全 文 ：香草兰是最重要的食品香料之一， 广泛应用于
高档食品、 饮料和化妆品产业 [1]。 全世界有记录的
香草兰属植物共有 110 多种， 其中香草兰（Vanilla
planifolia Andrews， 又名 V. fragrans Salisb.）豆夹
在加工后含有高浓度的香兰素， 一般含量可以达到
1.7%～4.0％。 天然香兰素含有 200 种以上的香味成
分 [1-2]， 其品质是人工合成的单一成分香兰素无法
比拟的， 且具有安全可靠、 品质柔和等特点。 然
而， 香兰素在豆荚中以葡萄糖苷前体形式存在， 新
鲜豆荚没有香味， 必须经过 3～6 个月发酵过程，
热带作物学报 2012， 33（1）： 1-4
Chinese Journal of Tropical Crops
收稿日期： 2011-11-01 修回日期： 2011-12-26
基金项目： 海南省重点科技计划（No. KJXM20100003）； 中央级非赢利性研究所基本科研业务费专项（No. CATAS-ITBB KF1005）。
作者简介： 王庆煌（1963年—）， 男， 研究员。 研究方向： 农产品加工。 *通讯作者： 张家明， E-mail: jmzhang@vip.163.com。
香草兰 O-β-葡萄糖苷酶底物特异性和
温度稳定性研究
王庆煌 1， 农 汉 2，3， 初 众 1， 谭乐和 1， 张家明 1*
1 中国热带农业科学院香料饮料研究所国家热带作物工程技术研究中心 海南万宁 571533
2 中 国 热 带 农 业 科 学 院 热 带 生 物 技 术 研 究 所农业部热带作物生物学与遗传资源利用重点实验室 海南海口 571101
3 海南大学农学院， 海南海口 571101
摘 要 香草兰是最重要的食品香料之一， 其主要香味成分为香兰素， 主要存在于香草兰豆荚中。 香兰素一般
由成熟豆荚中的香兰素葡萄糖苷经过漫长的发酵过程转化而来。 O-β-葡萄糖苷酶在发酵生香的过程中起着关键
作用。 研究结果表明： 香草兰的根、 茎、 叶和豆荚中都具有 O-β-糖苷酶活性， 豆荚活性最高， 叶片活性最低；
来自不同器官的 O-β-糖苷酶的底物特异性一致， 都能降解香兰素糖苷、 2-NPG、 4-NPG， 都不能降解 n-OG 及
硫代葡萄糖苷； 香草兰糖苷酶提取物在 50～60 ℃处理 1 min， 对酶活性影响很小， 70 ℃处理 1 min， 酶活性丧失
约 40％， 说明香草兰糖苷酶对高温具有一定耐受性， 杀青后剩余糖苷酶活性在漫长的发酵过程中能够满足酶促
反应的需求。
关键词 香草兰； 香兰素； O-β-葡萄糖苷酶
中图分类号 Q55 文献标示码 A
Characterization of O-β-glucosidase Activity in Vanilla planifolia
and the change during the Curing Crocess of Vanilla Beans
WANG Qinghuang1, NONG Han2，3, CHU Zhong1, TAN Lehe1, ZHANG Jiaming1
1 National Center of Tropical Crops Engineering and Technology Research, Spice and
Beverage Research Institute, CATAS, Wanning, Hainan 571533, China
2 MOA Key Laboratory of Tropical Crops Biology and Genetic Resources, Institute of Tropical Bioscience
and Biotechnology, CATAS, Haikou, Hainan, 571101, China
3 College of Agriculture, Hainan University, Haikou, Hainan, 571101, China
Abstract Vanilla is one of the most important food spices. Its main aromatic component is vanillin, presented
mostly in the pods as a form of vanillin glucoside. The aroma is developed by months-long curing process in
which the glucovanillin becomes degraded by glucosidases, as well as other related reactions. Thus glucosidases
play a central role in the curing. We studied the enzymatic properties of the glucosidases in vanilla in this
research. Results indicated that all the tested organs of vanilla presented O-β-glucosidase activity, while the bean
has the highest activity, the stem and root had the moderate and the leaf had the lowest. The O-β-glucosidases
from all the tissues had the same substrate spetrum, in which glucovanillin, 2-NPG, 4-NPG were digested, but O-
β -glucoside, n -OG and O -β -thioglucosides were not degraded by vanilla O -β -glucosidases. Thermostability
experiment indicated that the O-β-glucosidases were relatively stable to short term high temperature treatment. No
obvious loss of activity was observed when the enzymes were treated at 50~60 ℃ for 1 min, and only 40% of
activity was lost when the enzymes were treated at 70 ℃ for 1 min. These results indicated that the internal O-β-
glucosidases were enough to the subsequent fermentation process after the killing.
