全 文 ：第 28 卷第 1期
2硬从又 年 2 月
水 产 学 报
J U OL A R N OFI FH E SR】 E S OF CI H NA
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文章编号 : 1〕仄) 一 0 6 15 ( 2 0 04 )0 1 一 X() 6 2 一 0 6
礁膜原生质体的分离及培养
谢恩义 , 马家海
(上海水产大学生命科学与技术学院 , 上海 2( KX为0)
摘要 : 为了开发礁膜 人工育苗的新技 术 , 以 4 % 果胶酶和 2% 纤维素酶的甘露醇溶 液 , 分离酶解经无菌处理 的礁
膜叶状体 , 在 40 m m of · L 一 ’ C a CI : , 0 . 7 m ol · L 一 ’ 甘露醇 . p H 5 . 5 , 温度 28 ℃ , 摇床速度 5 0r · m in 一 ’旋转 振荡 h3 的条
件下 , 1 . 09 湿重礁 膜可 获原生质体约 2 x l护 个 。 原生质体分离后依次用 比重为 1 . 030 、 1 . 0 26 、 1 . 0 2 的消毒海水
(添加 N 、 P 、 eF Z + 、 IA A 、 K B 、 iV t C )培养 , Zd 后 已形成 明显 的再生细胞 壁 , 3 一 4 d 后细 胞开始分裂 , d8 后形成 由 4
一 8 个细胞组成的细胞团 , 以后原生质有不同的发育形态 , 较常见 的是形成由一 共同胶质膜包被 的类似 亲本 的
叶状体组织块 , 另一种是原生质体形成抱 子囊 ,成熟后 , 可产生许多游动抱子 , 再由游动袍子发育成正 常形态 的
膜状配子体 ,第 三种发育形态为偏离 亲本 正常形态的管状体 。
关键词 :礁膜 ; 原生质体 ; 酶解 ; 分离 ; 培养
中图分类号 : 09 4 2
.
5 文献标识码 : A
I S 0 18 it o n a n d
材d n o s t r .o m a
c ul it v a t i o n o f P r o t o P l a s ts o f
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: I n o dr e r to d e v e l o P a n e w e u l t iv a t i o n t e e h n o lo g y o f M 口on
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i s o l a et an d e u lit v aet th
e P or t o P las t s o f ht i s g er e n al g a
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2 8℃ an d s o r · m in 一 ’ s h砍e r s讲 e d fo r 3 h o u sr , w it h a y ie ld o f Z x l 06 s p h e ir e al ,
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d e c er a s e d for m 1
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P r o to P la s t s u s u a l l y b e gan to fo mr
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n t er P e a te d e e ll d i v i s i o n s an d d e v e lo P e d d ier e t ly t o a
m o n o s tor m a ti e ht al l u s e e l l e l u s t e sr hw
e er t h e e e l l n u m be r w as di fe er
n t an d a l l e e ll s w r a P by a c o m m o n g e la ti n e
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So m e Por t o Pl a s t s fo mr
e d a e e l l w al l an d ht e n d e v e l o Pe d i n to s P o anr g i
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.
A ft e r s P o anr g i
a m at u er d
,
t h e y libe ar t e d
收稿日期 : 2 0 3一 01 一 20
资助项 目 : 浙江省科委科技兴海专项项 目 ( 2斌X ) 2 (只 )
作者简介 : 谢恩义 ( 196 一 ) , 男 , 湖南邵阳人 , 副教授 , 在职博士生 , 从事水产增养殖及生物技术研究 。 E 一 m ial : 、 ie ny i@ soh 。
.
