全 文 ：收稿日期:2013-01-05 接受日期:2013-07-19
基金项目:国家自然科学基金项目(31260634) ;湖南省科技厅项
目(2013NK3078;2013FJ2012) ;张家界市科技局项目
(2013YB25)
* 通讯作者 Tel:86-744-8231386;E-mail:daw1999@ 163． com
天然产物研究与开发 Nat Prod Ｒes Dev 2014，26:230-232，272
文章编号:1001-6880(2014)2-0230-04
五爪龙外敷液中芹菜素与槲皮素的 HPLC测定
董爱文1
*
，朱春艳2，卓 琦3
1吉首大学林产化工工程湖南省重点实验室，张家界 427000;
2吉首大学生物资源与环境科学学院，湖南吉首 416000;3 吉首大学城乡资源与规划学院，张家界 427000
摘 要:本实验建立芹菜素与槲皮素的 HPLC检测法，同时测定草药五爪龙外敷药液中芹菜素与槲皮素的含量。
采用反相 shim-pack VP-ODS C18色谱柱(4． 6 mm × 150 mm，5 μm) ，优化条件为:柱温 30 ℃，流动相:甲醇-0． 4%
磷酸(50∶ 50，v∶ v) ;流速:1． 0 mL /min;检测波长:360nm;进样体积 10 μL。对草药五爪龙外敷药液中芹菜素与槲
皮素的含量进行测定。结果表明:芹菜素与槲皮素均在 60 ～ 300 μg /mL 的范围内线性关系良好，r 分别为
0. 9998与 0． 9996，草药五爪龙乙醇浸液较水煎煮液中芹菜素与槲皮素含量均高。本法方便、快速、准确，可检测
草药五爪龙外敷液中的芹菜素与槲皮素的含量。
关键词:五爪龙;芹菜素;槲皮素;外敷液;HPLC
中图分类号:Ｒ286． 02 文献标识码:A
Simultaneous Determination of Apigenin and Quercetin in External
Application Liquid of Potentilla kleiniana Wight et Arn by HPLC
DONG Ai-wen1* ，ZHU Chun-yan2，ZHUO Qi3
1Key Laboratory of Forest Products Chemical Engineering of Hunan Province，Jishou University，Zhangjiajie 427000，China;
2College of Biology and Environmental Sciences，Jishou University，Jishou 416000，China;
3College of Urban-rural Ｒesources and Planning Science，Jishou University，Zhangjiajie 427000，China
Abstract:The objective of this study was to establish a HPLC method for the simultaneous determination of apigenin and
quercetin in the external application liquid of Potentilla kleiniana Wight et Arn． Ｒeversed phase chromatographic column
Shim-pack VP-ODS C18(4． 6 × 150 mm，5 μm)was used for the separation of apigenin and quercetin under the condi-
tions of methanol-4% phosphate acid(50∶ 50，v∶ v)as the mobile phases，column temperature of 30 ℃，flow rate of 1． 0
mL /min，detection wavelength at 360 nm and injection volume of 10 μL． The results indicated that both apigenin and
quercetin had good linear relationship in the range of 60-300 μg /mL with correlation coefficients of 0． 9996 and 0． 9997
respectively． The contents of apigenin and quercetin of the alcohol extract of P． kleiniana were higher than that of water-
decocted liquid extract． In conclusion，the HPLC method developed in this study was convenient，quick and accurate． It
can be used for determination of apigenin and quercetin in P． kleiniana．
Key words:Potentilla kleiniana Wight et Arn;apigenin;quercetin;external application liquid;HPLC
五爪龙(Potentilla kleiniana Wight et Arn．) (蛇
含委陵菜)是委陵菜属植物［1］。常以全草入药，性
味:苦，微寒。具有清热解毒、止咳止痢、截疟、解毒