Key words Vanilla planifolia; Vanillin; O-β-glucosidase
doi 10.3969/j.issn.1000-2561.2012.01.001
1- -
第 33 卷热 带 作 物 学 报
0.008
0.006
0.004
0.002
0
根 茎 叶 花 荚
酶
活
性
/[m
ol
/（
m
in·
m
g）
]





字母不同， 表示差异显著（p＜0.05）。 下同。
图 1 不同组织糖苷酶活性比较
a
b
c
d
e
才能产生香味物质 [3-4]。 一般认为， 糖苷香兰素是
在内源糖苷酶的作用下， 释放出香兰素， 因此， 糖
苷酶在发酵生香的过程中起着关键作用。 然而， 有
报道认为， 从香草兰豆夹中分离的糖苷酶不稳定，
在低温、 高温和低 pH 条件下都容易失活 [5]。 本研
究通过对香草兰糖苷酶活性特征的探讨， 为香草兰
加工工艺的改进提供参考。
1 材料与方法
1.1 材料
墨西哥香草兰（Vanilla planifola Andrews）， 采
自中国热带农业科学院兴隆热带植物园（E110°13′，
N18°15′）。 叶片、 茎、 气生根和花在 5 月取样。 未
成熟的豆荚在授粉后 3个月采样， 成熟豆荚在授粉
后 6个月采样。
1.2 方法
1.2.1 蛋白质提取和纯化 植物样品中加入 3倍体
积的蛋白质提取缓冲液（20 mmol/L Tris-HCl， pH8.0），
室温研磨， 收集到 10 mL 离心管中， 充分混匀，
12 000 r/min 常温离心。 上清液通过 Sephadex G25
柱层析去除糖类和次生代谢物， 收集含蛋白质的组
分， 用于酶活性测定。 蛋白质的浓度用 Bradford 法
测定（TIGEN公司）。
1.2.2 O-β-葡萄糖苷酶活性测定 分别使用香兰
素糖苷（glucovanillin， GV）、 n-辛基-β-D-吡喃葡萄
糖苷（n-octyl-β-D-glucopyranoside， n-OG）、 4-硝
基苯基-β-D-吡喃葡萄糖苷（4-nitrophenyl-β-D-
glucopyranoside， 4-NPG）和 2-硝基苯基-β-D-吡喃
葡萄糖苷（2-nitrophenyl -β-D-glucopyranoside， 2-
NPG）等 4种 O-β-葡萄糖苷， 以及丙烯基硫代葡萄
糖苷（sinigrin， 2-propenylglucosinolate）和苯甲基硫
代葡萄糖苷（bezylglucosinolate， GTP）等 2 种硫代葡
萄糖苷测定香草兰糖苷酶的底物特异性。 6 种底物
均购自西格玛公司（Sigma Chemical Co.， St. Louis，
MA， USA）。 底物浓度为 100 mmol/L。
每个酶反应体系包括 200 ng 溶于 50 mmol/L
Na-citrate（pH7.0）溶液的酶蛋白， 10 mmol/L 底物，
37 ℃温育 30 min， 95 ℃加热 5 min 使酶失活。 然后
加入葡萄糖检测试剂 （购自上海荣盛生物技术公
司）， 利用葡萄糖氧化酶法检测产生的葡萄糖， 在
505 nm 波长测定吸光值， 计算酶活性（每毫克蛋白
质每分钟产生葡萄糖量）。
1.2.3 温度对香草兰糖苷酶活性的影响 杀青温
度对香草兰糖苷酶活性的影响： 将香草兰 O-β-葡
萄糖苷酶溶液分别放置在 0、 30、 50、 60、 70 ℃水
浴中处理 1 min， 然后以 2-NPG 为底物， 在 37 ℃
测定酶活性。
温度对香草兰糖苷酶反应速率的影响： 以 2-
NPG 为底物， 将反应混合物置于不同的温度下反
应 30 min， 比较酶反应速率。
2 结果与分析
2.1 O-β-葡萄糖苷酶活性在香草兰植株中的分布
在预试验中， 发现香草兰的 O-β-葡萄糖苷酶
非常不稳定。 在 4、 -20 和-70 ℃保存香草兰豆荚
和其它组织样品数天， 糖苷酶活性急剧下降。 只有
用新鲜样品及 pH 值为 7 左右的缓冲液提取， 才能
