全 文 ：反相高效液相色谱法测定甜叶菊中
Ａ苷甜菊糖和甜菊苷含量
邹盛勤，姜琼＊
（江西省天然药物活性成分研究重点实验室，宜春学院 化学与生物工程学院，江西 宜春　３３６０００）
摘要：采用超声辅助提取，建立甜叶菊中Ａ苷甜菊糖和甜菊苷的高效液相色谱分析方法。采用Ｋｒｏｍａ－
ｓｉｌ　Ｃ１８（４．６ｍｍ×２５０ｍｍ，５μｍ）色谱柱，以甲醇∶水 （７５∶２５，Ｖ／Ｖ）为流动相，流速１．０ｍＬ／ｍｉｎ，检
测波长２１０ｎｍ，柱温３０℃。Ａ苷甜菊糖进样量在０．８６８～８．６８μｇ时，与峰面积呈良好的线性关系（Ｒ
＝０．９９９），平均回收率为９７．５％，ＲＳＤ为１．８％（ｎ＝６）；甜菊苷进样量在１．００４～１０．０４μｇ时，与峰面积
呈良好的线性关系（Ｒ＝０．９９９），平均回收率为９５．６％，ＲＳＤ为１．６％（ｎ＝６）。该方法准确、操作简便，
可用于甜叶菊中Ａ苷甜菊糖和甜菊苷含量测定。
关键词：甜叶菊；Ａ苷甜菊糖；甜菊苷；高效液相色谱法；光电二极管阵列检测器；含量测定
中图分类号：ＴＳ２０２．３　　　文献标志码：Ａ　　　 ｄｏｉ：１０．３９６９／ｊ．ｉｓｓｎ．１０００－９９７３．２０１４．０６．０３２
文章编号：１０００－９９７３（２０１４）０６－０１２１－０３
Ｄｅｔｅｒｍｉｎａｔｉｏｎ　ｏｆ　Ｃｏｎｔｅｎｔ　ｏｆ　Ｒｅｂａｕｄｉｏｓｉｄｅ　Ａ　ａｎｄ　Ｓｔｅｖｉｏｓｉｄｅ
ｉｎ　Ｓｔｅｖｉａ　ｒｅｂａｕｄｉａｎａ　Ｂｅｒｔｏｎｉ　ｂｙ　ＲＰ－ＨＰＬＣ
ＺＯＵ　Ｓｈｅｎｇ－ｑｉｎ，ＪＩＡＮＧ　Ｑｉｏｎｇ＊
（Ｊｉａｎｇｘｉ　Ｐｒｏｖｉｎｃｉａｌ　Ｋｅｙ　Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ　ｏｆ　Ｒｅｓｅａｒｃｈ　ｏｎ　Ａｃｔｉｖｅ　Ｉｎｇｒｅｄｉｅｎｔｓ　ｉｎ　Ｎａｔｕｒａｌ
Ｍｅｄｉｃｉｎｅｓ，Ｃｏｌｅｇｅ　ｏｆ　Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ　ａｎｄ　Ｂｉｏｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ，
Ｙｉｃｈｕｎ　Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ，Ｙｉｃｈｕｎ　３３６０００，Ｃｈｉｎａ）
Ａｂｓｔｒａｃｔ：ＨＰＬＣ　ｍｅｔｈｏｄ　ｆｏｒ　ｔｈｅ　ｄｅｔｅｒｍｉｎａｔｉｏｎ　ｏｆ　ｒｅｂａｕｄｉｏｓｉｄｅ　Ａ　ａｎｄ　ｓｔｅｖｉｏｓｉｄｅ　ｉｎ　Ｓｔｅｖｉａ　ｒｅｂａｕｄｉａｎａ
Ｂｅｒｔｏｎｉ　ｉｓ　ｅｓｔａｂｌｉｓｈｅｄ　ｂｙ　ｕｌｔｒａｓｏｎｉｃ　ａｓｓｉｓｔｅｄ　ｅｘｔｒａｃｔｉｏｎ　ｍｅｔｈｏｄ．Ｔｈｅ　ｓｅｐａｒａｔｉｏｎ　ｉｓ　ａｃｈｉｅｖｅｄ　ｏｎ　ａ　Ｋｒｏ－
