全 文 ：·研究报告·
黄海葵高效液相色谱指纹图谱研究■①
张道来1 ,陈军辉1＊ ,史倩1 ,程红艳1 ,
赵恒强1 ,杨黄浩1 ,王小如1 ,李国强2
(1.国家海洋局第一海洋研究所 , 海洋生态研究中心青岛市现代分析技术及中药标准化重点实验室 , 山东 青岛 266061;
2.中国海洋大学医药学院 ,山东 青岛 266003)
摘　要:目的 应用高效液相色谱法(HPLC)建立黄海葵的 H PLC 指纹图谱 ,为其质量控制和药材鉴别提供依
据。方法 采用反相 C18色谱柱 ,以乙腈-0.1%(V/ V)磷酸水为流动相 , 二元线性梯度洗脱 , 流速为 1.0 m L·
min-1 , 柱温为室温 ,检测波长为 210 nm ,进样量 5 μL;采用高效液相色谱-质谱联用技术(HPLC-MS)对其特
征峰进行快速分析;将相似度计算法用于 8 批黄海葵药材的评价。结果 以 7 个共有峰为评价指标 , 建立了黄
海葵药材的 HPLC 指纹图谱 ,通过相似度计算发现 8 批黄海葵相似度均在 0.97 以上;HPLC-MS 分析获得的
4 个特征峰的质谱信息 , 可实现黄海葵药材指纹图谱特征峰的准确定位。结论 该方法准确 、简单 、稳定性好 ,
所建立的黄海葵药材的 H PLC 指纹图谱可作为药材定性真伪鉴别和质量控制的有效手段。
关键词:黄海葵;高效液相色谱法;指纹图谱
中图分类号:R284.1;Q959.135.1　　　文献标识码:A　　　文章编号:1002-3461(2010)03-0001-07
Study on the HPLC fingerprints of
Anthopleura xanthogrammica(Berkly)
ZHANG Dao-lai1 , CHEN Jun-hui1＊ ,SHI Qian1 ,CHENG Hong-yan1 ,
ZHAO Heng-qiang1 ,YANG Huang-hao1 ,WANG Xiao-ru1 , LI Guo-qiang 2
(1.Qingd aoK ey Lab.on Analyt ical Technology Development and S tandardizat ion o f
Chinese Medicines ,Research Center f or Marine Ecology ,
First Inst itute Oceanography o f SOA , Qingdao 266061 ,China;
2.Collegeo f Medicine and Pharmacy , Ocean Universi ty o f China ,Qingdao 266003 , China)
Abstract:Objective To establish a high performance liquid chroma tog raphy (HPLC)fingerprinting
method fo r the quali ty evaluation and discrimination of Anthop leura xanthogrammica(Berkly).Meth-
ods The chromato graphic fingerprints of the 8 samples were determined by injecting 5μL o f the sample
solution each time on a rever sed phase C18 co lumn w ith the g radient elution solvent sy stem composed of
w ate r and acetoni t rile.The flow rate w as 1.0 mL ·min-1 , the column temperature w as maintained at
ro om temperature and the signals w ere acquired a t 210 nm .Characteristic peaks of the fingerprint could
1
中国海洋药物杂志 2010年 6月第 29卷第 3期 Chin J Mar Drugs , 2010 J une , Vol.29 No.3
①■基金项目:国家自然科学基金(20905017);中国近海海洋综合调查与评价 908专项(908-02-05-04);海洋公益性行业科研专项
(200705011 , 200805039);海洋局青年基金(2010140)、海洋一所基本科研业务专项(GY-022008T32), 2010G25和中国
科学院实验海洋生物学重点实验室开放基金课题资助
　作者简介:张道来 ,男 ,硕士研究生
＊通讯作者:陈军辉 ,男 ,博士研究生　Tel:(0532)88966705;E-mail:jhchen@fio.org.cn
DOI :10.13400/j.cnki.cjmd.2010.03.003
be rapidly analy zed by high performance liquid chromatog raphy-mass spect rometry (HPLC-MS), and
the method of similarity analy sis w as used to evalua te the 8 samples.Results The HPLC fingerprint of
Anthopleura xanthogrammica(Berkly)was set up , which included 7 common peaks , and the similari-
ties of 8 samples w ere all more than 0.97.Mass spect ra of the 4 characte ristic peaks obtained using
HPLC-MS could be used to accurately confirm the characteristic and common peaks in f ing erprint of
Anthopleura xanthogrammica(Berkly).Conclusion The method is stable , simple and accurate , and could
be used fo r the identification and quali ty contro l of Anthopleura xanthogrammica(Berkly).