c o m
通讯作者 : 马家海 ( 194 0 一 ) , 男 , 教授 ,博导 , 从事水产植物种苗工程及增养殖研究 。 E 一m ial : mj h 25 @ sh 163 . n et
1期 谢恩义等 :礁膜原生质体的分离及培养
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st ht as et ledn ag dr ew int t h oa l ls u5 1而 lr at ot h ePr e ant t h a l ls uin s s e e e usiv e e u lt U r es. h T et hi r d
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r s d :材。n ost r oz n an it 记 um :Pr ot oP ls at ; z n eym oy lsi s; i s o lt i an o; e u lt iv at in o
礁膜( M on ot sr oz I T an it 记 um wt i r. ) 是一种分布
很广 的海洋经济绿藻 。 在 日本礁膜 已进行商业化
栽培 以供食用 , 在我国的浙江 、 福 建 、 台湾早有食
用礁膜的习惯 , 但迄今为止 ,我国仍没有进行礁膜
栽培 。 作者在探索礁 膜人工育苗栽培技术的 同
时 ,为了缩短育苗周期 ,保证有足够的栽培种苗供
应 ,有必要开发 出一套新的礁膜育苗技术 。 据此 ,
本文进行了礁膜的原生质体的分离与培养 , 以期
利用无性繁殖这一新 的快速育苗技术 , 为大规模
栽培礁膜随时提供种苗 。
迄今为止 ,许多大型底栖海藻的原生质体 的
分离与培养已进行了研究 , 但只有少数几种能再
生成 完整的植 株 , 对礁膜属 ( Mo no st or aln )进行过
原生 质 体 的分 离 与培 养 的种 类 有宽 礁膜 ( M .
l a t is s i m u m w i t r
.
) [
’ 〕 、 袋 礁 膜 ( 材 . 。吧、 eva
.
jK e一lm ) [ ’ ] 、 尖种礁 膜 ( 肘 . 。 x邓mr u m o 钾 ) [ ’ : 、 礁膜 ( M . int 记 “ m w i tr . )[ 4」等 ,但这些种类的原生质
体都没有直接发育成在生产育苗上有用的一般植
株 , 本研究 旨在探索一种新的育苗技术 。
材料与方法
1
.
1 材料
选取 1 一 3 c m 的幼嫩藻体作为酶解材料 , 采
集时间是 2 0 1 年 12 月 3 0 日 , 材料采集后 , 阴干
至含水量为 3 0 % 左右 , 用放有冰袋的保温箱带 回
实验室 ,保存于 一 20 ℃ 的冰箱内待用 。
1
.
2 方法
无菌藻体的获得 从 一 20 ℃的冰箱内取出藻
体 , 用毛笔在消毒海水 中洗刷藻体 2 次 , 置于过滤
的消毒海水 中培养 4 一 s d , 使藻体 复苏 。 取一定
量的藻体放人 1 % KI 一 几溶液 中洗涤 5而 n ,再用
过滤消毒海水漂洗 2 一 3 次 , 以去除原生动物和附
生生物 。 最后转移于 l o m L 添加了 N 和 P (硝酸
钠 :甘油磷酸钠 = 10 x l 0 ’ “ : 3 x 10 一 “ )以及 6 m L 的
广谱抗生素混合液 ( lg 氨节青霉素 , gl 硫 酸卡那
霉素 , 25 m g 制霉菌素 , 0 . 2 9 硫 酸新霉 素 , 混合溶
于 l o m L 双蒸水中 )的消毒海水 (比重 1 . 0 2 7 )中 ,
在 1 7℃ 、 光强 64 . 10 拌m o l · m 一 2 · s 一 ` 、光时 12 I J : 12 D
的条件下培养 6 h 。
酶液的 配制 通 过 比较 不 同配 比的 酶 液
的酶 解 效 果 ( 表 l ) , 最 佳 酶 解 液 的 配 制 为
4 % 果胶 酶 , 2 % 纤 维 素 酶 , 40
~
1
·
L
一 ` c ac l
Z ,
0
.
7 m ol
·
L
一 `甘露醇 , p H 5 . 5 。 首先把酶粉溶解在
p H 为 5 . 5 的 N处 PH q 一 N a H Zp q 缓冲液 (4 ℃ )配
制的 10 mL 0
.
