全 文 ：生 物 工 程
2012年第20期
Vol . 33 , No . 20 , 2012
甜叶菊糖基转移酶UGT76G1的克隆表达
及其性质研究
甜菊糖（Steviosides）是从菊科草本植物甜叶菊
（Stevia rebaudiana）叶中提取的新型天然甜味剂。它
是一种发展前景广阔的健康新糖源，具有高甜度（为
蔗糖的250～300倍）、低热量（仅为蔗糖的1/300）的特
性，无毒副作用，无致癌物，食用安全，对高血压、糖
尿病、肥胖症、心脏病、龋齿等病症还有一定的药理
作用和辅助疗效，是理想的蔗糖替代品[1]。我国是世
界上最大的甜菊糖生产国和出口国，甜菊糖被广泛
用于食品、医药、日用化工等行业[2]。但由于目前市售
甜菊糖在口感上存在后苦味，严重影响了其市场占
有份额。研究表明，甜菊糖实际上是多种糖甙的混和
物，不同糖甙在甜度或口感上存在较大的差异[3]。其
中，甜菊甙（Stevioside，St甙）最早被人们发现，是甜
刘 欢，李 艳*，严 明，陈 圣，郝 宁，许 琳
（南京工业大学生物与制药工程学院，江苏南京 210009）
摘 要：目的：利用甜叶菊糖基转移酶UGT76G1特异性催化甜菊糖中含量高并且具有较强后苦味的甜菊甙生成高甜
度的莱鲍迪甙A。 方法： 将合成的UGT76G1编码基因插入pYES2载体的EcoRⅠ和XhoⅠ酶切位点之间， 成功构建了
pYES2-UGT重组质粒。 重组质粒导入表达宿主酿酒酵母YPH499中，利用2%半乳糖对重组菌进行诱导表达。 结果：确
定了最佳诱导时机为菌体培养后48h，诱导表达时间为12h。并对重组酶粗酶液性质进行了初步研究，确定其最适反应
pH为8.0，最适反应温度为40℃，最佳反应时间为36h。 结论：为建立经济高效的生物催化法对甜菊糖口味改质奠定了
基础。
关键词：甜叶菊，莱鲍迪甙A，糖基转移酶UGT76G1
Cloning，expression and characteristic of glycosyl-transferase
UGT76G1 from Stevia rebaudiana
LIU Huan，LI Yan*，YAN Ming，CHEN Sheng，HAO Ning，XU Lin
（College of Biotechnology and Pharmaceutical Engineering，Nanjing University of Technology，Nanjing 210009，China）
Abstract：Objective：Stevioside which was high in content but has a strong bitter sweet in Steviosides is
specifically catalyzed to generate Rebaudioside A high in sweetness by the use of glycosyl transferase
UGT76G1. Methods：The synthetic glycosyl-transferase UGT76G1 coding gene after modified was inserted into
the vector pYES2 with the restriction site of EcoR I and Xho I in order to construct the recombinant plasmid
pYES2 -UGT which was then imported to Saccharomyces cerevisiae YPH499. The recombinant strain was
induced to express by 2% galactose. Results：Determined the best induction start time was 12h. The nature of
this restructuring enzyme was investigated and the optimal conditions were investigated as following：the pH of
phosphate salt solution was 8.0，the reaction temperature was 40℃，the reaction time was 36h. Condusion：This
study laid a foundation for building an economic and efficient biological catalysis method to modify the taste of
Stevioside.
