全 文 ：花分生组织特征基因 LEAFY(以下简称 LFY 基因)
在成花相关基因的调控网络中处于关键位置[1]， 是
植物从营养生长到生殖生长转变调节的中心， 并且
参与到多条花芽分化与成花诱导途径中， 其表达始
香草兰 VpLFY基因的克隆与表达分析①
顾文亮 1,2)②王 辉 1,3)庄辉发 1,3)
王 华 1,3)朱自慧 1,3)宋应辉 1,2,3)③
(1 中国热带农业科学院香料饮料研究所 海南万宁 571533；
2 农业部香辛饮料作物遗传资源利用重点实验室 海南万宁 571533；
3 海南省热带香辛饮料作物遗传改良与品质调控重点实验室 海南万宁 571533)
摘 要 花分生组织特征基因 LEAFY 在植物花芽分化与成花诱导途径中起着重要的调控作用。 通过 RACE方法
从香草兰中克隆 VpLFY 基因的全长 cDNA序列。 结果显示， 该基因包含一个 1493bp的开放阅读框， 编码 491
个氨基酸残基。 经蛋白质序列同源比对分析结果发现， VpLFY属于 FLO-LFY家族。 组织特异性研究结果表明，
VpLFY 基因在香草兰组织中属于组成型表达。 荧光定量分析结果表明， VpLFY 基因分别在香草兰纯花芽和混合
花芽的不同发育阶段中有着较强的表达。
关键词 香草兰 ； VpLFY ； 基因克隆 ； 表达分析
分类号 S682.31Doi ： 10.12008/j.issn.1009-2196.2016.02.006
Molecular Cloning and Expression of VpLFY Gene from Vanilla
（Vanilla planifolia Andrews）
GU Wenliang1,2) WANG Hui1,3) ZHUANG Huifa1,3)
WANG Hua1,3) ZHU Zihui1,3) SONG Yinghui1,2,3)
(1 Spice and Beverage Research Institute, CATAS, Wanning, Hainan 571533;
2 Key Laboratory of Genetic Resources Utilization of Spice and Beverage Crops,
Ministry of Agriculture, Wanning, Hainan 571533;
3 Hainan Provincial Key Laboratory of Genetic Improvement and Quality Regulation
for Tropical Spice and Beverage Crops, Wanning, Hainan 571533)
Abstract Floral meristem identity gene LEAFY is a master regulator of flower bud differentiation and
floral induction. In this study, we report the molecular characteristics of LFY gene cloned from Vanilla
（Vanilla planifolia Andrews） using a RACE-PCR based strategy. VpLFY contained an open reading
frame of 1 493 bp which encoded a polypeptide of 491 amino acids. Protein alignment showed that VpLFY
contained typical domains which belonged to FLO-LFY protein family. Tissue-specific studies showed that
the expression of VpLFY was constitutive expressed in various tissues of Vanilla. Fluorescent quantitative
PCR analysises indicated that the expression of VpLFY were increased in reproductive bud and mixed bud
at different stages of Vanilla flower bud differentiation. These results suggest that VpLFY may play an
important role in the regulation of Vanilla flower bud differentiation and floral induction.