7 m ol
·
L
一 ’ 甘 露 醇溶 液 中 ( 内含
40 ~
ol
·
L 一 ’ C aC 犯, ) 。 随后酶液用冷冻离心机 (0
一 5 ℃ ) 10 以x , x g 离 心 10 而 n , 以便 去除不溶物 。
酶液分装在 5 m L 小瓶中 ,保存于 一 20 ℃的冰箱内
待用 。
原 生质体的 分离 将消毒过的藻体以过滤消
毒海水清洗 3 次后 , 在超净工作 台上用 干净的刀
片把叶片部分切成 0 . 5 一 l m时 ,或把无菌藻体投
入消毒过的组织捣碎机中捣碎 ,用 60 网目筛绢过
滤 ,并用过滤消毒海水冲洗数次 , 由此得到许多大
小不一的微细组织块 。 称取 0 . 19 藻体碎片放人
内有 s m L 消毒酶解液的培养瓶 ( 25 m L )或培养皿
(直径 6 e m )中 ,置于 5 0 r · m i n 一 `摇床 中酶解 3 h , 此
原生质体的分离过程在黑暗 中进行 , 以促使藻体
细胞壁易于破裂 ,使原生质体酶解出来 , 酶解温度
为 28 ℃ 。 经过酶解后 , 将含有原生质体的酶解液
过滤 。 将所得过滤液离心后 ,倒去 3 4/ 上悬液 , 以
相同体积的过滤消毒海水补充 ,此过程重复 2 次 。
镜检 ( 20 x l 0 )时任取 5 个视野计数 ,取平均值 。
原生质体的培养 将纯化 的原生质体依次培
养于不同比重 ( 1 . 0 3 0 、 1 . 0 26 、 1 . 0 2 2 )的过滤消毒
海水中 (添加 N : P = 10 x 10 一 “ : 3 x 10 一 “ , e2F 十 i o x
10 一 6
,
IA A o
.
0 1 x 10 一 6
,朋o . o s x l o 一 6 , v i t C l o x
10
一 “ , p H 7
.
9 )
, 静 止 或 冲气 培 养 。 原 生 质 体 在
12 8
.
2 1 拌m o l · m 一 2 · s 一 ’ 、 12 L : 12 D 和 1 7℃下培养 ,
每个培养瓶或培养皿内装 s m L 培养液 ,培养的原
生质体密度为 4 x l护 一 2 4 x l护 · c m 一 2 。 培养液每
10 d 更换一次 。 培养第 d4 随机计数再生率 。
2 结果
2
.
1 原生质体 的酶解
礁膜配子体细胞表面观为多角形或椭 圆形 ,
有两两成对现象 , 细胞大小为 7 . 5 一 1印 m x 8 . 75
一 17
.
5 拌m (图版 一 1 ) 。 酶解后的原生质体呈 圆形
水 产 学 报 2 8卷
或椭圆形 , 大小为 10 一 10 . 5阳 x OI 一 12 . 邹m , 黄
绿色块状的叶绿体位于原生质体一侧 , 占据整个
原生质体的大部分体积 (图版 一 2 ) 。 原生质体酶
解条件的优化实验如表 l 所示 。
表 1 不 同酶解条件 下对礁膜原生质体 的酶解效果
T ab
.
1 E n ?eC t o f d i们免r e nt e o n d iit o璐 o f e nZ yma ict d e g r a da iot n on P r o加 P la s t y ic ld
编号
n u m be
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果胶酶
( % )
纤维素酶
( % )
C e l l u l a父
C aC 1
2
m m o l
·
L 一 ’ )
酶溶剂
( m d
·
L 一 ` )
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nz ym
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酶解温度
PH 〔℃ )
酶解时间
( h )
i n c u b at i o n P e ir od
原生质体数
(个 /视野 )
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4 0
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7 甘露醇 0 . 7 m an n i tol
0
.
7 Ll l梨醇 0 . ? s o br i t o l
1
.
4 蔗搪 l . 4 s u e or 犯
1
.
4 葡萄糖 1 . 49 : u e o se
0
. 了甘露醇 0 . 7 m~ olt
0
.
7 甘露醇 0 . 7m an i t o l
0
.
7 甘露醇 0 . 7 m a n i t o l
0
.
7 甘露醇 0 . 7m an i t o l
0
.
7 甘露醇 0 . 7 m a朋 i t o l
0
.
7 甘露醇 0 . 7m a ll n l t o l
0
.
7 甘露醇 0 . 7 m a n n i t o l
0
.