ｍａｓｉｌ　Ｃ１８ｃｏｌｕｍｎ（４．６ｍｍ×２５０ｍｍ，５μｍ）ａｔ　３０℃ｕｓｉｎｇ　ｍｅｔｈａｎｏｌ　ａｎｄ　ｗａｔｅｒ　ｓｏｌｕｔｉｏｎ（７５∶２５，
Ｖ／Ｖ）ａｓ　ｔｈｅ　ｍｏｂｉｌｅ　ｐｈａｓｅ　ａｔ　ａ　ｆｌｏｗ　ｒａｔｅ　ｏｆ　１．０ｍＬ／ｍｉｎ，２１０ｎｍ　ａｓ　ｔｈｅ　ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ　ｗａｖｅｌｅｎｇｔｈ．Ｒｅｂａｕ－
ｄｉｏｓｉｄｅ　Ａ　ｓｈｏｗｓ　ｇｏｏｄ　ｒｅｌａｔｉｏｎｓｈｉｐ　ａｔ　ｔｈｅ　ｒａｎｇｅ　ｏｆ　０．８６８～８．６８μｇ（Ｒ＝０．９９９），ｔｈｅ　ｒｅｃｏｖｅｒｙ　ｉｓ　９７．５％
ａｎｄ　ＲＳＤ　ｉｓ　１．８％ （ｎ＝６）．Ｓｔｅｖｉｏｓｉｄｅ　ｓｈｏｗｓ　ａ　ｇｏｏｄ　ｒｅｌａｔｉｏｎｓｈｉｐ　ａｔ　ｔｈｅ　ｒａｎｇｅ　ｏｆ　１．００４～１０．０４μｇ（Ｒ＝
０．９９９），ｔｈｅ　ｒｅｃｏｖｅｒｙ　ｉｓ　９５．６％ａｎｄ　ＲＳＤ　ｉｓ　１．６％ （ｎ＝６）．Ｔｈｅ　ｐｒｏｐｏｓｅｄ　ｍｅｔｈｏｄ　ｉｓ　ａｃｃｕｒａｔｅ，ｓｉｍｐｌｅ
ａｎｄ　ａｐｐｌｉｃａｂｌｅ　ｆｏｒ　ｔｈｅ　ｄｅｔｅｒｍｉｎａｔｉｏｎ　ｏｆ　ｒｅｂａｕｄｉｏｓｉｄｅ　Ａ　ａｎｄ　ｓｔｅｖｉｏｓｉｄｅ　ｉｎ　Ｓｔｅｖｉａ　ｒｅｂａｕｄｉａｎａ　Ｂｅｒｔｏｎ．
Ｋｅｙ　ｗｏｒｄｓ：Ｓｔｅｖｉａ　ｒｅｂａｕｄｉａｎａ　Ｂｅｒｔｏｎｉ；Ｒｅｂａｕｄｉｏｓｉｄｅ　Ａ；Ｓｔｅｖｉｏｓｉｄｅ；ＨＰＬＣ；ｐｈｏｔｏｄｉｏｄｅ　ａｒｒａｙ　ｄｅｔｅｃ－
ｔｏｒ；ｃｏｎｔｅｎｔ　ｄｅｔｅｒｍｉｎａｔｉｏｎ
１　概述
甜叶菊（Ｓｔｅｖｉａ　ｒｅｂａｕｄｉａｎａ　Ｂｅｒｔｏｎｉ）属菊科甜菊
属多年生草本植物。甜叶菊作为糖料植物，早在第二
次世界大战时就曾引起国际重视。１９７０年日本从巴
西引进甜叶菊，开始驯化、栽培、制苷，进行毒理、成分
检测等试验，并首先开发利用甜叶菊糖苷［１］。我国于
１９７６年从日本引种试种，并获成功。目前，除中国、日
收稿日期：２０１３－１２－１１　　　　　　　　＊通讯作者
作者简介：邹盛勤（１９７０－），男，教授，硕士，研究方向：天然产物活性成分提取与分析；
姜琼（１９８０－），男，讲师，硕士，研究方向：天然产物开发与研究。
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第３９卷 第６期
２０１４年６月
　　　　　　　　　　　　　　　中 国 调 味 品
Ｃｈｉｎａ　Ｃｏｎｄｉｍｅｎｔ 分析检测　　
本引种和推广外，韩国、泰国、菲律宾等国也有不同程
度的推广栽培［２］。甜菊苷是从甜叶菊中提取分离得到
的一系列四环二萜类化合物，甜度高，约为蔗糖甜度的
２５０～３００倍，而热量仅为蔗糖的１／３００，目前已经被很
多国家用来作为一种健康的甜味添加剂。甜菊糖苷类
化合物还具有抗高血压，抗血糖，抗肿瘤，抗腹泻以及