提取到糖苷酶活性高的蛋白质。 由于香兰素主要存
在于豆荚中， 前人主要以香草兰豆荚为材料研究香
草兰糖苷酶 [3，5]， 对于其它器官糖苷酶活性研究很
少。 本研究分别从香草兰根、 茎、 叶和豆荚提取蛋白
质， 柱层析纯化后分别测定糖苷酶活性。 结果表明，
从豆荚提取的蛋白质的糖苷酶活性最强， 根和茎中
的糖苷酶活性次之， 叶片糖苷酶活性最弱， 几乎难
以检测到， 统计分析结果表明， 从不同组织提取的
蛋白质， 糖苷酶活性差异显著（图 1）。
2.2 香草兰 O-β-葡萄糖苷酶底物特异性
有些植物的 O-β-葡萄糖苷酶能降解硫代葡萄
糖苷[6]， 部分硫代葡萄糖苷酶也被证实具有微量的
O-β-葡萄糖苷酶活性 [7-8]， 说明不同类型糖苷酶底
物范围具有一定重叠。 笔者测试了香草兰糖苷酶对
6种糖苷的降解能力， 包括 2种硫代葡萄糖苷 sinigrin
和 glucotropaeolin（GTL）。 结果表明， 香草兰糖苷酶
不能降解硫代葡萄糖苷（图 2）， 是典型的 O-β-葡
萄糖苷酶。 然而， 也不是所有的 O-β-葡萄糖苷都
能被香草兰糖苷酶降解， 在测试的 4 种 O-β-葡萄
2- -
第 1 期
糖苷中， 香草兰糖苷酶能降解香兰素糖苷 （GV）、
2-NPG 和 4-NPG， 而降解 n-OG 的能力非常弱
（图 2， 3）。 来自根、 茎和豆荚的糖苷酶作用底物
范围相似（图 2）。 不同发育时期的豆荚， 其糖苷酶
的底物特异性也保持不变（图 3）。
2.3 温度对香草兰糖苷酶活性的影响
香草兰新鲜豆荚一般没有香味， 必须经过高温
杀青、 干燥以及长达数月的发酵过程， 储存在豆荚
中的香兰素糖苷才能转化为香兰素 [3，5]。 在这个转
化过程中， 糖苷酶起关键作用。 然而， 由于发酵生
香前需要使用 65~85 ℃的温度进行短时间的杀青[9]，
因此， 糖苷酶对高温的耐受性就显得很重要。 笔者
研究了香草兰糖苷酶对温度的抗性。 将香草兰糖苷
酶在不同温度处理 1 min 后， 在 37 ℃测定酶活性。
结果表明， 香草兰糖苷酶 30～60 ℃处理 1 min， 酶
活性基本不变； 70 ℃处理 1 min， 酶活性丧失约
40％， 80℃及 80℃以上处理 1 min， 酶活性基本丧
失（图 4）。 因此， 采用目前加工中常用的杀青程序
65～70℃杀青 1 min， 剩余 60％左右的糖苷酶活性，
在随后漫长的发酵生香过程中， 能够满足酶促反应
的需求。
将反应混合物置于不同的温度下反应 30 min，
比较酶反应速率。 结果表明， 在温度低于 20 ℃和
高于 70 ℃的条件下， 酶活性很低， 最佳反应温度
在 60 ℃左右（图 5）， 50 ℃酶活性也较高。 这与香
草兰豆荚发酵生香过程中采用较高温（50～60 ℃）发
酵是一致的 [9]。 较高发酵温度不仅会加速香兰素糖
苷的分解， 还能有效抑制微生物的污染和虫蚀。
3 讨论与结论
香草兰豆荚中的香兰素以葡萄糖苷的形式存
在， 必须经过发酵生香的过程才能释放。 发酵过程
中 O-β-葡萄糖苷酶起非常重要的作用。 有不少报
道认为香草兰的 O-β-葡萄糖苷酶非常不稳定， 在
豆荚储存和加工过程中容易失去活性[3，5]， 特别是在
杀青处理后， 豆荚中的 O-β-葡萄糖苷酶活性几乎
丧失殆尽 [10-11]， 因此， 有人认为来自微生物的外源
糖苷酶在香兰素的形成中起重要作用[12]。 然而， 笔者
根据目前加工中常用的杀青程序 65～70℃杀青 1min，
将糖苷酶在 70 ℃处理 1 min 后 ， 酶活性损失仅
40％左右。 因此， 使用常规的杀青程序， 足以满足
随后的发酵生香需要。 而我们提取的香草兰糖苷酶
的最佳反应温度为 60 ℃， 与传统发酵工艺所使用
的温度一致。 符伟等[9]报道对香草兰成熟豆荚采用
根
茎
叶
荚
GTL Sinigrin GV n-OG 2-NPG 4NPG
图 2 香草兰 4 种器官糖苷酶的底物特异性
CK GTL Sinigrin GV n-OG 2-NPG 4NPG
小青荚
中青荚