活血等功效，常用于治疗咽喉肿痛、小儿惊风、百日
咳、急慢性胃炎等疗效显著［2］。武陵山区中医用五
爪龙等草药用适量白酒捣烂后的醇浸液或水煎煮的
汤液来外敷治疗疮毒、痛肿及蛇虫咬伤等。而两种
外敷液实际治疗效果差异较大，中医会根据病况选
择性使用何种外敷液及方中君药五爪龙用量。参考
相关文献芹菜素具有抗氧化、抑制致癌物活性、抗
炎、抗菌、抗病毒、抗焦虑、抗内毒素与免疫调节剂等
作用［3，4］;而槲皮素有抗癌防癌、镇痛、抗菌、抗病
毒、抗衰老、抗炎、抗过敏、抗自由基及抗氧化等多种
生物活性，且对人体无毒、无害、无致死、致癌、致畸、
致突变等作用［5，6］，而委陵菜属植物均含芹菜素、槲
皮素等［7］，据此建立薄层层析分离、HPLC法测定此
外敷液中芹菜素与槲皮素的含量，并对方法学进行
了考察［8］，结果表明，此法能迅速、准确测定芹菜素
与槲皮素在两外敷药液中的含量，初步探索了民间
药的有效成分分析与检测方法。
1 仪器与材料
1． 1 仪器
LC-20A高效液相色谱仪(日本)岛津;Ｒ-215 旋
转蒸发仪(瑞士)BUCHI;LD5-2A 离心机(北京医
用) ;HH-6 电子恒温水浴锅(苏州威尔实验用品有
限公司) ;MHA 型数显式恒温电热套(北京科伟永
兴仪器有限公司)。
1． 2 药品与试剂
乙醇、磷酸、盐酸、乙酸乙酯、石油醚、氯仿、甲酸
为国产分析纯，水为蒸馏水，甲醇为色谱纯;薄层层
析用硅胶(青岛海洋化工有限公司) ;羧甲基纤维素
钠(湘潭市森泰化工) ;芹菜素标准品(购于天津尖
峰天然产物研究开发有限公司，纯度≥98 %) ;槲皮
素标准品(批号:100081-200907，中国药品生物制品
鉴定所)。
五爪龙两外敷液按张家界市永定区沙堤乡汆水
溪村田中医提供的药方配制。
2 方法与结果
2． 1 色谱条件
色谱柱:Shim-pack VP-ODS C18(4． 6 mm × 150
mm，5 μm) ;柱温:30 ℃;流动相:甲醇-0． 4%磷酸
(50∶ 50，v ∶ v) ;流速:1． 0 mL /min;检测波长:360
nm;进样体积:10 μL。检测液进样前经 0． 45 μm滤
膜抽滤。
2． 2 标准品溶液的制备
精密称取于 60 ℃减压干燥至恒重的芹菜素与
槲皮素标准品各 20． 00 mg，混合置于 100 mL 容量
瓶中，乙醇溶解并定容，得两成分各 0． 2 mg /mL 的
混合标准品溶液，用 0． 45 μm滤膜抽滤，即得。
2． 3 供试溶液的制备
A液:按配方称取阴干水分新鲜五爪龙(15 g)
等草药混合，加入适量 50%乙醇捣碎，补充乙醇至
500 mL，密封后室温浸渍 8 h，三层脱脂棉纱布过虑;
B液:按配方称取阴干水分新鲜五爪龙(15 g)等草
药切碎、混合后加 500 mL 蒸馏水，温火煎煮至沸腾
后 30 min，趁热三层脱脂棉纱布过虑;两外敷液用 4
号新华滤纸抽滤，滤液再用旋转蒸发仪浓缩至 15 ～
30 mL。浓缩液依次用石油醚，氯仿萃取去杂后各
加入 25%盐酸 15 mL水浴回流水解 60 min，快速冷
却，离心(10 000 rpm)10 min，取上清液，用旋转蒸发
仪浓缩至 10 mL 左右，经硅胶 G 薄层层析，刮取与
芹菜素、槲皮素标准品相同 Ｒf0． 65 与 0． 53 的全部
芹菜素与槲皮素斑点［9］。溶解定容至 100 mL，摇
匀，用 0． 45 μm滤膜抽滤，即得。
2． 4 标准曲线的绘制
精密移取混合标准品溶液 0、0． 3、0． 6、0． 9、
1. 2、1． 5 mL，置于 10 mL 容量瓶中，乙醇稀释定容，
摇匀，配制成各 0、60、120、180、240、300 μg /mL的混
合溶液，按色谱条件分别进样检测［10］。以浓度(X)
为横坐标，峰面积积分值(Y)为纵坐标绘制标准曲
线，得回归方程:Y芹 = 16248X-50319，r = 0． 9998;
Y槲 = 160275X-43582，r = 0． 9996，线性范围为 60 ～
300 μg /mL。
2． 5 精密度试验
精密吸取混合标准品溶液 10 μL，按 2． 1 项色
谱条件连续重复进样 6 次，测定其峰面积，结果见表
1，芹菜素 ＲSD = 1． 641% (n = 6)、槲皮素 ＲSD =
1. 605%(n = 6) ，表明仪器精密度良好。
表 1 精密度测定结果
Table 1 Ｒesults of precision tests
名称 Name 1 2 3 4 5 6
浓度(Concentration，μg /mL) 200 200 200 200 200 200
芹菜素峰面积(Peak areas of apigenin) 3153628 3127985 3138969 3165813 3148749 3153265
槲皮素峰面积(Peak areas of quercetin) 3161762 3148513 3162691 3138179 3165258 3152387
2． 6 重现性试验
制取 6 份水煎样品溶液，按 2． 3 项实验室处理
后的滤液按 2． 1 项色谱条件测定其峰面积，结果外
敷汤液中芹菜素与槲皮素平均质量分数分别为
0. 078%、0． 106%，ＲSD 为 1． 463%、1． 378% (n =
6) ，表明本方法的重现性较好。
132Vol. 26 董爱文等:五爪龙外敷液中芹菜素与槲皮素的 HPLC测定
2． 7 稳定性研究
取 2． 3 项制备的两种供试溶液，按 2． 1 项色谱
条件，每隔 6 h 进样 10 μL(3 d 测 7 次) ，结果乙醇
外敷液 ＲSD为 2． 158%、2． 085%(n = 7) ，而水煎液
ＲSD为 1． 836%、1． 785%(n = 7) ，表明两种外敷液
