全 文 ：收稿日期:2007-01-29
作者简介:南敏伦(1978-), 男(汉族),吉林长春人 , 工程师 ,主要从事植物化学及中药新药研究 , Tel.0431-86816993 ,
E-mail nml2000@163.com。
文章编号:1006-2858(2008)02-0119-03
HPLC法测定不同产地返魂草中
绿原酸的含量
南敏伦 , 赫玉芳 , 刘静月 , 赵全成
(吉林省中医中药研究院 ,吉林 长春 130021)
摘要:目的 建立同时测定不同产地返魂草中绿原酸含量的方法。 方法 采用 HPLC 法。色谱柱为
Diamonsil ODS C18柱(4.6 mm×250 mm , 5μm),流动相为乙晴-体积分数为 0.4%的磷酸水溶液 , 检
测波长为326 nm;流速为 1 mL·min-1 。结果 绿原酸质量在 62 ～ 301 ng内与峰面积呈良好的线性
关系 , 平均回收率为 99.2%, RSD 为 0.91%(n =9);5 个产地返魂草中绿原酸含量分别为 0.95、
0.72、0.55 、0.64 、0.44 mg·g-1 。结论 HPLC 法可用于返魂草中绿原酸的含量测定;5 个产地的返
魂草中绿原酸含量有明显差异 ,吉林通化返魂草中绿原酸含量最高。
关键词:返魂草;绿原酸;高效液相色谱法
中图分类号:R 917　　　文献标志码:A
　　返魂草包括宽叶返魂草(Senecio cannabi folius
Less.)、返魂草(S.cannabi folius Less.var.davuric us
(Herder.)Kitag.)、毛背返魂草(S.cannabi folius
Less.f.pubinervis Kitag.)和 单 叶 返 魂 草
(S.cannabi folius Less.vat.integrifolius (Koidz.)
Kitag.),主要分布于中国东北和华北部分省区以及
朝鲜 、日本 、俄罗斯西伯利亚地区。在东北长白山区
以单叶返魂草分布最广 ,是返魂草药材来源的主流
品[1-2] 。返魂草地上部分主要含有的生物碱为千里
光啡啉 、千里光碱 A 、B 、C ,含有的酚酸类成分为氢
醌、绿原酸(结构式见图1)、对羟基苯乙酸 、熊果苷 、
对羟基苯乙酸甲酯 、3 ,4-二羟基苯甲酸、2 ,5-二羟基
苯乙酸 、2 ,5-二羟基苯乙酸甲酯 、3-羟基-4-甲氧基苯
甲酸 、邻羟基苯甲酸 、对羟基苯甲酸等 ,还含有铁 、
锰、锌 、铜等微量元素。全草具有清热祛痰 、镇咳平
喘等功效。目前 ,有多家制药企业用返魂草单方制
剂生产颗粒剂 、胶囊剂 、片剂 ,用于治疗肺内感染 、慢
Fig.1　Structure of chlorogenic acid
性支气管炎 、喘息性支气管炎 、急性呼吸道感染等
症 ,且疗效确切 ,成药销售状况极佳 。由于不同产
地药材中绿原酸的含量不同 ,为了保证药品的质
量 ,作者对返魂草中绿原酸含量测定方法进行探
讨 ,并对吉林安图 、吉林通化 、吉林四平 、辽宁锦
州 、河北保定 5个产地返魂草中绿原酸含量进行
了测定。
1　仪器与材料
Agilent 1100高效液相色谱仪 、VWD检测器
(美国 Agilent Technologies),超声波清洗器(江苏
昆山超声仪器有限公司)。
绿原酸对照品(中国药品生物制品检定所 ,批
号 110753-200212),乙腈(色谱纯 ,市售),水(超
纯水 ,自制),其他试剂(分析纯 ,市售)。
返魂草采自或购自吉林安图 、吉林通化 、吉林
四平 、辽宁锦州 、河北保定 ,经吉林省中医中药研
究院生药所徐国经教授鉴定为菊科植物返魂草
(Senecio cannabifolius Less.)的干燥全草。
2　方法与结果
2.1　色谱条件选择及系统适用性试验
色谱柱:Diamonsil ODS C18柱(4.6 mm ×
250 mm ,5μm);流动相:乙晴-体积分数为 0.4%
的磷酸水溶液 ,梯度洗脱;检测波长:326 nm;流
第 25 卷 第 2 期
2 0 0 8 年 2 月
沈　阳　药　科　大　学　学　报
Journal of Shenyang Pharmaceutical University
Vol.25 　　No.2　
Feb.2008 p.119　
DOI :10.14066/j.cnki.cn21-1349/r.2008.02.006
速:1 mL·min-1;柱温:20 ℃;进样量:10 μL。梯 度洗脱程序见表 1。
Table 1　Gradient elution procedure
t/ min V(acetonitrile)∶V(0.4%phosphoric acid sonlution) t/min V(acetonitrile)∶V(0.4% phosphoric acid sonlution)
0 1∶9 36 1∶9
26 1∶9 42 1∶9
31 1∶1
　　主色谱峰与相邻峰的分离度大于 1.5 ,理论塔板 数不低于 3 000 ,供试品及标准品的色谱图见图 2。
1—Chlorogenic acid
Fig.2　HPLC chromatograms of standard(A)and sample(B)
2.2　对照品溶液的制备
精密称取绿原酸对照品 5.02 mg ,置 25 mL
茶色量瓶中 ,加甲醇溶解并稀释至刻度 ,摇匀 ,得
质量浓度为 200.8 mg·L-1的对照品储备溶液。
精密量取上述对照品储备液 1.0 mL 置 10 mL 茶
色量瓶中 ,用甲醇稀释至刻度 ,摇匀 ,即得对照品
溶液 ,绿原酸质量浓度(ρ)为 20.08 mg·L-1 。
2.3　供试品溶液的制备
取药材粉末2.0 g ,精密称定 ,置具塞锥形瓶中 ,
精密加入质量分数为50%的甲醇 25mL ,称定质量 ,
超声处理 20 min(功率 250 W ,频率20 kHz),放冷 ,用
质量分数为 50%的甲醇补足减失质量 ,摇匀 ,离心 ,
精密量取上清液 2.5mL置10 mL量瓶中 ,用质量分
数为 50%的甲醇稀释至刻度 ,摇匀 ,过 0.45μm 微孔
滤膜 ,取续滤液 ,即得[ 3] 。
2.4　超声时间对绿原酸含量测定影响的考察
取同一产地干燥药材粉末 ,按“2.3”条方法制