Key words:Anthop leura xanthogrammica(Berkly);high performance liquid chromatog raphy;finger-
print
　　黄海葵是一种低等的海洋肠腔动物 ,属于刺
胞动物门(Cnidaria)珊瑚纲(Anthozoa)海葵目
(Actiniaria)海葵科 ,广泛分布在我国沿海海域 ,特
别在青岛沿岸属常见种。黄海葵全体入药 ,其性
温味辛 ,有滋阴壮阳 ,收敛止泻 ,燥湿杀虫的功效 ,
用于痔疮 、脱肛 、蛲虫病 、皮肤癣等[ 1] 。研究发现 ,
黄海葵体内含有嘧啶 、胆甾醇 、单糖 、二烯酸 、甘油
酯等多种成分[ 2-3] 。基于它的重要药效作用 ,近年
来引起人们的广泛重视。但黄海葵作为一种重要
的海洋药用生物 ,目前对其真伪鉴别和质量控制
方法研究尚为空白 ,因此研究黄海葵的质量控制
和真伪鉴别方法具有其切实性和必要性。
中药指纹图谱技术是目前国际公认的中药鉴
别以及质量控制的有效方法[ 4-6] ,特别是高效液相
色谱法(HPLC)因其具有分离效能高 、分析速度
快 、重现性好 、可配备多种检测器等优点已成为建
立中药指纹图谱的主导方法[ 7] 。高效液相色谱指
纹图谱技术在陆源中药的真伪鉴别和质量控制中
的应用已经很成熟[ 8-9] ,而在海洋药用生物中应用
较少 ,仅有皱瘤海鞘 、小海马 、三斑海马 、罗氏海盘
车 、马粪海胆等海洋药物已应用 HPLC 指纹图谱
进行真伪鉴别和质量评价[ 10-14] 。本研究首次开展
黄海葵的 HPLC指纹图谱研究 ,以期为黄海葵药
材真伪鉴别及质量控制提供科学依据和技术支
持 ,促进海洋药用生物黄海葵资源的开发利用。
1　实验部分
1.1　试剂与材料
甲醇(色谱纯)购于美国 Tedia 公司 ,乙腈(色
谱纯)购于德国 Merck 公司 ,其余试剂均为分析
纯 ,实验用水为 Milli-Q 超纯水(18.2 MΨ);本研
究所采用的 9批实验样品均采自青岛沿岸海域 ,
经中国海洋大学水产学院曾晓起教授鉴定 ,其中 8
批样品为黄海葵 , 1批样品为肋条海葵 ,详细样品
信息见表 1。
表 1　实验样品
Tab.1　Samples used in this wo rk
编号 样品 采样时间 编号 样品 采样时间
1 黄海葵 2008-04-10 6 黄海葵 2008-09-04
2 黄海葵 2008-04-10 7 黄海葵 2008-09-23
3 黄海葵 2008-04-25 8 黄海葵 2008-09-24
4 黄海葵 2008-08-06 9 肋条海葵 2008-09-24
5 黄海葵 2008-08-21 - ——— ———
1.2　仪器与设备
1200型高效液相色谱仪 ,配有四元泵 , DAD
检测器 ,自动进样器等(美国 Agi lent 公司);6320
型离子阱质谱仪 ,配有大气压化学电离(APCI)源
(美国 Ag ilent 公司);KQ-400KDE 型高功率数控
超声波仪(昆山市超声仪器有限公司);R201型旋
转蒸发仪(上海申生科技有限公司);FA1104 型电
子天平(上海精天电子仪器厂);T HZ-8恒温水浴
锅(中国浙江嘉兴电热仪器厂);Milli-Q(18.2
MΨ)超纯水处理系统(美国 Millipore公司)。
1.3　供试品溶液的制备
采集到实验样品冲洗干净 ,置于烘箱中烘干 ,
粉碎并过 20 ～ 40目筛 ,准确称取 0.5 g 干粉样品 ,
置于 100 mL 具塞锥形瓶中 ,加入 50 mL 乙醇 ,超