大青荚
小青荚（授粉后 1 个月）， 中青荚（授粉
后 3 个月）， 大青荚（授粉后 6 个月）。
图 3 不同发育时期豆荚糖苷酶的底物特异性
aaa
c
a
b
c

0.018
0.015
0.012
0.009
0.006
0.003
0
0 30 50 60 70 80 90
温度/℃
酶
活
性
/[m
ol
/（
m
in·
m
g）
]
图 4 杀青温度处理对香草兰 O-β-葡萄糖苷酶活性的影响
aa
c
b
de酶
活
性
/[m
ol
/（
m
in·
m
g）
] 0.02
0.015
0.01
0.005
0
0 20 30 40 50 60 70 80 90
温度/℃
cd
图 5 温度对香草兰 O-β-葡萄糖苷酶反应速率的影响
王庆煌等： 香草兰 O-β-葡萄糖苷酶底物特异性和温度稳定性研究 3- -
第 33 卷热 带 作 物 学 报
80℃杀青 40 s 或 85℃杀青 30 s 所获得的豆荚品质
最佳。 这似乎与本研究发现的香草兰糖苷酶在 80℃
处理 1 min， 酶活性几乎丧失殆尽矛盾。 然而， 将
生豆荚放入 80℃水中， 豆荚温度升到 80 ℃需要一
定时间。 由于处理时间短， 而糖苷酶及香兰素糖苷
都位于豆荚内部， 因此不至于对糖苷酶造成大的破
坏。 关于香草兰糖苷酶最佳反应温度， Odoux等[3]报
道从豆荚中分离纯化的一种糖苷酶最佳反应温度为
40 ℃。 产生差异的原因可能是豆荚中含有多种糖
苷酶， Odoux 等研究所分离的糖苷酶可能不是在发
酵过程中起作用的酶， 该酶在豆荚杀青阶段可能就
已失去活性。
通过对香草兰 O-β-葡萄糖甘酶的研究， 发现
香草兰的根、 茎、 叶和豆荚中都具有 O-β-糖苷酶
活性， 豆荚活性最高， 叶片活性最低。 来自不同器
官的 O-β-糖苷酶的底物特异性一致， 都能降解香
兰素糖苷、 2-NPG、 4-NPG， 都不能降解 n-OG 及
硫代葡萄糖苷。 香草兰糖苷酶提取物在 50～60 ℃处
理 1 min， 对酶活性影响很小， 70 ℃处理 1 min，
酶活性丧失约 40％， 说明香草兰糖苷酶对高温具
有一定耐受性， 杀青后剩余糖苷酶活性在漫长的发
酵过程中能够满足酶促反应的需求。
参考文献
[1] Sinha A K， Sharma U K， Sharma N. A comprehensive review
on vanilla flavor: extraction， isolation and quantification of
vanillin and others constituents[J]. International Journal of Food
Sciences and Nutrition， 2008（59）： 299-326
[2] Sostaric T， Boyce M C， Spickett E E. Analysis of the volatile
components in vanilla extracts and flavorings by solid -phase
microextraction and gas chromatography[J]. Journal of Agricultural
and Food Chemistry， 2000（48）： 5 802-5 807.
[3] Odoux E， Escoute J， Verdeil J L， et al. Localization of beta-
D -glucosidase activity and glucovanillin in vanilla bean
（Vanilla planifolia Andrews） [J]. Ann Bot， 2003 （92）： 437-
444.
[4] Sreedhar R V， Roohie K， Venkatachalam L， et al. Specific
pretreatments reduce curing period of vanilla（Vanilla planifolia）
