全 文 ：返魂草提取物及其有效成分抗病毒机制的研究
李丽静　王继彦　王本祥　荣大奇　房金荣
(长春中医学院附属医院新药研究中心 ,吉林 长春 130021)
摘　要:目的 为了研究返魂草提取物及其有效成分抗病毒机制。方法 检测药物对流感病毒感染的 MDCK 细胞中病
毒的神经氨酸酶活性及对流感病毒增殖的影响 , 并观察了药物对新城鸡瘟病毒(NDV)诱生人全血细胞干扰素的影响。结
果 返魂草提取物及其有效成分(绿原酸 、咖啡酸)在浓度为 0.2、2、20、200 和 2000μg/m L时对感染流感病毒的 MDCK 细胞
中病毒的神经氨酸酶活性有抑制作用 ,对新城鸡瘟病毒(NDV)诱生人全血细胞干扰素作用有促进作用。
关键词:返魂草;绿原酸;咖啡酸;流感病毒
中图分类号:R284.2　文献标识码:A　　文章编号:1002-168X(2004)06-0065-02
Antivirus Mechanism of the Extract and Effective Components
of Senecio cannabifolius Less(SCL)
Li Lijing , Wang Benxiang ,Rong Daqi , Fang Jingrong
(Research Center o f New Drugs , Changchun College of T raditional Chinese Medicine, Changchun 130021)
ABSTRACT:Objective To study anti-virus mechanism of the ex tract and effective components of Senecio cannabifo lius Less
(SCL).Methods The sialidase activity of influenza virus and the virus replication in MDCK cells were detected.The effect of test
samples on a-interferon-inducing activity of NDV w as carried out.Results SCL extract , chlorogenic acid and caffenic acid all in-
hibited sialidase activity of influenza virus and the virus replication in MDCK cells at a dosage of 0.2 , 2 , 20 , 200 and 2000μgml-1.
In addition , all the samples can promote a interferon inducing activity by NDV.
KEY WORDS:Senecio cannabifolius less;chlorogenic acid;caffenic acid;influenza virus.
　　返魂草(Senecio cannabifolius Less.)是菊科千里光属植
物返魂草的干燥全草。本实验室已利用离体 、鸡胚和整体
等实验研究了其抗病毒作用 , 证明返魂草提取物具有抗病
毒作用 ,其抗病毒有效成分为咖啡酸和绿原酸 ,本文着重探
讨其抗流感病毒机制。
1.材料与方法
药品和试剂:返魂草提取物(本研究中心制剂室提供);
双黄连注射液(哈尔滨松花江制药厂);绿原酸 、咖啡酸(Sig-
ma):RPMI1640 培养基(GIBCO);PNP-NeuAc(日本北里
研究所惠赠 ,日本);干扰素标准品(北京生物制品药品检定
所)。
细胞:MDCK 细胞(犬肾传代细胞):购于中科院病毒
所;WISI细胞(人羊膜传代细胞:长春生物制品所惠赠)。
病毒:流感病毒(RMI 型 , 购于中科院病毒所);新城鸡
瘟病毒(NDV , 中国人民解放军农牧大学惠赠);水庖性口炎
病毒(长春生物制品所惠赠)
1.1 方法
1.1.1 对流感病毒神经氨酸酶的影响:将培养板中已
被流感病毒感染的 MDCK 单层细胞 ,(用 PBS(PH7.4)洗 3
次 ,然后加入 200μl包含 50nmolPNP-NeuAc 及含待测药
物的 PBS , 加入孵箱培养 15min 后 ,用酶标仪在 405nm 处测
P-nitrophenol(对硝基苯胺)的吸收度 , 同时设检品对照组。
神经氨酸酶抑制百分率 ,按以下方法计算:神经氨酸酶抑制
百分率%=[ (A -B)-(C -D)/(A -B)] ×100%(A:
405nm 只有酶 、没有检品对照品时的光吸收;B:405nm 没有