备供试品 ,超声时间分别为20 、30 、40 min ,分别进
样 10 μL , 测得绿原酸含量分别为 0.42 、0.64 、
0.67 mg ·g-1(n =3), RSD 分别为 0.89%、
0.98%、1.05%。超声30min ,药材中绿原酸已基
本提取完全。
2.5　线性关系考察
精密吸取绿原酸对照品储备液 0.3 、0.6 、
0.9 、1.2 、1.5 mL ,分别置 10 mL 茶色量瓶中 ,加
甲醇稀释至刻度 ,摇匀 ,制成 5种不同质量浓度的
对照品溶液。吸取各对照品溶液 10 μL 注入液相
色谱仪 ,以峰面积(A)为纵坐标 ,绿原酸质量(m)
为横坐标绘制标准曲线 , 回归方程为 A =
2.425 6×103 m -1.2 , r =0.999 9 。结果表明 ,绿
原酸质量在 62 ～ 301 ng内与峰面积呈良好的线性
关系 。
2.6　精密度试验
取对照品溶液 ,进样 10μL ,连续进样 6次 ,计
算绿原酸峰面积的 RSD为 0.83%。取同一产地
药材粉末 ,按“ 2.3”条方法制备供试品溶液 ,连续
进样 6次 ,测定峰面积 ,绿原酸的 RSD为1.05%,
表明仪器与方法精密度良好。
2.7　稳定性试验
取同一供试品溶液 ,室温放置 ,在 0、2 、4 、6、10 h
分别进样 ,测定峰面积 ,绿原酸的 RSD为 0.98%,表
明供试品溶液中绿原酸在10 h内稳定。
2.8　重复性试验
对同一批药材分别称取 6份 ,按“2.3”条方法
制备供试品溶液 ,测定绿原酸的含量 ,绿原酸的
RSD为 1.02%,表明重现性良好。
2.9　加样回收率试验
精密称取已知绿原酸含量的返魂草药材
1.0 g ,共 9份 ,分为低 、中 、高 3组 ,分别加入绿原
酸对照品 ,按“ 2.3”条方法操作 ,按上述色谱条件
120 　　　沈　阳　药　科　大　学　学　报 第 25卷
测定 , 计算回收率。绿原酸回收率为 99.2%, RSD为 0.91%(见表 2)。
Table 2　Recovery test of chlorogenic acid(n=9)
m original/mg m added/ mg m found/ mg Recorvery/ % Recorvery average/ % RSD/ %
0.557 0.552 1.114 100.9
0.548 0.552 1.099 99.8
0.553 0.552 1.094 98.0
0.725 0.724 1.439 98.6
0.721 0.724 1.438 99.0 99.2 0.91
0.719 0.724 1.442 99.9
0.948 0.948 1.890 99.4
0.951 0.948 1.887 98.7
0.953 0.948 1.886 98.4
2.10　不同产地供试品含量测定
精密称取吉林通化 、吉林安图 、吉林四平 、辽
宁锦州 、河北保定等 5 产地的干燥返魂草药材粉
末各 2 g ,按“2.3”条方法操作并测定 , 5产地返魂
草中绿原酸含量分别为 0.95 、0.72 、0.55 、0.64 、
0.44 mg·g-1 。可见 ,在 5 个产地的供试品中 ,吉
林通化返魂草中绿原酸含量最高 , 其含量为
0.95 mg·g-1(见表 3)。
Table 3　Determination of sample content(n=3)
Habita Content(chlorogenic acid)/(mg·g -1) RSD/ %
Tonghua , Jilin 0.95 0.98
Antu , Jilin 0.72 1.05
Siping , Jilin 0.55 1.12
Jinzhou , Liaoning 0.64 0.89
Baoding ,Hebei 0.44 1.06
3　讨论与结论
a.对超声时间的考察表明 , 用质量分数为
50%的甲醇25 mL超声提取 30 min ,药材中的绿
原酸已基本提取完全 。供试品通过用水 、乙醇 、甲
醇 、质量分数为 50%的甲醇提取 ,结果表明 ,质量
分数为 50%的甲醇提取效果最佳 。
b.对检测波长进行了选择 ,在 199 nm至400 nm
处有 4个吸收峰 ,文献报道多用 326 nm ,经试验以
326 nm为检测波长 ,其灵敏度高 ,能够满足质量控制
的要求 ,故选择326 nm为测量波长。
c.由于绿原酸见光遇热不稳定 ,在配置对照
品时用茶色瓶 ,在制备供试品时应尽量避光并低
温保存。
d.在含量测定中 ,用自建色谱条件进行测
定 ,由于在绿原酸色谱峰的后面仍然有较多的杂
质峰 ,为了节省时间 ,缩短分析周期 ,采用了梯度
洗脱 ,经过试验验证 ,此方法重复性好 ,稳定 ,可以
有效的节省能源。
e.吉林通化 、吉林四平 、吉林安图 、辽宁锦
州 、河北保定等 5产地中 ,吉林通化返魂草中绿原
酸含量最高 ,其含量为 0.95 mg·g-1 。通过对不
同产地返魂草中绿原酸的含量测定的比较有利于
制药企业原料的选择 。
参考文献:
[ 1] 吉林省中医中药研究所.长白山植物药志[ M] .长春:
吉林人民出版社 , 1982:1235.
[ 2] 严仲铠.中国长白山药用植物彩色图志[ M] .北京:
人民卫生出版社 , 1997:44.
[ 3] 王吉彦 , 李丽静 , 张连珠.HPLC 法测定返魂草及其
注射剂中绿原酸[ J] .中草药 , 2005 , 36(8):1166 -
1167. (下转至第 132页)
121第 2 期 南敏伦等:HPLC 法测定不同产地返魂草中绿原酸的含量　　　
Design and application of chromatographic finger-
print of traditional Chinese medicine aided analyti-
cal system
DONG Hong-ye , WANG Hai-hui , JIN Jie , ZHAO Qing
(School of Basic , Shenyang Pharmaceutical University , Shenyang 110016 , China)