7 甘露醇 0 . 7 m an i t o l
0
.
7 甘露醇 0 . 7 m an i t o l
0
,
7 甘露醇 0 . 7 m a l价 i t o l
0
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7 甘露醇 0 . 7 m a l l l ll t o l
0
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7 甘露醇 0 . 7 m~ t
o l
0
.
7 甘露醇 0 . 7m an i t o l
0
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7 甘露醇 0 . 7m an j r o ]
0
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7 甘露醇 0 . 7 m a n i t o l
0
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7 甘露醇 0 . 7m an i r o l
0
. 了甘露醇 0 . 7m an iolt
0
.
5 甘露醇 0 . s m an i t o l
0
.
7 甘露醇 0 . 7m a ll lu t o l
0
.
9 甘露醇 0 . g m an iot l
1
.
1 甘露醇 l . l m an i t o l
5
.
5
5
.
5
5
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5
5
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5
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5
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5
6
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由上表可以得出礁膜 的原生质体的最佳酶
解条件为 : 4 % 果胶酶 , 2 % 纤维素酶 , 40 m m ol · L 一 `
c ac l
Z , 0
.
7 m o l
·
L
一 ’ 甘露醇 , p H 5 . 5 。 o 组表明 , 不
同的酶溶剂对原生质体的得率不一样 , o . 7 m ol ·
L 一 `的甘露醇作 酶溶剂酶解效果最佳 , 0 . 7 m ol ·
L
一 `的山梨醇和 1 . 4 m of · L 一 `的蔗糖酶解效果相
近 。 I 组表明 ,单用一种酶的酶解效果不及两种
酶混合使用的效果好 , 最佳酶液配置为 4% 果胶
酶和 2 % 纤维素酶 。 1 组表明 , 礁膜原生质体酶
解时的 p H 值以偏 酸性为好 , 因在酸性条件下组
织块易于软化 , 同时纤维素酶和果胶酶在 p H 5 . 5
左右时活性较高 。 班组表明 , 酶解温度 以 28 ℃为
佳 , 虽然 28 ℃和 32 ℃ 酶解条件 下所获原生质体
数 目相 近 , 但 2B ℃原生质体再生率为 90 % , 32 ℃
原生质体再生率只有 32 % 。 y 组说明酶解 时间
以 3 h 为好 ,在 3 h 内 ,所获得的原生质体数量与酶
解时间成正比 , 酶解 4 h 与酶解 3 h 所获原生质体
数量差不多 。 如果酶解时间超过 h6 , 则不能获得
有活性的原生质体 。 V 组表明 , 0 . 5 一 1 . l m ol · L 一 ’
甘露醇作酶溶剂 , 均能获得较 多的原生质体 , 以
0
.
7 m ol
·
L
一 `甘露醇所获原生质体数量最多 。
2
.
2 原生质体的培养与发育
原生质体 培养初期 光照强度 6 . 41 一 24 . 03
拼m ol · m 一 “ · s 一 ` , 细胞分裂后光照强度增至 32 . 05
拜m ol · m 一 2 · s 一 ’ 以上 。 培养后 的第 2 天已有明显的
再生细胞壁 (图版 一 3) , 第 3 一 4 天进行第一次分
裂 (图版 一 4) , 第 6 天 , 原生质体形成的细胞已分
裂为 4 细胞 (图版 一 5) , 第 8 天 , 有的已分裂为 8
1期 谢恩义等 :礁膜原生质体的分离及培养
细胞 (图版 一 6 ), 以后静止培养和充气培养均有 3
种发育方式 ,一种方式是少部分原生质体再生细
胞壁后进行重复的有丝分裂 , 形成有一公共胶质
膜包被的类似亲本 的叶状体组织块 (图版 一 7 ) 。
第二种发育方式是大部分原生质体再生细胞壁后
发育成抱子囊 (图版 一 8 一 1 0) ,抱子囊能以二分裂
进行增殖 ,使抱子囊密度加大 。 抱子囊在 8 月份
移出培养箱 , 在常温下进行变温培养 , 10 月份抱
子囊成熟 (图版 一 1 ) , 可放散出 16 ~ 32 个 四鞭毛
的游抱子 (图版 一 12 ) ,把游抱子附于筛绢上冲气
培养 , 则可发育成正常形态的叶状体 (图版 一 13 -
14 )
。 第 3 种发育方式是原生质体形成 的细胞先
行有丝分裂 ,形成细胞排列紧密的细胞 团 , 然后细
胞团里的一部分发育成假根 , 另一部分则发育成
管状体 (图版 一 15 一 16 ) 。
3 讨论
3
.
