全 文 ：收稿日期:2008-12-29;　修订日期:2009-04-13
基金项目:2007年江苏省高等学校大学生实践创新训练计划项目(No.407);
江苏省高校自然科学基础研究项目(No.07KJD550203)
作者简介:高淑云(1955-),女(汉族),吉林敦化人 ,现任徐州工程学院化
学化工学院教授 ,学士学位 ,主要从事天然药物有效成分分离及检测研究
工作.
返魂草中硒多糖及硒元素含量的测定
高淑云 , 马亚东
(徐州工程学院化学化工学院天然药物研究中心 ,江苏徐州　221008)
摘要:目的 测定返魂草中硒多糖含量。方法 采用回流提取法和微波超声波协同提取法提取样品中的硒多糖 , 利用正交
实验确定微波超声波协同提取法的最佳提取条件;用硫酸 -蒽酮法测定返魂草中硒多糖含量;用石墨炉原子吸收法测定
硒多糖中微量元素硒。结果 回流提取法提取得粗硒多糖含量为 5.100%,回收率 97.83%, 精密度 0.95%;微波超声波协
同提取法提取得粗硒多糖含量为 5.395%, 回收率 97.93%,精密度 1.170%;石墨炉原子吸收法测得粗硒多糖中硒含量为
24.4μg/g, 回收率 97.64%,精密度 1.901%。结论 微波超声波协同提取法提取的返魂草中硒多糖含量高于回流提取法
提取的返魂草中硒多糖含量 ,因此 , 微波超声波协同提取法是一种快速 、灵敏的提取方法。
关键词:返魂草;　硒多糖;　石墨炉原子吸收法;　硒
中图分类号:R284.1　　文献标识码:B　　文章编号:1008-0805(2009)11-2763-02
　　麻叶千里光 SeneciocannabifoliusLessl.又名宽叶返魂草 , 为
菊科千里光属多年生草本植物 , 主要分布于我国东北 、河北等地
及朝鲜 、日本 、前苏联远东地区 , 生长于山沟林缘及湿草甸上 ,
该植物具有散瘀 、止血 、止痛的功效 [ 1] , 在民间被广泛用于感冒 、
炎症的治疗。千里光属植物含有吡咯里西啶类生物碱 , 该类生
物碱的体内代谢物具有肝 、肾损害等毒性作用 , 已被英国 、澳大
利亚等国以安全性问题为由禁止使用 , 使该属药材及其制剂的
生产 、销售和使用面临非常不利的局面。因此 , 对千里光属药材
进行系统的化学成分 、药效和安全性评价十分必要 [ 2] 。
近年来 , 由于多糖大量的生物活性功能以及在功能食品和临
床上的广泛使用 , 使多糖生物资源的开发和利用研究日益活跃 ,
成为天然药物 、生物化学 、生命科学领域的研究热点。到目前为
止 , 已有三百多种多糖类化合物从天然产物中被分离出 , 其中从
植物 , 尤其是从中药中提取的水溶性多糖最为重要 , 研究也十分
活跃。
由于硒多糖在生物体内的含量甚少 ,因此国内外对硒多糖的
存在形态及硒多糖中痕量硒的分析报道非常有限。生物体中微
量的硒多糖以及硒多糖中超微量的硒限制了人们对硒多糖的深
入研究 , 只有超高灵敏度的检测技术才有可能满足分析硒多糖中
痕量硒的要求。本文采用蒽酮 -硫酸法测定返魂草中硒多糖的
含量 , 用石墨炉原子吸收法测定硒多糖中的硒含量。
1　仪器与试剂
1.1　材料与试剂 返魂草产自延边地区。乙醇 、丙酮 、乙醚 、硫
酸 、蒽酮均为分析纯。硒标准储备液均为国家标准溶液(NCS),
实验用水均为二次蒸馏水及娃哈哈纯净水。
1.2　仪器及工作条件 FZ102型微型植物粉碎机(天津市泰斯特
仪器有限公司);数显式电热恒温水浴锅(巩义市予华仪器有限
责任公司);FA2104N电子天平(上海精密科学仪器公司);CW
-2000型微波超声波协同萃取仪(上海新拓微波溶样测试技术
有限公司);TAS-990型原子吸收分光光度计(北京普析通用仪
器有限责任公司)。石墨炉原子吸收仪器的工作条件见表 1 ～ 2。
实验所用玻璃仪器均经稀硝酸浸泡 12 h以上 , 然后经自来
水 、蒸馏水 、去离子水依次洗净烘干备用。