Key words：Stevioside；Rebaudioside A；glycosyl-transferase UGT76G1
中图分类号：TS201.2 文献标识码：A 文 章 编 号：1002-0306（2012）20-0187-04
收稿日期：2012－04－09 * 通讯联系人
作者简介：刘欢（1988－），女，硕士研究生，研究方向：生物催化。
基金项目：国家自然科学基金项目（21106068）；江苏省自然科学基金
项目 （BK2011801）；高等学校博士学科点专项科研基金
（20113221120002）；江苏省普通高校自然科学研究计划项
目（10KJB530004）。
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DOI:10.13386/j.issn1002-0306.2012.20.062
Science and Technology of Food Industry 生 物 工 程
2012年第20期
菊叶中主要甜味成分，通常占总甙的50%以上，但甜
菊甙具有较强的后苦味；莱鲍迪甙A（Rebaudioside
A，RA甙）甜度和口感均佳，且不含任何不良余味，是
甜菊糖甙中味质最好的成分，但RA甙仅占总甙的20%
左右[3-4]。甜菊糖甙的甜度和口感主要取决于RA甙和
St甙的含量比例，提高RA甙相对含量是改善甜菊糖
品质的关键。在甜菊糖的生物合成过程中，甜菊醇在
不同的UDP-糖基转移酶（UDP-glycosyltransferases，
UGTs）作用下，在C-19和C-13位上分别连接不同数
量的葡糖基以及鼠李糖基形成不同的甜度和甜味的
甜叶菊糖甙，如图1所示[3-5]。植物UGTs是糖基转移酶
家族中的一个重要分支，每种植物中有多种UGTs，
各种酶对底物的作用位点具有高度特异性。Richman
等[5]从甜叶菊的EST中分离到3种参与甜菊糖甙合成
的UGTs（UGT85C2、UGT74G1、UGT76G1）的基因。体
外活性分析表明，UGT85C2催化甜菊醇到甜菊单甙
（steviolmonoside）的反应，UGT74G1主要催化甜菊双
甙（steviolbioside）的糖基化反应，生成St甙。而St甙到
RA甙由UGT76G1一步糖基化反应完成。Humphrey等
[6]的实验结果也证实了此过程。可见甜叶菊St甙与RA
甙含量的比例，主要取决于UGT76G1活性的高低。因
此，无论是采用植物代谢工程或是利用生物酶转化
获得高含量的RA甙，对于UGT76G1的研究至关重
要。本文主要采用了基因工程手段在酿酒酵母中实
现UGT76G1的重组表达，并对其催化特性进行了初
步研究，以期为今后该酶的深入研究奠定基础。
1 材料与方法
1.1 材料与仪器
大肠杆菌菌株E.coli DH5α和酿酒酵母菌株S.
cerevisiae YPH499 为本实验室保藏；pMDTM18-T载
体 购自TaKaRa公司；质粒pYES2 为本实验室保藏；
pYES2-UGT 本实验构建的带UGT76G1糖基转移酶
基因的重组质粒；基因和引物 分别由南京金思瑞公
司和上海申能博彩公司合成；各种酶及Marker 购自
大连宝生物公司；标准品St甙和RA甙 购自曲阜海根
甜菊制品有限公司；大肠杆菌完全培养基液体LB
蛋白胨10g/L，酵母提取物5g/L，氯化钠10g/L；酿酒酵
母完全培养基液体YPD 10g/L酵母提取物，20g/L蛋
白胨，20g/L葡萄糖；选择培养基液体SC-U（SC基本培
养基[7]缺乏尿嘧啶） 其中碳源为20g/L葡萄糖；SCGal-
U 即将SC-U培养基中葡萄糖用半乳糖代替。
高效液相色谱（DIONEX）、Lichrospher NH2 江
苏汉邦科技有限公司；紫外分光光度计 上海精密
仪器有限公司；高速冷冻离心机 Hettich；PCR仪
Biometro。
1.2 实验方法
1.2.1 基因合成 根据AY345974基因序列，进行密