声提取 30 min ,提取一次 ,静置 ,取上清液 ,然后将
滤液在 50 ℃条件下旋转蒸发浓缩至干 ,用乙腈溶
解提取物并定容至 10 mL ,过 0.45 μm 微孔滤膜
后作为供试品溶液。
1.4　色谱条件
DiamonsilC18色谱柱(4.6 mm×150 mm , 5μm ,
中国Dikma公司),流动相 A:0.1%(V/V)磷酸水 ,
2
Chin J Mar Drugs , 2010 J une , Vol.29 No.3 中国海洋药物杂志 2010年 6月第 29卷第 3期
流动相 B:乙腈 ,梯度洗脱程序:0 ～ 5 min:70%～
70%流动相 B , 5 ～ 15 min:70%～ 80%流动相 B ,
15 ～ 30 min:80%～ 100%流动相 B , 30 ～ 45 min:
100%～ 100%流动相 B ,流速为 1.0 mL·min-1 ,柱
温为室温 ,检测波长为210 nm ,进样量为 5 μL。
1.5　质谱条件
流动相 A:0.2%(V/V)醋酸水溶液 ,流动相
B:乙腈 ,洗脱梯度及其他色谱分离条件同 1.4色谱
条件;大气压化学电离离子源 ,正离子电离模式 ,雾
化气压力60 psi ,干燥气(N2)流速 5.0 L·min-1 ,干
燥气体温度 350 ℃,气化室温度为400 ℃,毛细管电
压 3 000 V ,电晕放电电流 4.0μA ,全扫描(Scan)质
荷比(m/z)范围为 50 ～ 1 200。
2　结果与讨论
2.1　样品溶液制备方法优化
黄海葵 HPLC 指纹图谱受提取溶剂 、提取方
式等因素的影响 ,本研究采用 1.4节色谱条件 ,首
先对黄海葵不同提取溶剂(甲醇 、乙醇 、乙酸乙酯 、
丙酮 、水)提取物溶液进行分析 ,结果显示 ,用乙醇
作提取溶剂时 ,所得色谱图色谱峰较多 、峰形对
称 、基线平稳 ,指纹特征明显 ,且乙醇便宜 、易买 、
毒性低 ,因此选择乙醇作为黄海葵指纹图谱样品
提取溶剂。同时还比较了水浴回流提取 、冷浸提
取和超声辅助提取法对样品进行提取的效果 ,结
果显示 ,超声提取法方便 、快捷 、提取效率高 、便于
操作 ,且提取液中干扰物质少 ,是最佳提取方法。
超声过程中 ,考察了温度 、超声频率对提取效率的
影响 ,经比较确定温度对提取效果影响不大可忽
略 ,超声频率在仪器的 80%～ 100%之间的提取效
果无差别 ,故提取过程无须控温 ,超声波仪器频率
设在 80%即可。在此基础上进一步比较了提取溶
剂体积 、提取时间对指纹图谱效果的影响 ,以 50
mL 提取剂超声提取 30 min 为宜 。在上述条件
下 ,提取一次即可将黄海葵 HPLC 指纹图谱代表
性物质提取出来。
2.2　色谱条件优化
黄海葵体内含有丰富的脂肪酸 、蛋白质 、多
肽 、氨基酸 、嘧啶 、胆甾醇 、糖 、二烯酸 、甘油酯 、磷
酸酯类及微量元素等多种化合物 ,成分杂多且极
性差异大 ,采用等度洗脱的方法很难将黄海葵乙
醇提取物中的多种化合物分离开 ,因此采用线性
梯度洗脱方式进行分离 。天然产物分析中常用反
相色谱技术 ,于是实验比较了 C8和C18二种色谱柱
的分离效果 ,结果表明 ,使用 C18色谱柱获得的色
谱指纹图谱各峰分离度高 ,色谱峰分布均匀 ,峰型
完美 ,谱图信息量大 ,特征性强 ,具有较好的代表
性 ,因此选择 C18柱用于黄海葵的指纹图谱研究 。
应用不同型号 C18色谱柱进行分析 ,比较分离效
果 ,发现不同型号色谱柱分离效果相差不大 ,但国
产迪马柱效果最理想 ,于是使用该柱进行指纹图