2　方法与结果
2.1　样品处理 用蒸馏水反复冲洗返魂草 , 于 60 ℃恒温箱中干
燥 , 然后用微型植物粉碎机粉碎装瓶备用。
2.2　返魂草中硒多糖的提取
2.2.1　回流提取法 称取返魂草全草用 30 ～ 100目粉碎机粉碎 ,
称取 10.0 g置圆底烧瓶中 , 加入乙醚 200ml, 回流提取 70min, 然
后抽滤 ,弃去滤液 , 将滤渣小心转移至烧瓶内 ,用乙醚冲净滤纸上
的滤渣一起转移至圆底烧瓶内 ,再加入乙醚 200 ml, 回流提取 60
min,同样方法进行抽滤转移 , 再用 150 ml乙醚回流提取 60 min,
使滤液基本无色。将滤渣风干除去其中乙醚 ,转移至干净的圆底
烧瓶中 , 用 200ml去离子水沸水回流 3次 , 30 min/次 , 趁热过滤 ,
合并滤液 , 将滤液至电炉上浓缩至 50 ml, 加入无水乙醇 200 ml,
使醇含量为 80%。静置过夜 ,滤过。沉淀再加水溶解 , 加乙醇至
醇含量为 80%静置过夜 ,取沉淀分别用无水乙醇 、丙酮依次洗涤
3次 , 20ml/次 ,置 45 ℃烘干后可得棕色粗多糖 0.51 g。
表 1　TAS-990型石墨炉原子吸收分光光度计工作条件
元素 波长 λ/nm 灯电流 ξ/mA 光谱带宽 λ/nm 负高压 υ/V
硒 196.1 5.0 0.4 350
表 2　TAS-990石墨炉的硒元素测定加温程序
阶段 温度T/℃ 升温 t/s 保持时间 t/s
干燥 120 10 10
灰化 400 10 10
原子化 2200 0 3
清洗 2400 1 1
2.2.2　微波超声波协同提取法 精确称量返魂草样品 6份各
10.00g, 根据单因素实验和正交实验得出的最佳条件 , 在最佳优
化方案下即料液比为 1∶35,提取功率为 250 W,提取时间为 180
s条件下提取 , 按照 “ 2.2.1”项方法进行平行测定 6次 , 得到 10.
00 g返魂草中粗多糖提取率分别为 5.41%, 5.56%, 5.33%,
5.28%, 5.34%, 5.45%, 粗多糖平均提取率 5.395%。
2.3　返魂草中粗硒多糖纯度测定
2.3.1　葡萄糖标准曲线的绘制 将一定量葡萄糖标准品粉末于
107 ℃烘干至恒重 , 精确称取葡萄糖标准品粉末 0.020 g于 100
ml容量瓶中 ,定容 、摇匀。精确量取葡萄糖标准品溶液 0, 1.0,
2.0, 3.0, 4.0, 5.0 ml,分别置 10 ml量瓶中 , 纯化水定容 , 摇匀 , 再
分别精密量取 2.0 ml,置干燥具塞试管中 , 加入蒽酮 -硫酸试剂
4.0 ml,立刻摇匀 , 冷却至室温置于暗处。同时以 2.0 ml去离子
水 , 加蒽酮 -硫酸试剂 4.0 ml作空白。在 620 nm波长处测定吸
收度。以葡萄糖含量(μg/ml)为横坐标 , 吸光度(A)为纵坐标进
行回归 ,得回归方程为:Y=0.007 2X+0.008 7, R2 =0.998 5。
2.3.2　粗硒多糖溶液的制备及纯度测定 精确量取粗硒多糖
0.030g, 加入去离子水溶解 ,转移至 100 ml容量瓶中。精密量取
配好溶液 1.0, 2.0, 3.0ml各 3份 ,置干燥具塞试管中, 各加蒽酮 -
-硫酸试剂 4.0ml,立即摇匀 ,冷却至室温 ,按 “ 2.3.1”项下操作。
粗硒多糖纯度按下式计算:
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LISHIZHENMEDICINEANDMATERIAMEDICARESEARCH 2009VOL.20NO.11 时珍国医国药 2009年第 20卷第 11期
粗硒多糖纯度(%)=(A-0.0087)×100/0.0072×VW×106
(A:吸光度;W:量取粗硒多糖质量;V:取液量)