酶 、没有检品对照品时的光吸收;C:405nm 既有酶 、又有检
品对照品时的光吸收:D:405nm 没有酶 、只有检品对照品时
的光吸收)。
1.1.2 对M DCK 细胞中流感病毒繁殖量及细胞存活数
的影响:生长成单层的 MDCK 细胞 , 弃生长液 , 用 PBS 液
冲洗 3 次后 , 加入含 10PFU/m1 的病毒液的 PBS100μl(其
中包含 1%牛血清白蛋白)置4℃吸附 1h。吸附后的细胞用
PBS 洗涤 ,加入含 1%BSA、抗生素及含所试药物的维持液 ,
于 37℃、5%C02 培养箱培养 10 ～ 12h , 收集培养液 , 用 PFU
法测定病毒繁殖量。培养板中的细胞 ,用 PBS 洗去死细胞 ,
活的细胞用 MTT 法测得。
1.1.3.药物加入培养基的时间对 MDCK 细胞中流感
病毒繁殖量及细胞存活数的影响:生长成单层的 MDCK 细
胞 , 弃生长液 ,用 PBS 液冲洗 3 次后 , 加入 10PFU/ m1 的病
毒液 100μl(其中包含 1%牛血清白蛋白的 PBS)置 4℃吸附
1h。吸附后的细胞用 PBS 洗涤 , 加入 100μl培养液 , 分别在
0 、1、2、4、6 、8h 加入含所试药物的维持液 100μl , 于 37℃、
5%CO2 培养箱培养 10-12h , 收集培养液 , 用 PFU 法测定
病毒繁殖量。培养板中的细胞 ,用 PBS 洗去死细胞 ,活的细
胞用 MTT 法测得。
1.1.4.促 NDV 诱生人干扰素的作用:促 NDV 诱生
人单核细胞干扰素:健康成人肝素抗凝血 , 分离人外周血
白细胞 , 用生理盐水洗 3 次 , 调整白细胞浓度为 107/ m1 , 诱
生液为 RPM Ⅰ l640 营养液(内含 2%正常人 AB 血清)。加
入 48 孔培养板 , 每孔 100μl , 先加入干扰素 100U/ ml , 37℃
起启动 2h。然后加入各稀释度供拭品100μl ,最后加入新城
鸡瘟病毒 100血凝单位(HAU)/ ml10μl进行诱生 18-24h。
2000r/ min 离心 20min ,收获上清 , 调节 pH 至 2.0 , 放 4℃, 5
天使病毒灭活 , 然后再调至 pH7.2 ,滤过除菌 , 4℃保存[ 2] ;
65　Vo l.27.No.6.2004.11　　　　
陕　西　中　医　学　院　学　报
Journal of Shaanxi College of T raditional Chinese Medicine
　　　　　　　　　　　　　　　
DOI :10.13424/j.cnki.jsctcm.2004.06.039
人全血细胞干扰素的诱生:健康成人抗凝血 1:1 稀释 , 每孔
100μl ,其余步骤同上述方法。干扰素效价测定方法见参考
文献[ 5] 。
2.实验结果
2.1 对流感病毒神经氨酸酶的影响
由 Fig.1 可知 , 返魂草 、绿原酸 、咖啡酸在 0.02μg/ m1
时无抑制流感病毒神经氨酸酶的作用 ,而在 0.2 、2 、20 、200 、
2000μg/m1 剂量下均有抑制流感病毒神经氨酸酶的作用 ,
且呈量效关系。从总体来看 , 返魂草提取物的作用强于绿
原酸 ,而绿原酸强于咖啡酸。
2.2 返魂草提取物及其有效成分对 MDCK 细胞中流感
病毒繁殖量及细胞存活数的影响
我们研究了 SCL 对 MDCK 细胞中流感病毒复制的影
响:按前述方法培养 MDCK 细胞和感染病毒 , 4℃吸附 1h
后 ,从孵育后 6h 开始 , 可以在培养基中检测到病毒 , 并在
10h达到高峰(用 PBS 洗 2 次 , 在 37℃孵育后 ,从孵育后 6h
开始可以在培养基中检测到病毒 , 并在 10h 达到高峰(Fig.
2A);而当培养基中加入无毒浓度的返魂草提取物 、绿原酸 、
咖啡酸(剂量见 Fis , 2B)时 ,培养基中的病毒滴度明显降低
空白对照组的病毒滴度为 12.69x104PFU/ml , 而病毒滴度
最低为咖啡酸 200μg/ m1 组为 0.98x104PFU/ ml , 比对照组
低12.9倍 , 病毒滴度最高绿原酸 0.2μg/ m1 组为 4.59×
104PFU/ m1 , 比对照组低 2.8 倍(Fig.2B), 这说明 , 返魂草
提取物 、绿原酸 、咖啡酸具有抑制病毒繁殖量的作用。而
且 ,在病毒繁殖量被抑制的同时 , 细胞存活百分率明显提
高:细胞存活率由 22.1%(对照组)分别提高至最高 89.9%
(咖啡酸 200μg/ m1 剂量组)(Fig 。2C)
2.3 药物加入培养基中的时间对 MDCK 细胞中流感病
毒繁殖量及细胞存活数的影响
MDCK 细胞用 10PFU/ ml流感病毒感染于 4℃吸附 1h
后 , 37℃孵育 10h ,在 1、2 、4 、6 、8h、加入返魂草提取物 、绿原