谱分析 。采用二极管阵列检测器通过全波段扫
描 ,考察了不同检测波长对指纹图谱的影响 ,从三
维色谱图观察到提取液在 210 nm 处的色谱指纹
图谱信息量大 ,特征性强 ,最具代表性 ,因此选择
210 nm 作为黄海葵 HPLC 指纹图谱研究的检测
波长。在此基础上 ,比较了甲醇 、乙腈 、水为流动相
时的色谱图效果 ,并加入磷酸 、乙酸 、氨水调节流动
相 pH以改善分离度和色谱峰形 ,结果发现以0.1%
磷酸水-乙腈为流动相时 ,色谱指纹图谱效果最好 。
2.3　方法学考察
2.3.1　精密度
按 1.4 色谱条件 ,对同一供试品溶液重复进
样 6次测定 ,分别测得其中 4 个主峰的峰面积和
保留时间 ,分别计算其相对标准偏差(RSD)。4个
主峰峰面积和保留时间 RSD值分别在 0.46%～
2.85%和 0.04%～ 0.15%范围之内 ,表明仪器精
密度良好。
2.3.2　重复性
精密称取同一黄海葵样品 6份 ,按 1.3处理
方法制成供试品溶液 ,按照 1.4 的色谱条件进样
测定 ,测得 4个主峰的峰面积和保留时间 ,并计算
其相对标准差 ,4个主峰峰面积和保留时间的 RSD
值分别在 1.10%～ 4.41%和0.02%～ 0.15%范围内 ,
表明该方法重复性良好。
2.3.3　稳定性
将供试品溶液按照 1.4 色谱条件 ,分别在 0 ,
1 ,3 , 6 , 12 , 24 , 48 h 进样测定 ,结果显示供试品溶
液中黄海葵提取物溶液的峰面积和保留时间无明
显变化 ,4个主峰面积和保留时间的 RSD值分别
在 0.45%～ 4.23%和 0.04%～ 0.19%范围内 ,说
明供试品溶液在 48 h 内化学性质稳定。
2.4　黄海葵指纹图谱的建立
取 8 批不同的黄海葵样品 ,按 1.3 处理方法
3
中国海洋药物杂志 2010年 6月第 29卷第 3期 Chin J Mar Drugs , 2010 J une , Vol.29 No.3
将其制备成供试品溶液 ,按 1.4 色谱条件进样分
析 ,记录色谱图 ,建立黄海葵样品的 HPLC 指纹图
谱 ,8批黄海葵样品的色谱图 ,见图 1。从色谱图
观察到 ,8批黄海葵乙醇提取物成分出峰时间均在
40 min之前 ,主要有 7个共有峰 ,见图 2。这 7 个
色谱峰即构成黄海葵指纹图谱的指纹特征 ,也是
鉴别黄海葵真伪及质量评价的主要变量 。其中 ,
峰号为 2 , 4 , 5 , 6的 4 个色谱峰特征明显 、色谱分
离效果好 ,这 4 个色谱峰即构成黄海葵 HPLC 指
纹图谱的特征峰 , 其中 6 号峰峰形对称 、峰高适
中 ,化学性质稳定 ,保留时间以及峰面积重复性良
好 ,与相邻峰基线分离 ,应用化学工作站软件对该
峰的纯度进行计算 ,结果表明该峰为一纯化合物 ,
因此选择 6 号峰为参照峰(保留时间和峰面积均
设为 1)。对色谱图中各共有峰的相对保留时间和
相对峰面积进行计算 ,见表 2 、表 3 ,从中可以看出
不同黄海葵样品谱图中各峰相对保留时间的 RSD
值很小 ,而各峰相对峰面积的 RSD 值较大 ,可知
不同黄海葵样品中化合物成分一致但含量差别较
大 ,在指纹图谱中可发现谱图各峰保留基本匹配
但高低不一 ,不同批次样品相对峰强度比例具有
个体特征 ,黄海葵样品谱图既有一致性又存在差
异 ,完全符合指纹图谱技术的要求。
图 1　不同黄海葵样品 HPLC 指纹图谱
Fig.1　HPLC finge rprints of different