码子优化，优化后的基因序列命名为UGT。
1.2.2 引物设计与合成 根据UGT基因序列设计引
物 P1：5’-CGGAATTCAAACAATGTCTGAAAATAA
GACTGAAACTACTG-3’和P2：5’-CCGCTCGAGTTA
TAATGATGAAATATAAGAAACCAA-3’，分别带有
EcoR I和Xho I酶切位点。
1.2.3 表达载体pYES2-UGT的构建 以合成的带有
UGT基因的质粒为模板，用引物P1和P2进行PCR扩
增。PCR在50μL体系中进行，反应条件为：94℃变性
5min；按如下参数循环30次：94℃变性30s，60℃退火
30s，72℃延伸2min；最后72℃延伸10min。将纯化后的
PCR产物通过“TA”克隆的方式连接到克隆载体
pMDTM18-T-UGT上，构建克隆质粒pMDTM18-T-UGT
并测序。然后用EcoR I和Xho I双酶切测序结果正确
的pMDTM18-T-UGT和表达质粒pYES2，纯化后将两
者连接，连接产物转化大肠杆菌DH5α感受态细胞，
用质粒电泳和酶切筛选并鉴定阳性克隆，至此获得
重组质粒pYES2-UGT。
1.2.4 UGT76G1的诱导表达 将经鉴定后的pYES2-
UGT重组质粒电击法转化到酿酒酵母YPH499感
受态中，30℃培养，在SC-U筛选平板上得到重组
YPH499（pYES2-UGT）单菌落。挑取单菌落到SC-U
培养液中，30℃振荡培养活化。然后按终OD600为0.4的
接种量转接新鲜液体SC-U中，30℃，培养48h，使菌体
生物量积累。室温6000r/min离心10min，获得的菌体
用0.1mol/L磷酸钾缓冲液（pH=7.2）悬浮洗涤后，离心
收获菌体，转移至SCGal-U培养基中进行诱导，30℃，
12h。诱导后室温离心，所得菌体即可用于破碎后测
酶活。
1.2.5 粗酶液的制备 菌液于6000r/min，4℃离心
10min，将离心收集的重组酿酒酵母细胞沉淀，用磷
酸钾缓冲液（0.1mol/L，pH=7.2）洗涤两次，加入
YeastBusterTM蛋白抽提试剂进行处理，破碎细胞。然
后4℃ 12000r/min离心5min取上清液即为粗酶液。
1.2.6 酶活测定方法 在 1.5mL的反应体系中
（1.2mmol/L St甙、4mmol/L UDPG、3mmol/L MgCl2、
10μg·mL BSA、pH=7.2），加入粗酶液反应，30℃反应
12h后，高温加热5min终止反应。以0h反应液做空白
对照。12000r/min离心1min后上清液用高效液相色谱
（HPLC）进行分析。酶活力单位定义为：在上述反应
条件下，30℃，1min催化形成1μmol RA甙所需要的酶
量为1个活力单位（U）。
1.2.7 色谱分析条件 色谱柱：Lichrospher NH2柱
（250mm×4.6mm，5μm）；流动相为乙睛 ∶水（80 ∶20，
V∶V），用磷酸调节pH至3.0；流速：1mL·min-1；柱温：
40℃；检测波长：210nm。
1.2.8 不同条件对重组菌粗酶液酶活的影响
图1 UDP-糖基转移酶催化甜菊甙生成莱鲍迪甙A的合成途径[3，5]
Fig.1 Synthetic pathway of Rebudioside A by
UDP-glycosyltransferases[3，5]
OH
COOH
H
H
Steviol
UGT85C2
O-glc
COOH
H
H
Steviolmonoside
UGT
O-glc-glc
COOH
H
H
Steviolbioside
UGT74G1
O-glc-glc
COO-β-glc
H
H
Stevioside
O-glc-glc
COO-β-glc
H
H
Rebaudioside A
glc UGT76G1
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1.2.8.1 pH缓冲对酶活的影响 在 pH6.0 ～9.0