beans[J]. J Agric Food Chem， 2007（55）： 2 947-2 955.
[5] Dignum M J， Kerler J， Verpoorte R. Beta -glucosidase and
peroxidase stability in crude enzyme extracts from green beans
of Vanilla planifolia Andrews[J]. Phytochem Anal， 2001（12）：
174-179.
[6] Bednarek P ， Pislewska -Bednarek M ， Svatos A， et al . A
glucosinolate metabolism pathway in living plant cells mediates
broad-spectrum antifungal defense [J] . Science ， 2009 （323）：
101-106.
[7] Andersson D， Chakrabarty R， Bejai S， et al. Myrosinases
from root and leaves of Arabidopsis thaliana have different
catalytic properties[J]. Phytochemistry， 2009（70）： 1 345-1 354.
[8] Nong H， Zhang J， Li D， et al. Characterization of a novel
β-thioglucosidase CpTGG1 in Carica papaya and its substrate-
dependent and ascorbic acid -independent o -β -glucosidase
activity[J]， J Integr Plant Biol， 2010， 52（10）： 879-890.
[9] Fu W. Influence of different green -removing process on the
quality of vanilla bean pod （Vanilla Planifolia Andrews） [J].
Natural Science Journal of Hainan University， 2002， 20 （3）：
258-261
[10] Hanum T. Changes in vanillin and activity of β-glucosidase
and oxidases during post harvest processing of vanilla beans
（Vanilla planifolia）[J]. Bull Teknol Ind Pangan， 1997（8）：46-52.
[11] Márquez O， Waliszewski K N. The effect of thermal treatment on
β-glucosidase inactivation in vanilla bean （Vanilla planifolia
Andrews）[J]. Int J Food Sci & Tech， 2008， 43（11）： 1 993-1 999.
[12] Roling W F， Kerler J， Braster M， et al. Microorganisms with
a taste for vanilla： microbial ecology of traditional Indonesian
vanilla curing [J ] . Appl Environ Microbiol ， 2001， 67 （5 ） ：
1 995-2 003.
责任编辑： 古小玲
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