1 酶解材料的无菌处理
对大型海藻无菌 酶解 材料的获得有许 多方
法卜 7 ] ,本 实验利用 l % 租 一 几液和广谱抗 生素
混合液先后处理藻体也取得很好的效果 。 在原生
质培养的初期 , 无菌条件对原生质 的快速再生是
必不可少的 , 因抑制微生物生长的抗生素也能抑
制原生质体的再生分裂 , 因此准备好酶解用 的无
菌材料是本实验非常重要的一个环节 。
3
.
2 酶液的配制
绿藻的细胞壁组份中 ,外层为一层果胶质 , 内
层纤维素 占很大比例 。 礁膜叶状体组织细胞的上
下表面有一层胶质公共膜 , 使两两成对 的细胞粘
连成一个整体 。 原生质酶解时 ,果胶酶首先需要
对公共胶质膜溶解碎裂 , 然后才对组织细胞 的细
胞壁果胶层进行酶促溶化 , 纤维素酶的作用是使
细胞壁的纤维层酶解掉 。 两种酶混合使用的酶解
效果比单一酶的酶解效果要好 , 故选择纤维素酶
和果胶酶的混合酶液进行礁膜原生质体的酶解 。
陈衍 昌等〔’ ] 、 张大力图对宽礁膜 、 袋礁膜 以及 G .
R
.
irK
s
hn ak
u m ar 等 [” 〕对尖种礁膜的酶溶剂配制分
别为 2 % 果胶酶混合 4% 纤维素酶和单用 3 % 纤维
素酶 ,作者对礁膜酶解条件进行优化时 ,得出最佳
酶液配制为 : 4 % 果胶酶混合 2 % 纤维素酶 〔 , 另外
采用组织捣碎机可 以将酶解用 的组织 块彻底打
碎 ,使酶解更为容易 ,在酶解前对培养的礁膜材料
黑暗处理一昼夜 , 可使细胞壁软化 ,更易于细胞壁
的酶解 。
3
.
3 酶解温度
关于酶解温度 , 张大力川对袋礁膜得出的最
佳酶解温度为 3 ℃ , 在 3 ℃以下原生质体成活率
随着温度的升高而升高 。 作者得出的最佳酶解温
度为 28 ℃ , 在 24 一 32 ℃下 , 温度高 , 酶的活性大 ,
分离出的原生质体数 目多 , 但在 32 ℃ , 原生质体
再生率只有 32 % ,说明 32 ℃的高温对原生质体有
一定的损害 , 28 ℃和 32 ℃ 酶解条件下所获取原生
质体数 目相近 ,但 28 ℃原生质体再生率为 90 % ,
原生质体质量好 ,故酶解温度 以 28 ℃为佳 , 作者
认为 3 ℃ 的高温已超过了原生质体的耐受范围 。
3
.