Anthopleura xanthogrammica(Berkly)sample s
图 2　黄海葵 HPLC-DAD(210 nm)图谱
Fig.2　H PLC-DAD(210 nm)chromatog ram o f
Anthopleura xanthogrammica(Berkly)
表 2　相对保留时间
Tab.2　Rela tive re tention time
峰号 8 批样品相对保留时间
1 2 3 4 5 6 7 8
平均 RSD/ %
1 0.49 0.49 0.49 0.49 0.49 0.49 0.49 0.49 0.49 0.08
2 0.63 0.63 0.63 0.63 0.63 0.63 0.63 0.63 0.63 0.07
3 0.68 0.68 0.68 0.67 0.67 0.68 0.67 0.67 0.68 0.07
4 0.82 0.82 0.82 0.82 0.82 0.82 0.82 0.82 0.82 0.04
5 0.91 0.91 0.91 0.91 0.91 0.91 0.91 0.91 0.91 0.02
6 1.00 1.00 1.00 1.00 1.00 1.00 1.00 1.00 1.00 0.00
7 1.40 1.40 1.40 1.40 1.40 1.39 1.40 1.40 1.40 0.10
表 3　相对峰面积
Tab.3　Relativ e peak area
峰号 8 批样品相对保留时间
1 2 3 4 5 6 7 8
平均 RSD/ %
1 0.10 0.10 0.07 0.03 0.02 0.02 0.02 0.02 0.05 80.08
2 1.06 1.17 1.05 1.09 1.15 1.14 1.19 1.18 1.13 4.74
3 0.08 0.06 0.07 0.07 0.07 0.07 0.07 0.06 0.07 8.27
4 0.22 0.20 0.19 0.17 0.17 0.17 0.15 0.13 0.17 16.65
5 0.34 0.40 0.37 0.37 0.39 0.40 0.38 0.37 0.38 5.43
6 1.00 1.00 1.00 1.00 1.00 1.00 1.00 1.00 1.00 0.00
7 0.37 0.50 0.42 0.36 0.38 0.39 0.40 0.40 0.40 10.56
4
Chin J Mar Drugs , 2010 J une , Vol.29 No.3 中国海洋药物杂志 2010年 6月第 29卷第 3期
　　为便于黄海葵药材 HPLC指纹图谱共有峰的
快速准确识别和定位 ,进一步明确 4 个特征峰的
特征性 ,采用高效液相色谱-大气压化学电离质谱
联用技术(HPLC-APCI-MS)对黄海葵指纹图谱中
的特征峰进行分析 。HPLC 工作条件同“1.4色谱
条件” ,A PCI-MS 按照“1.5质谱条件”进行检测分
析 ,获得的质谱总离子流色谱图(TIC)如图 3 所
示 ,可以看出黄海葵乙醇提取物中各特征峰质谱
分析信号良好 ,黄海葵指纹图谱中的 4 个特征峰
的质谱图见图 4。查阅国内外黄海葵化学成分研
究的相关文献及相关天然产物化学成分数据库 ,
解析 4 个特征峰的质谱图 ,发现黄海葵指纹图谱
中的 4 个特征峰可能为文献尚未报道的新化合
物;根据 HPLC-A PCI-MS 获得的4 个特征峰的质
谱图 ,结合 4个特征峰的保留时间 ,可以实现黄海
葵药材指纹图谱特征峰以及共有峰的快速准确定
位 ,对黄海葵 HPLC 指纹图谱用于黄海葵药材的