Abstract:Objective To study the computer-aided analy sis and evaluate the approaches as well as applicat ion
of fingerprint of t raditional Chinese medicine.Methods Taking Microsof t Visual Studio.Net 2003 as devel-
opment platform , object-oriented technique and relat ive statist ic and algorithm were used for the design and
applcation of the aided analy tical system of fingerprint of t raditional Chinese medicine.Results As the test
and check of actual sy stem applications , aided-analysis and calculation about the fingerprint of refinement of
g arlic oil achieves the anticipated demand of data processing .Sy stem testing shows that in the computer
w ith CPU main f requency being 1 G ,EMS memory being 256 M , this system can simultaneously deal w ith
100 pieces of chromatographic fingerprint , of w hich experiment time is 60 min.Conclusions With consis-
tently improvement , this sy stem has included a large amount of ex cellent softw are technique on fingerprint
of t raditional Chinese medicine and algorithm , which can not only accomplish such basic functions as cre-
ation of the contrasted fingerprint , molecular similarity , etc ,but can carry out spect rogram compiling and op-
timizing , f reedom chart peak matching , charts typesetting , simple data mining , etc as w ell.I t is proved the
practicability and stability of this system
Key words:t raditional Chinese medicine;fingerprint;computer;aided analy tical sy stem
(上接第 121页)
Determination of contents of chlorogenic acid in
Senecio cannabifolius Less.from different regions
by HPLC
NAN Min-lun ,HE Yu-fang , LIU Jing-yue , ZHAO Quan-cheng
(Academy of Tradit ional Chinese Medicine and Materia Medica of Ji lin Province , Changchun 130021 ,
China)
Abstract:Objective To set up HPLC method for the determination of the contents of chlorogenic acid in
Senecio cannabi folius Less.f rom different regions.Methods A Diamonsil C18 column(4.6 mm×250 mm ,
5μm)was used wi th the mobile phase consisting of acetonitril and 0.4%phospho ric acid.The flow rate was
1 mL·min-1 and the detection wavelength w as set at 326 nm .Results The liner range of chlorogenic acid
w as 62-301 ng.The average recovery of chlorogenic acid w as 99.2%(RSD=0.91%, n=9).Contents of
chlorogenic acid were 0.95 ,0.72 , 0.55 , 0.64 ,0.44 mg·g -1 from five regions respectively.Conclusions The
method is suitable for determination of chlorogenic acid in Senecio cannabifolius Less.There exist signif i-
cant differences in the contents of chlorogenic acid in Senecio cannabi folius Less.f rom five regions.Among
them , the content of chlo rogenic acid from Jilin Tonghua is the highest.
Key words:Senecio cannabi folius Less.;chlo rogenic acid;HPLC
132 　　　沈　阳　药　科　大　学　学　报 第 25卷