中增殖情况不理想，为了寻找更
优的增殖培养基，设计了 A、B、C、D 4 种增殖培养
基。胚性愈伤组织培养 20 d 时，4 种增殖培养基和
原增殖培养基的增殖情况见表 6。由此可知，增殖
培养基 D较好。可能是增殖培养时，改用不同的基
本培养基并用 NAA代替 2，4－D，更有利于胚性愈伤
组织的增殖;也可能是 D 增殖培养基比较适合这一
发育状态的胚性细胞系，其原因还需进一步的确定。
表 6 新培养基和原增殖培养基的培养结果
编号 增殖情况
A 愈伤增殖较快
B 愈伤不增殖，并从表面逐渐变干
C 愈伤增殖较慢，并且有水渍现象
D 愈伤增殖较快，且新增殖部分透明丝状有黏性
8号 1 /10 大部分褐化小部分增殖，增殖速度缓慢
2．4 外植体诱导过程中的外观和细胞组织观察
成熟合子胚在培养基中培养 3 d 后，明显变粗
膨大，子叶展开，无愈伤组织产生(图 1A) ;培养 4 ～
7 d，从下胚轴开始产生乳白色半透明黏状组织(图
1B)。10 d后在胚轴或子叶处产生多种愈伤组织:
①白色或红色、半透明丝状，晶亮有黏性，结构松软，
表面具有透明凸起(图 1C);②湿润浅绿色或白色透
明愈伤组织，质地松软，产生于子叶或胚根(图
1D);③黄白色或黄褐色，质地较坚硬，细胞排列紧
密较小(图 1E) ;④浅黄褐色，半透明，质地松软，增
殖速度慢(图 1F) ;⑤形态同第一种愈伤组织，从褐
化的愈伤组织中产生(图 1G)。其中①、⑤两种愈
伤组织，表面都有白色，透明丝状组织，此时使用显
微镜观察，可看到表面产生透明的圆丘状凸起(图
1H)。压片后可见其主要由两类细胞组成:一类为
细胞质浓、细胞体积较小的胚头细胞;另一类为胚柄
细胞，即由一些高度液泡化，并或多或少延长的细胞
组成。在大多数胚形成的早期，胚分化成明显的胚
头和胚柄，其中胚柄是由胚头基部的分生组织细胞
分裂、分化而成的，它对胚头可提供结构上的支持和
营养物质吸收的作用，也是合成生长调节物质和储
存一些产物的场所［13］。
基于对胚性愈伤组织细胞增殖分裂过程的观
察，推测胚性愈伤组织的增殖过程是从某些单个细
胞的快速分裂开始，逐渐形成以该细胞为分裂中心
的相对独立的快速增殖的细胞团。显微镜下观察到
的细胞多呈大小相似的团状，有序地聚集在一起。
中心部位的细胞个体小，核质比大，含线粒体较多，
无液泡，处于快速分裂中，有时形成类似四分体的形
状，组织染色后可见。而外部细胞个体较大，胞质中
可见一些尚不成形的大液泡(图 1I ～ L)。胚性愈伤
组织的活性可能与中心细胞的旺盛分裂能力有关。
快速增殖、生长良好的愈伤组织(图 1M)中，可见较
多紧密成团的中心细胞。部分褐化组织上仍可长出
新的愈伤组织，很可能是由于该愈伤组织中保留了
较多的分裂能力强的中心细胞。
在试验中还观察到一些胚的胚根部或子叶和胚
轴连接处在培养过程中膨大并形成白色或浅绿色愈
伤组织，经观察此种愈伤组织可直接产生胚状体
(图 1N)，即外植体不经过愈伤阶段而直接在表面
形成胚状体。
16第 5期 耿菲菲，等:思茅松成熟胚的胚性愈伤组织诱导与增殖
A．培养 3 d的合子胚;B．培养 4～7 d的合子胚;C．白色透明状愈伤组织;D．白色丝滑状愈伤组织;E．褐色愈伤组织;F．黄色愈伤组织;G．褐色愈伤
组织上产生的胚性愈伤组织;H．胚性愈伤组织边缘的丝状凸起;I、J、K、L．胚性细胞团;M．胚性愈伤组织;N．直接产生胚状体;O．细菌污染情况。
图 1 外植体诱导过程中的外观和细胞组织
3 讨论
吴子欢等［14］用思茅松成熟胚为外植体，诱导出
了透明愈伤组织，但并未描述是否为胚性愈伤组织。
现有研究表明，虽然思茅松体胚发生途径是其无性
系造林最具优势和潜力的繁殖方式，还可为后续基
因工程育种提供最佳遗传转化受体系统，但是，尚存
在外植体取材范围受限、取材时期短、胚性愈伤诱导
率低、体细胞胚发育不整齐等亟需解决的问题。大
量试验表明，胚性愈伤组织的诱导及体胚发生过程
都与外植体的生理状态、培养基的营养成分、生长调
节因子以及多个胚在培养中竞争性等因素关系密
切［15］。只有合子胚发育到一定时期，才对外界培养
环境有反应，其发育程度对胚性愈伤组织的诱导起
决定性作用［16］。通常认为分化程度较低的组织，如
未成熟胚，更有利于体细胞胚胎的诱导发生［17］。但
未成熟胚采集困难，受生长季节限制与地域限制较
大，仅限于胚胎发育的某一时期才有较高诱导率，适
宜外植体采集时间短且不好掌握。因此，本研究使
用成熟胚作为外植体探索诱导胚性愈伤组织，是简
26 东 北 林 业 大 学 学 报 第 43卷
化操作、降低成本的有效方法，且此方法可在大规模
生产中较为方便。
有研究认为，不同品种间以及同一品种不同基
因型之间，对胚性愈伤组织的诱导及后期胚胎发育
方面都有很大差异［18］。在试验中，笔者发现有的胚
性愈伤组织在增殖培养基上 30 d 不继代，也不会褐
化且生长良好。这些愈伤组织可被筛选出来大量扩
增，建立增殖体系。故而在进一步的体系优化研究
中可从外植体的基因型筛选上进行较为系统的研
究，以提高其后期的生长质量。
试验中多次发现，在诱导愈伤组织的过程中，外
植体会产生抑制细菌生长的物质，即培养基受细菌
污染严重时，外植体周围并无污染(图 1O)，但对真
菌无效。可以对此物质进行进一步的研究以期能开
发出新型天然杀菌(细菌)剂。
在试验过程当中观察到直接体胚发生的现象。
近年来不断有松属体胚发生体系建成的报道，但指
的都是间接体胚发生，直接体胚发生与此相比，具有
培养程序简单、易操作和成功率高等特点，因此建立
思茅松的直接体胚发生体系，是一个可深入探究的
问题。
胚性愈伤组织诱导率较高，但愈伤组织产生较
小且增殖缓慢，造成了后续工作的停滞，所以寻找有
效的保持和增殖胚性愈伤组织的培养基，将是下一
步工作中所急需解决的问题。
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36第 5期 耿菲菲，等:思茅松成熟胚的胚性愈伤组织诱导与增殖