（0.1mol·L-1磷酸钾缓冲液）范围内测定pH对粗酶液
活性的影响。反应温度30℃，反应时间12h，Mg2+浓度
3mmol/L。
1.2.8.2 温度对酶活的影响 在温度25～48℃范围内
测定温度对粗酶液活性的影响，反应pH为7.2，反应
时间12h，Mg2+浓度3mmol/L。
1.2.8.3 时间对酶活的影响 反应时间在12~96h范
围内测定粗酶液活性的变化，反应pH为7.2，温度
30℃，Mg2+浓度3mmol/L。
1.2.8.4 Mg2+浓度对酶活的影响 Mg2+浓度在1.5~
4.5mmol/L范围内测定粗酶液活性的变化，反应pH为
7.2，温度30℃，反应时间12h。
2 结果与讨论
2.1 表达重组子的构建、筛选与鉴定
构建好的重组载体pYES2-UGT如图2所示。
EcoR I和Xho I双酶切pMDTM18-T-UGT和表达质粒
pYES2后纯化连接，将连接产物转化大肠杆菌DH5α
感受态细胞，提取质粒筛选阳性克隆，经BamH I进行
酶切鉴定，电泳结果见图3，对应片断大小与预期相
符合（预期的两个片段大小分别为：6668、536bp），表
明外源片段已经正确连接到表达质粒上。
2.2 重组酶诱导条件分析
2.2.1 诱导时机 种子液按终OD600为0.4的接种量
转接于50mL SC-U中，30℃ 200r/min，开始培养后12～
60h期间，每隔12h作为一次诱导时机，对平行准备的
各样品中先后将菌体集菌洗菌后转入半乳糖终浓度
为2%的SCGal-U诱导培养基中，诱导24h，破碎后离
心，取上清液测定酶活。以酶活最高为100%计算相
对酶活，并记录诱导后菌体终OD600的值。
由图4可知，不同的的诱导起始时间对酶活有很
大影响。在培养时间为48h左右进行诱导，可以获得
较高酶活。当培养时间超过48h时进行诱导，相对酶
活性开始下降，这说明在菌体生长出于对数期后期
即48h时开始诱导能取得较好的结果。
2.2.2 诱导时间 种子液按终OD为0.4的接种量转
接于50mL SC-U中，30℃、200r/min，36h后集菌洗菌
后转入SCGal-U分别诱导12~60h，破碎后离心，取上
清测定酶活。以酶活最高为100%计算相对酶活，并
记录终OD600值。
由图5中可以看出，随着诱导时间的延长，重组
菌株发酵液的酶活力呈缓慢升高的趋势，在诱导48h
后酶活力达到最高，比较诱导60h后数据，可知过长
时间的诱导并没有有效增加相对酶活，可能是诱导
时间过长表达的重组蛋白发生降解。该图同时也说
明了基因持续诱导表达对细胞生长存在一定的负
作用。
2.3 不同条件对酶活的影响
初步考察了重组菌粗酶液在不同反应pH、不同
反应温度、不同反应时间以及Mg2+浓度下的活性，获
得粗酶液催化转化的最佳反应条件，为实现重组菌
全细胞催化反应的条件选择提供参考。
2.3.1 pH缓冲体系对酶活的影响 根据不同pH缓
冲体系测得的酶活，并以酶活最高为100%计算相对
酶活。由图6可见，此重组酶在pH为8.0时酶活最高，
反应转化的效率最高。在酸性环境下，酶活力较低，
在碱性环境下，当pH大于7.4或小于8.4时，相对酶活
都在60%以上，当pH为9.0时，酶活迅速下降。
2.3.2 温度对酶活的影响 分别考察了温度25～
48℃条件下的相对酶活，由图7可见，重组酶的温度
适应性并不是很宽泛，温度低于37℃或高于45℃时，
酶活都低于80%，最适温度在40℃附近。
图4 重组酶诱导时机分析
Fig.4 Induction start time analysis of UGT76G1
10
8
6
4
2
0
OD
60
0
12 24 36 48 60
诱导时机（h）
OD600
100
80
60
40
20
0
相
对
活
力
（
%）
相对活力
图2 重组质粒pYES2-UGT构建示意图
Fig.2 Construction of recombinant plasmid pYES2-UGT
URA3
fi ori
1
T7
promoter