Keywords Vanilla planifolia Andrews ; VpLFY ; gene clone ; expression analysis
Vol．36, No．2
2016年2月 热 带 农 业 科 学
CHINESE JOURNAL OF TROPICAL AGRICULTURE
第36卷第2期
Feb． 2016
① 基金项目： 海南省自然科学基金项目 “基于转录组测序的植物激素调控香草兰花芽分化研究” (No.314131)。
收稿日期： 2015-11-18； 责任编辑/黄东杰； 编辑部 E-mail: rdnk@163.com。
② 顾文亮(1984～)， 男， 博士， 助理研究员， 主要研究方向为作物遗传育种。
③ 通讯作者。 E-mail: songyh343@sohu.com。
31- -
2016年2月 第36卷第2期热带农业科学
终贯穿于花序分化和成花发育的各个阶段， 被认为
是成花转变的标志性基因[2]。 LFY 基因不仅促进花
分生组织的形成及其属性的调控， 而且参与维持花
分生组织的功能、 成花基因的启动和防止花分生组
织的逆转， 同时参与花分生组织属性的决定及其进
一步发育[3]。
香 草 兰(Vanilla planifolia Andrews)是 兰 科
(Orchidaceae)香草兰属(Vanilla)热带攀援藤本植
物， 被誉为食品香料之王， 广泛用于食品、 饮料、
化妆品和医药等行业中[4]。 香草兰的花芽分化与成花
诱导过程中存在着营养生长向生殖生长转变不彻底
的现象， 这极大影响着生产种植上香草兰的产量[5]。
LFY基因在植物花芽分化与成花诱导途径中发挥着
重要的作用。 目前尚无香草兰 VpLFY 基因的相关
研究报道， 克隆香草兰 VpLFY 基因的全长序列并
分析其功能， 将有助于解析香草兰花芽分化与成花
诱导的分子机理。 本研究基于香草兰转录组测序信
息， 通过3′RACE和5′RACE方法从香草兰中克隆了
一个 VpLFY 基因， 采用荧光定量分析该基因的表
达模式， 探讨 VpLFY基因在香草兰中的表达特征，
有助于进一步解析香草兰花芽分化与成花诱导的调
控机理。
1 材料与方法
1. 1 材料
供试植株为生长3a以上的墨西哥香草兰， 种
植在海南省万宁市南桥高龙的香料饮料研究所基地
中， 所有供试的香草兰植株均为荫蔽条件下露地栽
培。 总RNA的提取选取花芽分化初期的香草兰花芽
组织。 选择长势良好且大小一致的香草兰植株， 选
取花芽分化不同阶段的纯花芽、 混合花芽和叶芽等
芽体组织。 对香草兰花芽分化进行连续观测至花分
生组织分化， 通过芽体组织的生长量及观测数据将
香草兰花芽分化过程划分为6个时期， 分别为花芽
特征分化期(I)、 花芽分化初期(II)、 花芽分化中
期(III)、 花序分化初期(IV)、 花序分化中期(V)、
花分化初期(VI)[6]。 在香草兰花芽分化的6个时期
中， 分别采集花芽、 混合花芽和叶芽的芽体组织各
6个待测样品， 取样的芽体组织用液氮快速冷冻后
放入-80℃超低温冰箱中贮存。 取样的芽体组织用
液氮快速冷冻后放入-80℃超低温冰箱中贮存。
1. 2 方法
1. 2. 1 香草兰花芽组织总 RNA的提取
香草兰花芽组织总 RNA的提取采用 RNeasy
Plant Mini Kit(Qiagen)进行， 具体提取步骤参照
该试剂盒说明书， 对提取后的总RNA进行分光光度
计和电泳分析。
1. 2. 2 香草兰 VpLFY基因的克隆与分析
按照香草兰的转录组测序结果设计 3′RACE与
5′RACE引物， 3′RACE扩增的引物序列为LFY-F1(5′
-CAAGTGCCCCACCAAGGTGACGAACC-3′)和 LFY-F2(5′
-CAAGCCCAAGATGCGGCATTACGTG-3′)， 5′R CE扩增的
引 物 序 列 为 LFY-R1(5′-GGTCCTTGGCGACGGCTTG-
GACTT-3′ )和 LFY-R2 (5′ -GAGGAGGAACTCGTG-
GCATTGCTCGTAG-3′)。 按照 eneRacer Kit(Invitro-