中芹菜素与槲皮素在室温下 3 d内较稳定。
2． 8 加样回收率试验
同批次配制好的药方材料 12 份，各加入 0． 2
mg /mL的标准品混合溶液 5 mL 后按 2． 3 项的方法
制取乙醇与水煎外敷液各 6 份并处理外敷液，按
2. 1 项色谱条件测定，计算回收率，结果乙醇外敷液
中芹菜素与槲皮素平均回收率为 100． 7% 与
99. 3%，ＲSD为 1． 538%与 1． 865%(n = 6) ，水煎外
敷液中芹菜素与槲皮素平均回收率为 99． 2% 与
98. 6%，ＲSD为 2． 037%与 2． 107%(n = 6) ，因此本
法具有较好的回收率。
2． 9 样品测定
分别精密吸取标准品混合溶液与 2． 3 项的水煎
液与乙醇液各 10 μL，按 2． 1 项色谱条件进行检测，
其 HPLC检测图谱见图 1，以 6 mL /min与 12 min左
右所出峰的峰面积进行计算，结果水煎液中芹菜素
与槲皮素的质量分数为 0． 125%与 0． 131%，乙醇液
中芹菜素与槲皮素的质量分数为 0． 316% 与
0. 268%。
A B
C
1 2
1 2
145
135
125
115
105
95
85
75
65
55
45
35
25
15
0
-5
145
135
125
115
105
95
85
75
65
55
45
35
25
15
0
-5
145
135
125
115
105
95
85
75
65
55
45
35
25
15
0
-5
电
压（
m
v）
电
压（
m
v）
电
压（
m
v）
0% 1% 2% 3% 4% 5% 6% 7% 8% 9 10%11%12%13%14%15%16%17
时间（min）
0% 1% 2% 3% 4% 5% 6% 7% 8% 9 10%11%12%13%14%15%16%17
时间（min）
0% 1% 2% 3% 4% 5% 6% 7% 8% 9 10%11%12%13%14%15%16%17
时间（min）
1 2
图 1 标准品(A)、水煎液(B)及乙醇液(C)的 HPLC色谱图
Fig. 1 HPLC chromatograms of standard(A) ，water-decocted extract(B)and alcohol extract(C)
峰 1:芹菜素;峰 2:槲皮素
Peak 1:apigenin;Peak 2:quercetin
3 讨论
由于田老中医常年在乡间用草药五爪龙等的乙
醇液或水煎煮液外敷治疗山区农民的疮毒、痛肿及
蛇虫咬伤，其所用药料完全一致，只是方中所用溶剂
不同，而治疗效果差异明显;HPLC 检测的结果(图
1B、C)也显示溶剂不同外敷液中药效成分差异较
大，这与治疗时乙醇液比水煎液的治疗效果好是一
致的，而对两外敷液中其它药效成分还有待进一步
分析与检测。
本实验所用供试液完全按乡村中医提供的药方
和方法制备，并对外敷液中芹菜素与槲皮素进行了
初步纯化与薄层层析，使其达到能进行 HPLC 法检
测，分离纯化后的外敷液在室温下 3 d 内较稳定，这
与民间一副制剂用三天，一天外敷三到五次也是一
致的。
本实验建立的方法具有操作简便，能迅速、准确
测定两外敷药液中芹菜素与槲皮素的含量，其精密
度、重现性、回收率都较好，此为民间用药中有效成
分的分析与检测建立了初步方法。
参考文献
1 Wang BE(王兵娥) ，Huang DH(黄德红) ，Du SQ(杜双
全)． Study on the crude drugs feature of Potentilla kleini-
ana． Chin Pharm J(中国药学杂志) ，2005，4:261-264．
(下转第 272 页)
232 天然产物研究与开发 Vol. 26
一定参考价值。
参考文献
1 Wang QX，Li XK． Immunosuppressive and anti-inflammatory
activities of sinomenine． Int Immunopharmacol，2011，11:
373-376．
2 Lou YT，Zhou HB，Zou J，et al． Modification of poorly bioac-
tive sinomenine into more potent immunosuppressive agents
by embedding of drug-like fragments． Tetrahedron Lett，2010，
51:485-488．
3 Xiao J(肖靓) ，Deng ZS(邓张双) ，Li JX(李建新) ，et al．
Sinomenine based molecular design of anti-ＲA agents． J
Huazhong Normal Univ，Nat Sci(华中师范大学学报，自科
版) ，2009，43:83-91．
4 Bruce NC，Boonstra B，Ｒathbone DA． Engineering novel bio-
catalytic routes for production of semisynthetic opiate drugs．
Biomol Eng，2001，18(2) :41-47．
5 Chen L(陈磊) ，Liu Y(刘怡) ，Lu JQ(卢建秋) ，et al． Syn-
thesis of hydroxy-sinomenine by microbial transformation and
optimization of its transformation conditions． J Beijing Univ