EcoRⅠ
UGT
XhoⅠ
pYES2-UGT
7207bp
PGAL1
图3 酶切pYES2-UGT鉴定
Fig.3 Enzyme digestion pYES2-UGT
注：1：DNA Marker DL15000；2～3：酶切产物。
1 2 3
15000
10000
7500
5000
2500
1000
250
bp
图5 重组酶诱导时间分析
Fig.5 Induction time analysis of UGT76G1
10
8
6
4
2
0
OD
60
0
12 24 36 48 60
诱导时机（h）
OD600
100
80
60
40
20
0
相
对
活
力
（
%）
相对活力
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2.3.3 时间对酶活的影响 在不同反应时间点12~
96h相对酶活，结果如图8所示，此重组酶在反应0~12h
后，酶活急速增加；在36~60h时，该酶酶活最高且较
稳定；当反应时间超过72h，该酶的反应转化的效率
呈略微下降趋势，但相对酶活仍在80%以上。
2.3.4 Mg2+浓度对酶活的影响 由图9可见，当加入
的Mg2+浓度低于0.75mmol/L时，酶活性就开始被抑制
但抑制作用较小，而在Mg2+浓度为1.5~4.5mmol/L时，
Mg2+对酶活抑制作用急剧加大，当Mg2+浓度达到
7.5mmol/L时，相对酶活性已降低至20%左右继续增
加Mg2+浓度，相对酶活变化不大。以上可以说明，该
酶并不以Mg2+为酶活性结构中心必需离子，且较高浓
度的Mg2+浓度对此酶的催化能力有明显抑制作用。
3 结论
甜叶菊中UDP-糖基转移酶UGT76G1能够选择
性催化St甙生成RA甙，对于提高甜菊糖品质具有潜
在的应用价值。由于UGT76G1是植物蛋白，且在甜叶
菊叶片中存在多种糖基转移酶，难以纯化获得大量
的目的酶蛋白开展研究工作。而通过合成UGT76G1
的已知编码基因，采用基因工程手段则可以方便的
将其在基因工程菌中实现重组表达，获取目的酶蛋
白。本研究在实现了糖基转移酶UGT76G1于酿酒酵
母体系中成功表达的基础上，确立了其诱导表达条
件：诱导剂半乳糖浓度2%，诱导时机为菌体培养48h
后，诱导表达时间为12h。并对重组酶粗酶液性质进
行了初步研究，确立了其最适反应pH为8.0，最适反
应温度为40℃，最佳反应时间为36h。此工作为建立
经济高效的全细胞催化甜菊糖改质工艺奠定了基
础，而提高UGT76G1活性的相关研究也被确立为后
继主要的工作。
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图6 重组酶粗酶液催化反应的最适pH
Fig.6 The optimum pH of UGT76G1
100
80
60
40
20
0
相
对
活
力
（
%）
6 6.4 6.8 7 7.2 7.4 8 8.4 9
pH
图9 Mg2+浓度对酶活的影响
Fig.9 The effect of Mg2+ concentration on enzyme activity
100
80
60
40
20
0
相
对
活
力
（
%）
0 0.75 1.5 3 4.5 7.5 9
镁离子浓度（mmol/L）
图8 重组酶的最适反应时间
Fig.8 The optimum reaction time of UGT76G1
100
80
60
40
20
0
相
对
活
力
（
%）
0 4 12 24 36 48 60 72 84 96
反应时间（h）
图7 重组酶的最适温度
Fig.7 The optimum temperature of UGT76G1
100
80
60
40
20
0
相
对
活
力
（
%）
25 20 30 35 37 40 42 45 48
温度（℃）
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190