真伪鉴别及质量控制提供了进一步的技术保障和
数据支持。
指纹图谱是样品整体化学特征的外在反映 ,
但是单依靠对指纹图谱峰的多少和峰的大小进行
直观比较 ,容易造成主观偏差 ,难以获得客观的评
价结果 。相似度分析可以对指纹图谱定量描述 ,
从而对样品进行客观评价[ 15] 。结合文献[ 16-17] 报
道 ,利用 M icro sof t Of fice XP 办公软件系统 ,采用
夹角余弦法对 8批黄海葵样品的指纹图谱进行谱
峰匹配和相似度计算 ,见表 4 。从表 4可以看出 , 8
批黄海葵样品的相似度值均在 0.98 左右 ,最大值
与最小值之差仅为 0.008 ,说明 8批黄海葵样品的
质量差别甚微 ,可见本方法可用于黄海葵药材质
量评价及控制。
表 4　相似度计算结果
Tab.4　Results o f similarity analy sis
No. 1 2 3 4 5 6 7 8
相似度 0.984 0.976 0.977 0.981 0.981 0.980 0.979 0.977
2.5　黄海葵样品真伪鉴别
为了验证采用黄海葵 HPLC 指纹图谱辨别黄
海葵真伪的可行性 ,本文采用 1.3 供试品处理方
法 ,对另外 2 种海洋药物样品进行处理 ,按 1.4 色
谱条件进样分析 ,得到各样品的 HPLC谱图 ,见图
5 。由图 5谱图可知 ,黄海葵指纹图谱与刺参样品
指纹图谱存在明显差异 ,通过谱图可直接进行区
分;但与肋条海葵指纹图谱有一定的相似性 , 4个
特征峰均可在肋条海葵指纹图谱中找到 ,保留时
间基本吻合 ,峰面积之间的比例存在不一致 ,按上
文黄海葵指纹图谱相似度计算方法进行计算 ,结
果表明黄海葵和肋条海葵的相似度仅为 0.62 ,据
此可将肋条海葵与黄海葵区别开来。可见文中所
建立黄海葵 HPLC 指纹图谱根据不同批次药材的
指纹图谱特征 ,结合相似度分析 ,可以成功实现黄
海葵药材的真伪鉴别 。
图 3　黄海葵样品 H PLC-APCI-MS 分析总离子流色谱图
Fig.3　HPLC-APCI- MS to tal ion chr omatog ram (T IC)o f the ext ract of Anthop leura xanthogrammica(Berkly)
5
中国海洋药物杂志 2010年 6月第 29卷第 3期 Chin J Mar Drugs , 2010 J une , Vol.29 No.3
图 4　黄海葵 4 个特征峰质谱图
Fig.4　Mass spectrum of 4 cha racteristic peaks for Anthopleura xanthogrammica(Be rkly)
图 5　不同海洋药物 H PLC 图谱
Fig.5　H PLC fingerprints o f different marine drug s
6
Chin J Mar Drugs , 2010 J une , Vol.29 No.3 中国海洋药物杂志 2010年 6月第 29卷第 3期
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(收稿日期 2010-01-08)
《中国海洋药物》杂志为我国科技核心期刊
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中国海洋药物杂志 2010年 6月第 29卷第 3期 Chin J Mar Drugs , 2010 J une , Vol.29 No.3