根据三组数据 0.351, 0.698, 1.040计算得粗硒多糖平均纯
度为 15.9%, 由返魂草中粗硒多糖平均提取率为 5.395%
(“ 2.2.2”所得),所以返魂草中硒多糖含量为 5.395% ×15.9%
=0.86%。
2.4　加样回收率实验 精密量取粗硒多糖溶液 1.0, 2.0, 3.0 ml,
分别加入葡萄糖标准品溶液 1.0, 2.0, 3.0ml置 10 ml量瓶中 ,再
分别量取 4.0 ml蒽酮 -硫酸试剂置干燥具塞试管中在 620 nm
波长处测定吸收度。结果见表 3。
表 3　回收率实验结果
提取方法 粗硒多糖含量C/mg· g-1
加标量
C/mg·g-1
测得总量
C/mg· g-1
回收率
(%)
回流提取 51.08 50.0 98.89 97.83
微波超声波协同提取 53.95 50.0 101.8 97.93
2.5　精密度实验 分别精密取同一供试液 5份, 每份 2.0ml,置干
燥具塞试管中,各加蒽酮 -硫酸试剂 4.0ml,立即摇匀 ,冷却至室温,
按 “2.3.1”项下操作,计算精密度。结果 RSD为 0.95%和 1.17%。
表 4　精密度实验 %
提取方法 RSD
回流提取 0.95
微波超声波协同提取 1.17
从表 4中可以看出 , 本实验的相对标准偏差在 5%以内 , 说
明本实验的重现性好 ,测定结果可信。
2.6　返魂草粗硒多糖中硒元素的测定
2.6.1　硒标准曲线的绘制 精确量取硒标准溶液 1 ml,用纯水定
容到 1 000 ml,得到浓度为 1μg/ml的母液 ,取母液 0 , 0.4 , 0.8
, 1.2 , 1.6 , 2.0 ml定容到 10 ml, 得 Se浓度分别为 0, 0.04,
0.08, 0.12, 0.16, 0.20 μg/ml, 用石墨炉原子吸收分光光度计在
上述工作条件下测定其吸光度值。根据测定的吸光度值计算出
回归方程和相关系数:回归方程 Y=1.233 6X+0.002 1, (其中 X
为 Se标准液浓度 , Y为吸光度);相关系数为 0.999 8。
2.6.2　粗硒多糖溶液的配制 精确称取返魂草粗硒多糖 0.365
g, 加纯净水定容于 100ml容量瓶中。然后分别取 0.0, 2.0, 4.0,
6.0, 8.0 ml于 10ml容量瓶中 ,用纯净水定容至刻度。
2.6.3　硒元素的检测结果 粗硒多糖中 Se的含量计算公式为:
mSe=(A-0.0021)×10×1001.2332×V×W
mSe———粗硒多糖中 Se的含量;A———测定吸光度;V———取液量;
W———称取粗多糖质量
测定结果见表 5。
表 5　多糖中硒元素含量的测定
取液量V/ml 吸光度 A 硒含量 C/μg· g-1
0 0 0
2 0.024 24.33
4 0.046 24.38
6 0.069 24.77
8 0.090 24.41
由以上 4组数据得粗多糖平均含硒量为:mSe=24.33 +
24.38+24.77+24.41)/4×0.365 =24.47(μg/g)
2.7　精密度实验 对粗糖样品液中 Se元素进行吸光度值测定 ,
结果见表 6。
表 6　Se元素的变异系数
测定次数 含量测定 C/μg· g-1 RSD(%)
1 23.85 1.4
2 24.36 2.1
3 24.07 1.3
4 24.12 1.2
5 24.33 2.2
从表 6中可以看出 , 本实验的相对标准偏差 RSD在 5%以
内 , 说明本实验的重复性好 ,测定结果可信。
2.8　准确度实验 吸取一定量的样液进行返魂草粗多糖中 Se的
回收率实验。测定结果见表 7。
表 7　返魂草中 Se的回收率
试验次数 样品元素含量/Cμg· g-1
加标量
C/μg· g-1
测得总量
C/μg· g-1
回收率
(%)
1 24.12 20.000 43.98 99.68