4 原生质体的发育方式
本文首次报道在同一培养条件下礁膜原生质
体可 表 现 出 3 种 不 同 的 发 育 方 式 , 已 有 文
献 [ ’ 一 4 ,8 一 ` “ ]只报道过 1种或 2 种发育方式 。 原生
质体直接发育成叶状体组织块 ,或形成抱子囊 ,或
形成 管状 体 的 发 育方 式 在 石 药 属 [’, “ 一 9〕 、 浒 苔
属 l0[ 〕 、 礁膜属 {` 一 “ 〕中也有报导 , 这在一定程度上
反映了这 3 个属在进化过程 中的演化关系〔川 , 也
在一定程度上体现了生物的重演律 。 礁膜 的这种
不同的发育方式 , 可能和原生质体原先在组织 中
的位置 、 培养条件 (温度 、 光照等 )以及培养环境 中
的某些未知因素有关 。 第一种发育方式对生产育
苗最为直接 、 有利 ; 第二种发育方式与传统 的发
育方式同样繁琐 ,但这种发育方式形成的抱子囊 ,
在育种上有一定价值 。 另外这种发育方式可以用
来保存种苗 ,这也是区别 于传统育苗方式的一种
新的方法 ; 第三种发育方式偏离 了亲本的正常形
态 ,应加以抑制或诱导转化 。 今后应加强影响原
生质体分化 、发育方 向因子的研究 ,使原生质体培
养朝着选定的方向发育 。
参考文献 :
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( l ) : 57 一 65
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[张大力 . 两种绿藻一一长石苑和袋礁膜原生
质体的制备 、 培养和融合的研究【J I . 山东海 洋学 院学报 ,
l (犯 3 , 13 ( l ) : 57 一 砧 . ]
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6 6水 产 学 报 8 2卷
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仁 6 ]
已 g a e〔 J ] .l pn a tC el tT i s u en adr og n aC ul tr u e, 19 8B , 12 : 5 5 -
印 .
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1989
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3 6 : l 一 7
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e u l ut er 【J」. J AP pl hP y e o l , l勇 l , 3 : 2 65 一 2 7 5 .
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w iht a di f fe r e nt t y p e o f 由 v e l o pn l e n t [ J ] . J冷 y e o l , 19印》 , 16 : 128
一 137
.
[ 7 〕
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. 玲 y e o l o ig a , l ,熟渊〕 , 阳 : 50 3 -
50 7
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U n i v e irs t y
,
19 85
,
5 7 : 39 一 45 .
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图版说明 E x p一a n a t i o n o r P一a t e
1
. 礁膜配子体中部细胞表面观 , x , 刃 ; 2 . 刚分 离的原生质体 , x 引死) ; 3 . 培养 2d 的细胞 , x Zo ; 4 . 2 细胞期 , x 创 M〕 ; 5 . 4 细胞期 , x 书洲〕 ;
6
.
8 细胞期 , x 引叉) ; 7 . 类似亲本的叶状体组织块 , x Z o ; 8 . 早期抱子囊 , x 引加〕 ; 9 . 中期抱子囊 , x Zo ; 10 . 晚期抱子囊 , x 别 x , ; 1 . 成
熟抱子囊 , x 引X】; 12 . 游抱子 , x 4( 犯 ; 13 . 附于筛绢上的多细胞苗 , x Zo ; 14 幼苗 , x 叨 ; 15 、 16 . 管状苗 , x Zo
1
.
Su d汕e e v i e w of het 而如 l e P斌 of g田旧 e t o Ph y t e of M d nos t or naz 而 i山溯 , x s叹X) ; 2 . rP o top las t s ju s t i s ol a edt , x 引引〕 ; 3 . A e e l l w iht e e l l w al l ,
e u l tu r ed t w
o d a y s
,
x Z田 ; 4 . T w o e e l l s t a g e e u l t u r ed fo u r da y s , x 喇洲〕 ; 5 . oF ur e e l l s t ag e e u l tU r e d s i x da y s , x 以加〕 ; 6 . E ight e e l l s agt e e u l t u r e d te n
day s
,
x 引 X , ; 7 . C e l l e l u s et sr 5 1而 lar ot het Par e n t ht a l l u s it ssu e , x Z田 ; 8 . S op arn ig a o f e ar l y s at g e , x 创洲〕; 9 , Sop arn g i a o f mi dl e s agt e , x Z《减〕;
10 S po ran ig
a o f la te r st a g e
,
x 3叹】; 1 1 . M a tu re spo r an g i a , x 中叹) ; 12
.
Z o spe re s
,
x 引洲〕 ; 13 . M u l it e e l l u lar g e n l l】i n g a dh e r e d t o hte s i lk
一
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,
x Z田 : 14 . A j u v e in l e ht al l u s , x 叨 ; 15 、 16 . T u b u lar ht al l u s , x Z(幻
1期 谢恩义等 :礁膜原生质体的分离及培养
图 版 P lt ae