提高人体免疫力等临床疗效［３］。近年来，甜叶菊的成
分研究备受关注，分离得到的成分主要有挥发油、甾
醇、二萜类、三萜类、黄酮类、香豆素类等。目前甜叶菊
有效成分的研究主要集中在甜菊苷、莱鲍迪Ａ～Ｆ苷、
杜尔可Ａ苷等成分。杨全花等［４］对甜叶菊的化学成
分和甜度进行研究。刘超等［５］采用高效液相色谱法测
定甜叶菊糖中的甜菊苷和莱鲍迪苷 Ａ的含量。但采
用反相高效液相色谱法同时测定甜叶菊中 Ａ苷甜菊
糖和甜菊苷的含量尚未见文献报道。本实验拟采用超
声辅助提取，建立ＲＰ－ＨＰＬＣ法同时测定不同厂家甜
叶菊中Ａ苷甜菊糖和甜菊苷的含量，为甜叶菊有效成
分的研究开发及质量评价提供依据。
２　材料与方法
２．１　仪器与试剂
２．１．１　仪器
Ｗａｔｅｒｓ高效液相色谱仪（５１５型泵，２９９６ＰＡＤ检
测器，Ｅｍｐｏｗｅｒ中文色谱工作站）　美国 Ｗａｔｅｒｓ公
司；ＣＰ２２５Ｄ电子分析天平　德国Ｓａｒｔｏｕｒｉｕｓ公司 ；
ＦＹ１７７高速万能粉碎机　天津市泰斯特仪器有限公
司 ；ＲＯ－ＭＢ－１０Ｄ高纯水机　杭州永洁达膜分离设备
厂；ＳＫ２５１０ＨＰ超声波清洗器　上海科导超声仪器有
限公司。
２．１．２　试剂
甲醇为色谱纯　国药集团化学试剂有限公司；乙醇
为分析纯　江西洪都生物化学有限公司；磷酸为分析纯
　上海市试剂一厂综合经营公司；水为超纯水；Ａ苷甜菊
糖和甜菊苷对照品　上海阿拉丁试剂有限公司。
甜叶菊原料：市售，经鉴定为菊科甜叶菊Ｓｔｅｖｉａ
ｒｅｂａｕｄｉａｎａ　Ｂｅｒｔｏｎｉ的干燥叶。
２．２　溶液配制
２．２．１　对照品混合溶液
分别精密称定Ａ苷甜菊糖对照品８．６８ｍｇ，甜菊
苷对照品１０．０４ｍｇ，置于１０ｍＬ容量瓶中，加入适量
甲醇，超声溶解后加甲醇稀释至刻度，摇匀，即得含 Ａ
苷甜菊糖０．８６８ｍｇ／ｍＬ和甜菊苷０．１００４ｍｇ／ｍＬ的
对照品混合溶液。
２．２．２　样品溶液
甜叶菊样品于７０℃下干燥３ｈ，粉碎后过２０目
筛，备用。精密称取甜叶菊各样品粉末约１．０ｇ，分别
置于５０ｍＬ具塞锥形瓶中，加入９５％乙醇５０ｍＬ，称
重。超声（功率：２５０Ｗ，频率：５９ｋＨｚ）处理６０ｍｉｎ，放
冷，称重，用甲醇补足减失重量，摇匀，用０．４５μｍ滤
膜过滤，得甜叶菊样品溶液。
３　结果与分析
３．１　色谱条件
色谱柱为 Ｋｒｏｍａｓｉｌ　Ｃ１８柱（４．６ｍｍ×２５０ｍｍ，
５μｍ）；流动相为甲醇 ∶ 水 （７５∶２５，Ｖ／Ｖ）；流速
１．０ｍＬ／ｍｉｎ；检测波长２１０ｎｍ；柱温为３０℃。以 Ａ
苷甜菊糖和甜菊苷，理论塔板数分别为７０６８，８３７０，样
品中Ａ苷甜菊糖和甜菊苷与其它组分的分离度均大
于２．０，Ａ苷甜菊糖和甜菊苷的对称因子分别为１．００，
１．０６。对照品和甜叶菊样品色谱见图１。
0.0 5.0 10.0 15.0 20.0 25.0 30.0 0.0 6.0 12.0 18.0 24.0 30.0
时间（min）
A B
1
2
1