2 23.95 20.000 42.87 97.54
3 24.35 20.000 44.07 99.37
4 23.67 20.000 42.67 97.71
5 24.37 20.000 43.89 98.92
由表 7可见 , 测量的回收率在一定范围之内 , 说明测量的准
确度高 。
2.9　检出限 Se的检出限为:0.5 ng/ml, 可能是由于:①乙炔气
体不纯 ,造成原子化温度的稳定性不好;②注射器内有小气泡;③
空白溶液的值偏高。
3　讨论
3.1　两种提取方法的比较 回流提取法得粗硒多糖含量为
5.100%, 回收率 97.83%, 精密度 0.95%;微波超声波协同提取
法得粗硒多糖含量为 5.395%,回收率 97.93%,精密度 1.170%。
由结果看出微波超声波协同提取法比回流提取法提取率稍高些。
回流提取法提取时间长 , 步骤较复杂 , 在料液转移过程中容
易出现误差;微波超声波协同提取法直接将振动与开放式微波两
种作用方式相结合 ,充分利用了超声波振动的空化作用(同时具
有萃取和机械搅拌作用)以及微波的高能作用。进而使样品得
到充分的作用 ,从而最大限度地将样品中的有效成分提取出来 ,
既省时 ,又可节约原材料。
3.2　硒多糖及硒的功效 硒和多糖同样对许多疾病具有防治作
用 , 近年来对多糖和硒活性的研究已经较为深入 , 但将多糖与硒
有机结合成为硒多糖 ,国内外的研究尚处于起步阶段。硒与多糖
的有机结合形成硒多糖将会使硒和多糖的生理和药理功能得到
优化。然而对硒多糖的全部功能和生化特性尚未完全清楚 ,尤其
是从分子生物学的角度对硒多糖的构效关系 ,以及作用机制等方
面研究的直接证据和实验更显不足 ,因此采用现代分离分析技术
对硒多糖进行深入研究是非常必要的。
多糖具有抗肿瘤和免疫促进 、抗炎 、抗病毒 、抗凝血 、降血糖
等广泛的生物学活性。硒与多糖的有机结合形成硒多糖将会使
硒和多糖的生理和药理功能得到优化。
硒是谷胱甘肽过氧化物酶的活性中心元素 ,在清除自由基 、
分解过多的过氧化氢 、减少过氧化物 、保护细胞膜 、保护细胞敏感
分子 DNA, RNA中占有重要地位。硒在机体中多以蛋白形式存
在。其主要生理功能有参与酶的催化反应;调节维生素 A, C,
E, K的吸收与消耗;在机体代谢和电子传递中起作用;增强机体
免疫能力;增强人的生育能力及生殖能力。硒缺乏可能会导致克
山病 、大骨节病 、恶性营养不良 、甲状腺激素代谢疾病 、免疫力低
下等 , 一些动物实验提出低硒可能对心血管疾病发生起作用 。硒
还具有抗肿瘤 、抗癌作用。
目前还无研究返魂草中硒多糖的报道 ,本文采用蒽酮 -硫酸
法测定了返魂草中硒多糖的含量 ,用石墨炉原子吸收法测定硒多
糖中的硒含量 , 返魂草中硒多糖及微量元素硒不仅与该植物具有
散瘀 、止血 、止痛的功效有密切的关系 ,硒多糖本身作为一种活性
多糖 , 必然与其生物活性 ,如免疫促进 、抗炎 、抗病毒 、抗凝血 、降
血糖有直接的关系。因此返魂草中硒多糖及微量元素硒是影响
其药理作用的不可忽视的重要方面 ,硒元素与返魂草中其它化合
物的有机结合或与各种有机物特殊的络合形式对返魂草药理作
用的影响尚不清楚 ,有待进一步研究探索。
参考文献:
[ 1 ] 　国家中医药管理局《中华本草 》编委会.中华本草 ,第 7册 [ M].上
海:上海科技出版社 , 1999:943.
[ 2 ] 　吴　斌 ,林文辉 ,高慧媛 ,等 .麻叶千里光抗菌化学成分的研究 (
Ⅱ)[ J] .中草药 , 2005, 36(10):1447.
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时珍国医国药 2009年第 20卷第 11期 LISHIZHENMEDICINEANDMATERIAMEDICARESEARCH 2009VOL.20NO.11