gen)说明书进行 RACE扩增反应。 分别将 3′RACE和
5′RACE扩增得到的特异条带切胶回收， 连接 pLB
Simple载体(天根)， 转化感受态细胞后送往生工生
物工程(上海)股份有限公司进行测序。 DNA序列经
测序后在 NCBI数据库 BLASTn和蛋白数据 库
BLASTx中进行同源核苷酸和蛋白质序列检索。
1. 2. 3 香草兰 VpLFY基因的表达分析
选择不同花芽分化阶段的叶芽、 花芽与混合花
芽等芽体组织， 按照 RNeasy Plant Mini Kit(Qia-
gen)的说明书分别提取总 RNA， 用 RevertAidTM
First Strand cDNA Synthesis Kit(Fermentas)合成
cDNA第一链。 以 VpActin基因为内参基因， 采用荧
光定量 PCR方法对 VpLFY 基因的组织特异性表达
和不同分化阶段的表达特征进行分析。 检测 VpLFY
基因的引物序列为 VpLFY-F(5′ TGAGGGAGGAGGAG-
GTSGACGAYATGAT-3′)和 VpLFY-R(5′ AGATBGAGAG-
GCGSGGATGSGCGTTGAA-3′)。 内参基因 VpActin 的引
物序列为 VpActin-F(5′-GGGTTACTCCTTTACGACCA-
CA-3′)和 VpActin-R(5′-GGGTTACTCCTTTACGACCA-
CA-3′)。 采用SYBR Green荧光染料， 荧光定量PCR
的反应程序为： 95℃预变性 3min， 95℃变性 7s，
60℃退火15s， 72℃延伸20s， 共40个循环。
1. 2. 3 数据处理与统计分析
每个实验处理均做3次生物学重复， 采用Excel
2010软件处理实验数据与图表。
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顾文亮 等 香草兰 VpLFY 基因的克隆与表达分析
2 结果与分析
2. 1 总 RNA的提取
以 1%的琼脂糖凝胶电泳检测提取的香草兰花
芽组织总 RNA(图 1)， 28S和 18SRNA的条带完整
且边缘清晰， 说明总 RNA样品具有较好的完整性。
经分光光度计检测， 提取总 RNA的 OD260/OD280均
在1.7～2.0， 说明总RNA样品纯度较高。
2. 2 VpLFY基因的克隆与序列分析
在香草兰花芽分化组织的转录组测序基础上，
通过3′RACE扩增出一条特异性条带， 大小约700bp
(图 2)， 通过 5′RACE扩增出一条特异性条带， 大
小约 1100bp(图 3)。 将上述特异 DNA片段经测序
后拼接， 通过 BLAST比对发现该序列与其他植物
LFY基因序列具有较高的同源性， 表明该序列是香
草兰 LFY 基因编码框全长 cDNA， 命名为 VpLFY。
VpLFY 序列全长为 1 708 bp， 其中 5′非编码区为
38bp， 3′非编码区为 197 bp， 经分析可知 VpLFY
基因ORF长度为1473bp， 编码491个氨基酸残基。
根据生物信息学分析， 预期分子量为54.13ku， 等
电点为7.13。
在 NCBI中对 VpLFY蛋白质进行同源性分析，
由图4可知， VpLFY蛋白与拟南芥、 番茄、 玉米和
蝴蝶兰的LFY均存在同源性较高的保守氨基酸序列
位点。 另外， 在NCBI中对VpLFY蛋白质保守结构域
搜索， 结果表明， VpLFY蛋白质属于FLO-LFY家族。
2. 3 VpLFY基因的表达分析
采用荧光定量 RT-PCR方法， 以 VpActin 作为
内参基因 ， 分别对香草兰花芽分化不同组织中
VpLFY 基因的表达水平进行检测。 由图 5可知，
VpLFY 基因在所有香草兰花芽分化的组织中均有
表达， 其在纯花芽中表达量最高， 在茎段和气生根
中表达量较低。
采用荧光定量 RT-PCR方法， 以 VpActin 作为
内参基因， 分别对香草兰纯花芽、 叶芽和混合花芽
等芽体组织在不同分化阶段中 VpLFY 基因的表达
水平进行检测。 由图 6可知， VpLFY 基因在香草