时间（min）
图１　对照品（Ａ）和甜叶菊样品（Ｂ）ＨＰＬＣ图
Ｆｉｇ．１ＨＰＬＣ　ｃｈｒｏｍａｔｏｇｒａｍｓ　ｏｆ　ｒｅｆｅｒｅｎｃｅ（Ａ）ａｎｄ　ｓａｍｐｌｅ（Ｂ）
　　注：１为Ａ苷甜菊糖；２为甜菊苷。
３．２　精密度试验
分别精密吸取２．２．１项下对照品混合溶液１０μＬ，
按选定的色谱条件连续进样５次，测定Ａ苷甜菊糖和
甜菊苷峰面积，计算 Ａ 苷甜菊糖和甜菊苷的峰面积
ＲＳＤ（ｎ＝５）分别为０．９％和０．７％。结果表明：进样方
法和仪器精密度良好。
３．３　重复性试验
取同一甜叶菊样品（厂家：怡花堂），平行取样
５份，每份各约２．５ｇ，按２．２．２项下方法制备甜叶菊
样品溶液。分别精密吸取１０μＬ，按选定的色谱条件
进样分析，依据峰面积积分值采用标准曲线计算Ａ苷
甜菊糖和甜菊苷含量，２组分含量的ＲＳＤ（ｎ＝５）分别
为２．０％和２．２％，表明样品制备方法重复性良好。
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分析检测　　第３９卷 第６期
２０１４年６月
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Ｃｈｉｎａ　Ｃｏｎｄｉｍｅｎｔ
３．４　检测波长的选择
采用二极管阵列检测器对对照品及样品进行三维
扫描，在１９０～６００ｎｍ波长范围内提取Ａ苷甜菊糖和
甜菊苷的紫外吸收谱图。对照品和样品中 Ａ苷甜菊
糖和甜菊苷的最大吸收波长均为１９９．９ｎｍ，但在短波
长处流动相有较强吸收，影响定量的准确性，选择
２１０ｎｍ作为检测波长，消除了流动相的吸收干扰，信
噪比高，待测组分分离良好。Ａ苷甜菊糖和甜菊苷紫
外吸收光谱见图２。
0.30
0.25
0.20
0.15
0.10
0.05
0.00
am
u
200.0 300.0 400.0
纳米
199.9
199.9
276.4
289.5
306.1 327.5339.5345.4 370.3
383.5
389.5
370.3
（nm）
图２　对照品中Ａ苷甜菊糖和甜菊苷紫外光谱
Ｆｉｇ．２ＵＶ　ｓｐｅｃｔｒｏｇｒａｍｓ　ｏｆ　ｒｅｂａｕｄｉｏｓｉｄｅｓ　Ａ　ａｎｄ
ｓｔｅｖｉｏｓｉｄｅ　ｉｎ　ｒｅｆｅｒｅｎｃｅ　ｓａｍｐｌｅｓ
３．５　加样回收率试验
精密称定同一种（厂家：艺福堂）已知Ａ苷甜菊糖
和甜菊苷含量的甜叶菊样品粉末约０．５ｇ，平行称定
６份，每份按高、中、低３种浓度分别加入 Ａ苷甜菊糖
和甜菊苷对照品适量，按２．２．２项下方法制备样品溶
液，按选定的色谱条件进样分析，测定峰面积，采用标
准曲线计算含量，求取待测组分的平均回收率。结果
Ａ苷甜菊糖和甜菊苷平均回收率分别为９７．５％和
９５．６％，ＲＳＤ（ｎ＝６）分别为１．８％和１．６％。
３．６　线性关系试验
精密吸取２．２．１项下配制的对照品混合溶液中
２，６，１０，１５，２０μＬ，按选定的色谱条件进样测定 Ａ苷