酸 、咖啡酸。细胞吸附的病毒以神经氨酸酶(单位/孔)表
示 ,培养基中的病毒量 , 以 PFU/ m1 表示。由表 1可知在开
始时加入药物可以抑制细胞和培养基中的病毒量 , 而超过
6h 再加入药物 ,对病毒的繁殖量无明显影响。由此可推断
返魂草提取物复制的早期具有抑制作用。
2.4 促 NDV 诱生人单核细胞干扰素的作用
由 Fig3A(人单核细胞)、Fig3B(人全血细胞)可以看出 ,
返魂草提取物 、绿原酸 、咖啡酸(100ug/m1)均能不同程度
的促进 NDV 诱生人全血细胞及单核细胞产生干扰素 ,虽然
由于人的个体差异 , 结果比较复杂 ,但总的来说 , 干扰素产
生的量均比单独用 NDV诱生产生的量多 ,此干扰素经酸处
理及 56℃ 1小时处理 、初步鉴定为 IFN-α或 IFN-β。而
且在相同剂量下 ,人全血细胞产生的干扰素量要比单核细
胞产生的量多。
3.讨论
我们在研究返魂草抗病毒机理时发现:在孵育 0h 或 2h
后加入返魂草提取物 ,也就是在病毒复制的早期加入药物 ,
无论是培养基中的病毒量还是细胞吸附的病毒量均降低。
而且返魂草提取物对流感病毒神经氨酸酶的活性具有抑制
作用 ,由于流感病毒神经氨酸酶和病毒进入宿主细胞及子代
毒粒的释放有关 ,所以我们可以推测返魂草可抑制病毒进入
宿主细胞及子代毒粒的释放。近年来对用干扰素防治呼吸
道病毒感染进行了专门研究 , 并获得了较为满意的防治效
果。返魂草提取物可产生促 NDV 诱人干扰素。这些结果表
明返魂草抗流感病毒作用的机制可能与其抑制流感病毒神
经氨酸酶的活性 、对流感病毒复制早期的抑制和促 NDV诱
生人干扰素有关 ,在发挥其抗病毒作用的同时又可促进机体
产生干扰素 ,从不同途径发挥其抗病毒作用。
在抑制流感病毒神经氨酸酶活性的实验中 , 我们发现
返魂草 、绿原酸 、咖啡酸在相同剂量下作用相似 , 而在其他
实验中我们也发现了类似现象 ,这与我们预想的结果不同 ,
按照我们的预想 , 样品纯度越大活性应该越强 ,但绿原酸 、
咖啡酸总含量不超过 50%的返魂草提取物却有与纯品相
似的活性 , 推想可能是由于返魂草提取物中其他的成分相
互之间有促进或叠加作用 , 这也许是中药或中药复方药理
作用增强或改变的原因之一。中药对人免疫系统的影响是
近年研究的热点 , 在研究返魂草药理作用的同时 , 我们考虑
到返魂草在离体 、整体具有抗病毒活性的同时是否可以影
响机体的免疫功能 。干扰素是人体产生的一种可以广谱抗
病毒的一种细胞因子 ,所以我们观察了返魂草及其有效成
分的促诱生干扰素作用 ,而且初步鉴定不是γ型 , 但还不能
确定是 IFN-α还是 IFN-β , 或者是二者的混合物。根据
IFN-α对流感病毒的抑制作用最强。并且用新城鸡瘟病
毒诱生干扰素是生产 IFN-α的常用方法 , 推测可能是 IFN
-α, 这还有待我们在日后的工作中进一步研究。 在作诱生
干扰素实验的时候 ,我们同时用“杜平氏改良法”以抗凝人
全血细胞和单核细胞两种方法进行诱生 , 发现用人全血细
胞产生的干扰素量较大 , 这与杜平[ 2]的实验结果相似。推
测其原因 , 可能是由于白细胞处于血浆的自然环境中 , 其生
长代谢环境稳定 , 另外也满足了干扰素产生需含血清或血
浆的条件 , 同时相对保证了诱生细胞的数量 , 红细胞具有免
疫功能 , 至于红细胞在干扰素产生中的作用 , 则是需要进一
步探讨的问题。另外 , 返魂草提取物 、绿原酸 、咖啡酸是否
具有单独诱生干扰素的作用 , 也是我们需要进一步研究的
问题。对于返魂草 、绿原酸 、咖啡酸抗流感病毒的机理我们
还需要进一步从对流感病毒 RNA 聚合酶的影响 、对细胞融
合作用的影响及从对病毒基因的影响等方面进行研究。
参考文献:
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Yamada, Chem.Pham.Bull.38.1329(1990).
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[ 3] T.Nagai.Y.Miyaichi.T.Tomimori , Y.Suzuki , H.
Yamada, Chem.Pharm.Bull.38.1329(1990).
[ 4] 张均田 , 等.现代药理实验方法学[ M] .北京:北京
医科大学 、协和医科大学出版社 , 1998:1432.
[ 5] 张均田 , 等.现代药理实验方法学[ M] .北京:北京
医科大学 、协和医科大学出版社:1998:1409—1424.
(收稿日期:2004-06-09)
66 陕西中医学院学报　2004年第 27卷第 6期