TCM (北京中医药大学学报) ，2008，31:702-704．
6 Deng ZS，Li JX，Teng P，et al． Biocatalyzed cross-coupling of
sinomenine and guaiacol by Antrodiella semisupina． Org Lett，
2008，10:1119-1122．
7 Deng ZS，Zhao Y，He CC，et al． pH-Dependent，stereoselec-
tive dimerization of sinomenine． Org Lett，2008，10:3879-
3882．
8 Teng P，Liu HL，Deng ZS，et al． Synthesis and biological e-
valuation of unique stereodimers of sinomenine analogues as
potential inhibitors of NO production． Bioorg Med Chem，
2011，19:3096-3104．
9 Joyeau Ｒ，Planchon M，Abessolo J，et al． Combinatorial ap-
proach to the selection of active microorganisms in biotrans-
formation:Application to sinomenine． J Mol Catal B-Enzym，
2013，85-86:65-70．
10 Bao GH，Qin GW，Wang Ｒ，et al． Morphinane alkaloids with
cell protective effects from Sinomenium acutum． J Nat Prod，
2005，68:1128-1130．
11 Xiao L(肖靓) ，Deng ZS(邓张双) ，Li JX(李建新) ，et al．
Induced biotransformation of sinomenine by phenylenedia-
mine． J Huazhong Univ of Sci ＆ Tech，Nat Sci(华中科技大
学学报，自科版) ，2009，37(8) :
櫵櫵櫵櫵櫵櫵櫵櫵櫵櫵櫵櫵櫵櫵櫵櫵櫵櫵櫵櫵櫵櫵櫵櫵櫵櫵櫵櫵櫵櫵櫵櫵櫵櫵櫵櫵櫵櫵櫵櫵櫵櫵櫵櫵櫵櫵
125-128．
(上接第 232 页)
2 Yang B(杨滨) ，Yue CX(乐崇熙)． Morphological and histo-
logical studies on folium and stem of Potentilla． Chin Tradit
Herb Drugs(中草药) ，1994，25(1) :33-36．
3 Dong AW(董爱文)． Study on extraction，separation and pur-
ification of apigenin from Viola Yedoensis Makino． Hunan
Agric Univ(湖南农业大学) ，PhD． 2008．
4 Sun B(孙斌) ，Qu WJ(瞿伟菁) ，Zhang XL(张晓玲)． Api-
genin pharmacological research． J Chin Med Mater(中药
材) ，2004，27:531-534．
5 Zhao WZ(赵维中) ，Dei LM(戴俐明) ，Fang M(方明) ，et
al． The studies on pharmacokinetics of quercetin in rabbits．
Chin Pharm Bull(中国药理学通报) ，1992，8:452-455．
6 Wang YF(王艳芳) ，Wang XH(王新华) ，Zhu YT(朱宇
同)． Advancement of researches in quercetin． Nat Prod Ｒes
Dev(天然产物研究与开发) ，1991，22:182-184．
7 Gao W(高雯) ，Shen Y(沈阳) ，Zhang HJ(张红军) ，et al．
The chemical constituents of Potentilla chinensis． Pharm Care
Ｒes(药学服务与研究) ，2007，7:262-264．
8 Yi ＲQ(易润青) ，Song FY(宋粉云)． Determination of sai-
kosaponin a and saikosaponin d in Xiaochaihu granules by
capillary electrophoresis． Chin J Pharm(中国医药工业杂
志) ，2012，43:47-50．
9 Ma YD(马应丹) ，Chen YJ(陈悦娇)． Determination of
quercetin in Ginkgo biloba L． leaves by TLC-UV． J Zhongkai
Agrotech Coll(仲恺农业技术学院学报) ，2000，13(3) :43-
45．
10 Zhao YX(赵永昕) ，Patigul MHMT(帕提古丽·马合木
提) ，Mahbuba ABDＲYM(买合布白·阿不都热依木) ，et
al． Determination of quercetin in the different part of the Sor-
bus tianschanica L． by HPLC． Food Sci(食品科学) ，2006，
27:471-473．
272 天然产物研究与开发 Vol. 26