兰花芽分化的不同阶段中均有表达， 其中纯花芽的
VpLFY 基因在花序分化初期(IV)表达量达到最高，
混合花芽的 VpLFY 基因在花分化初期(VI)表达量
达到最高， 叶芽的 VpLFY 基因在整个花芽分化不
同阶段表达量变化不大。
3 讨论与结论
LFY基因的首要功能是协同其他成花相关基因
图 1 香草兰花芽组织的总 RNA提取结果
图 2 3′RACE的琼脂糖凝胶电泳结果
说明： M为DL5000 DNA Marker， 1为3RACE扩增片段。
M 1
图 3 5′RACE的琼脂糖凝胶电泳结果
说明： M为DL5000 DNA Marker， 2为5′RACE扩增片段。
M 1
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2016年2月 第36卷第2期热带农业科学
抑制分生组织细胞向营养生长发育[7]。 研究结果发
现， 在成花转变前 LFY基因主要表达于叶原基， 当
其表达量达一定阈值时， LFY基因则起抑制叶原基
启动的作用， 从而有助于分生组织细胞形成花原基
[8]。 在植物成花诱导中， LFY 基因还参与维持花分
生组织的正常功能、 花启动、 防止花分生组织的逆
转[9]。 在模式植物拟南芥中， LFY 基因的表达最早
出现于花序分生组织下侧花原基萌发的部位， 但在
花序分生组织中无表达。 随着花分生组织的形成，
LFY基因的表达量也逐渐增加， 并分布于整个花分
生组织中； 当花器官原基开始分化出现时， LFY基
因的表达大部分消失[10]。
本研究克隆了一个香草兰花分生组织特征基因
VpLFY， 该基因全长1708bp， 包含一个
1473bp的完整读码框， 编码491个氨
基酸残基。 VpLFY 编码的氨基酸序列
的分子量为 54.13ku， 等电点为 7.13，
该序列与其他植物LFY均存在同源性较
高的保守位点， 均属于FLO-LFY蛋白家
族， 这表明本研究克隆的 VpLFY 属于
植物 LFY 基因。 对 VpLFY 基因在香草
兰中的组织特异性分析结果表明， 香草
兰花芽分化的纯花芽、 混合花芽、 叶芽、 茎段、 功
能叶和气生根中均能检测到 VpLFY 基因的表达，
这表明该基因在香草兰组织中属于组成型表达。 对
VpLFY基因在香草兰不同花芽分化阶段中的表达特
征分析结果表明， 香草兰的纯花芽在花芽分化前期
均有较高的 VpLFY 基因表达， 香草兰的混合花芽
图 6 VpLFY 基因在香草兰芽体组织中不同花芽分化阶段的表达情况
1.0
0.8
0.6
0.4
0.2
0.0均
一
化
的
倍
数
表
达 纯花芽 混合花芽 叶芽
Ⅰ Ⅱ Ⅲ Ⅳ Ⅴ Ⅵ
不同花芽分化阶段
图 4 VpLFY和其他植物 LFY的氨基酸序列比对分析
图 5 VpLFY 基因在香草兰不同花芽分化组织中的表达情况
1.2
1.0
0.8
0.6
0.4
0.2
0均
一
化
的
倍
数
表
达
纯
花
芽
混
合
花
芽
叶
芽
茎
段
气
生
根
功
能
叶
不同花芽分化组织
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顾文亮 等 香草兰 VpLFY 基因的克隆与表达分析
则在花芽分化后期有较高的 VpLFY 基因表达。 根
据上述结果推测， VpLFY 基因可能在香草兰的花
芽分化和成花诱导过程中发挥着重要的作用。
香草兰是兰科植物中最具经济价值的热带香料
作物。 已有研究结果表明， 香草兰营养生长向生殖
生长转变不彻底的现象极大影响着生产种植上香草
兰的产量[11]。 通过生物技术的手段为开展生产中的
香草兰促花栽培措施是一直以来的目标[12]。 本研究
克隆的 VpLFY基因及对其表达特征分析结果表明，
香草兰花分生组织特征基因 VpLFY可作为香草兰促
花栽培措施的参考基因， 通过检测 VpLFY基因的表
达强度可为生产上的生物技术促花栽培措施提供参
考借鉴， 这也是本研究下一步深入研究的方向。
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