甜菊糖和甜菊苷的峰面积，以对照品的峰面积（μＶ·
ｓ）为纵坐标，进样量（μｇ）为横坐标进行拟合，绘制标准
曲线，得Ａ苷甜菊糖回归方程为：Ｙ＝２．３８×１０５　Ｘ ＋
３．９１×１０４（Ｒ＝０．９９９），甜菊苷回归方程为：Ｙ＝２．５０
×１０５　Ｘ－７．６８×１０４（Ｒ＝０．９９９）。表明Ａ苷甜菊糖进
样量在０．８６８～８．６８μｇ，甜菊苷进样量在１．００４～
１０．０４μｇ时，线性关系良好。
３．７　样品测定
取３个不同厂家甜叶菊样品，分别按２．２．２项下
方法制备样品溶液，精密吸取１０μＬ注入高效液相色
谱仪，重复进样３次，按选定的色谱条件测定 Ａ苷甜
菊糖和甜菊苷面积积分值，用标准曲线计算２组分的
平均含量，结果见表１。
表１　甜叶菊不同样品中Ａ苷甜菊糖
和甜菊苷的含量测定结果
Ｔａｂｌｅ　１Ｄｅｔｅｒｍｉｎａｔｉｏｎ　ｒｅｓｕｌｔｓ　ｏｆ　ｒｅｂａｕｄｉｏｓｉｄｅ　Ａ　ａｎｄ
ｓｔｅｖｉｏｓｉｄｅ　ｉｎ　ｄｉｆｆｅｒｅｎｔ　ｓａｍｐｌｅｓ
％
编号 生产厂家 Ａ苷甜菊糖含量 甜菊苷含量
１ 尚品 １０．１９２ －
２ 怡花堂 １２．９５４ －
３ 艺福堂 １０．９１１ －
４　结论
甜叶菊糖苷在水和甲醇中溶解度很大，从甜叶菊
中提取甜叶菊糖苷一般都用水或甲醇浸提。本实验以
乙醇为溶剂，采用超声醇提法，方法简便，设备简单，时
间短，提取率高，制备的样品溶液可直接进样分析。
不同甜叶菊样品中 Ａ 苷甜菊糖的含量均高于
１０％，但均未检出甜菊糖苷，Ａ苷甜菊糖为甜叶菊的主
要甜味成分，提示文献报道的甜叶菊糖中的甜菊苷可
能为分离提纯过程中Ａ苷甜菊糖的水解产物，在甜叶
菊中无游离存在。
本实验采用甲醇－水为流动相，在Ｃ１８柱上可将两
者完全分离，Ａ苷甜菊糖和甜菊糖苷的理论塔板数均
大于７０００，分离度大于２．０。本法定量准确，简单易
行，回收率高，可用于甜叶菊及其提取物中 Ａ苷甜菊
糖和甜菊苷的含量。
参考文献：
［１］孙传范，李进伟．甜菊糖苷研究进展［Ｊ］．食品科学，２０１０，３１
（９）：３３８－３４０．
［２］陈雪英，李页瑞，陈勇，等．近红外光谱法定量测定甜菊糖苷
的研究［Ｊ］．中国食品学报，２００９，９（５）：１９５－１９９．
［３］丁宁，郝再彬，陈秀华，等．中国甜叶菊及其糖苷的发展［Ｊ］．
上海农业科技，２００５（４）：８－１０．
［４］杨全花，陈光，任红梅，等．甜叶菊化学成分及其甜度的研
究［Ｊ］．北京化工大学学报，２０１２，３９（２）：１－７．
［５］刘超，李来生．高效液相色谱法测定甜叶菊糖中的甜菊苷和
莱鲍迪苷Ａ［Ｊ］．分析实验室，２００７，２６（７）：２３－２９．
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第３９卷 第６期
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