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收稿日期：2010-05-31
基金项目：国家重点基础研究发展计划(编号：2010CB833800)，国家自然科学基金(编号：30970007)，湖南省重点学科建设项目(编号：
JSS2009Z01、JSS200903)
作者简介：刘祝祥，男，讲师，硕士，研究方向为微生物资源与生态；E-mail: liuzhuxiang@126.com
* 通讯作者，E-mail: mchenjsu@yahoo.com.cn
文章编号：1001-8689(2011)06-0416-05
黄海葵相关细菌抗菌活性菌株的筛选及其初步分类鉴定
刘祝祥 黄苛 肖怀东 陈奇辉 贺建武 陈义光 *
(植物资源保护与利用湖南省高校重点实验室，吉首大学生物资源与环境科学学院，吉首 416000)
摘要：目的 对分离自硇洲岛黄海葵(Anthopleura xanthogrammica)样品的126株细菌进行抗菌活性筛选和初步分类鉴
定。方法 以8种微生物(3株革兰阳性菌、3株革兰阴性菌和2株真菌)作为指示菌，采用琼脂扩散法筛选抗菌活性菌株，采用
基于16S rRNA基因序列的系统发育分析和生物学特性研究对其中抗菌谱较广且抗菌活性稳定的菌株进行初步分类鉴定。结
果 67株菌具有抗菌活性，阳性率为53.2%，抗菌谱较广且活性较强的9株，占受试菌株总数的7.1%。经过形态观察、生理
生化特征及基于16S rRNA基因序列的系统发育分析表明，9株具有较强抗菌活性的菌株分别属于芽孢杆菌属(Bacillus)、盐芽
孢杆菌属(Halobacillus)、短杆菌属(Brachybacterium)、拟诺卡菌属(Nocardiopsis)、盐单胞菌属(Halomonas)、假交替单胞菌属
(Pseudoalteromonas)和弧菌属(Vibrio)菌株。结论 分离自中国南海的黄海葵相关微生物抗菌活性菌株具有丰富的类群多样性。
关键词：黄海葵；细菌；抗菌活性筛选；系统发育分析；鉴定
中图分类号：R378 文献标识码：A
Screening and preliminary identifi cation of the antimicrobial strains associated
with Anthopleura xanthogrammica
Liu Zhu-xiang, Huang Ke, Xiao Huai-dong, Chen Qi-hui, He Jian-wu, Chen Yi-guang
(Key Laboratory of Plant Resources Conservation and Utilization of Hunan Province, College of Biological Resource and Environment
Science, Jishou University, Jishou 416000)
Abstract Objective To investigate the Screening and preliminary identifi cation of 126 antimicrobial strains
isolated from Anthopleura xanthogrammica collected from the area of the Naozhou island in the South China Sea.
Methods The antimicrobial activity of the strains were tested using the agar diffusion method employing eight
indicator strains including Sarcina lutea, Staphylococcus aureus, Escherichia coli, Proteus vulgaris, Bacillus subtilis,
Candida albican, Asperillus niger and Enterobacter aerogenes. The preliminary identification of the strains were
investigated by using phylogenetic analysis based on 16S rRNA gene sequence comparisons. Results The results
showed that 67 strains out of the 126 strains exhibited antibacterial activity, in which 9 strains exhibited strong
antibacterial activity. Based on the results of morphologic characteristics, physiological and biochemical
properties and phylogenetic analysis of 16S rRNA gene, 9 strains belonged to the genera Bacillus, Halobacillus,
Brachybacterium, Nocardiopsis, Halomonas, Pseudoalteromonas and Vibrio respectively. Conclusion The results
presented here showed that there is abundant diversity of population of the antimicrobial stains isolated from
Anthopleura xanthogrammica collected from the South China Sea.
遗传育种与生物合成
中国抗生素杂志2011年6月第36卷第6期
DOI:10.13461/j.cnki.cja.004794
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海洋生物种类超过20万种，但目前人们对海洋
生物的认识相当有限，利用率仅1%左右[1]。海洋生
态环境的独特性使海洋微生物产生了与陆地微生物
不同的代谢系统和防御系统，从海洋微生物中提取
的生物活性物质，常常具有新颖的化学结构和特异
的生理功能，在抗菌、抗病毒、抗肿瘤、保健等方
面都具有独特的效应[2-6]。海洋微生物为新特药的开
发研究带来了巨大的前景，因此从海洋微生物资源
中寻找新型微生物药物将成为研究的必然趋势[7-8]。
近年的研究表明，海洋无脊椎动物相关微生物
能产生与其宿主相同或相似的生物活性物质，许多
相关微生物被认为是海洋无脊椎动物活性物质的真
正生产者[9-12]，它们已成为海洋天然活性物质的新来
源，也是海洋生物资源开发利用的重要领域。
海葵多数栖息在浅海和岩岸的水洼或石缝中，
少数生活在大洋深渊，能产生多种毒素。谢新强
等[13]和郑忠辉等[14]分别从海葵中分离到具有抗肿瘤
或抗菌活性的微生物菌株；蒋亭等[15]报道了黄海葵
(Anthopleura xanthogrammica)附生真菌的化学成分分
离和结构解析；上述结果表明海葵相关微生物能产
生生物活性物质，值得进一步研究。黄海葵属于腔
肠动物门(Coelenterata)，海葵科(Actiniidae)，侧花海
葵属(Anthopleura)。本实验室曾对硇洲岛海域黄海葵
相关微生物进行了研究，分离获得126个菌株，并挑
选42株菌进行系统发育分析，发现黄海葵相关微生
物具有较丰富的多样性，并有新物种的存在[16]。为
进一步评估黄海葵相关微生物的用途，对获得的126
个菌株进行抗菌活性的筛选，并对部分阳性菌株进
行基于16S rRNA基因序列的系统发育分析和生物学
特性研究，以期为海葵相关原核微生物资源的开发
利用提奠定一定的基础。
1 材料和方法
1.1 材料
1.1.1 主要试剂和仪器
引物由北京三博远志生物有限责任公司合成，
其它分子生物学试剂同肖怀东等[16]文章。PCR仪系
BIO-RAD公司。
1.1.2 菌株来源
用于抗菌活性筛选的126株细菌(含放线菌)，保
存于吉首大学微生物资源与生态实验室，分离自硇洲
岛海域采集的黄海葵样品。用于抗菌活性筛选指示
菌(3株革兰阳性菌、3株革兰阴性菌和2株真菌)由吉
首大学微生物资源与生态实验室提供，分别为：枯
草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)、藤黄八叠球菌(Sarcina
lutea)、金黄色葡萄球菌(Staphylococcus aureus)、产气
杆菌(Enterobacter aerogenes)、大肠埃希菌(Escherichia
coli)、变形菌(Proteus vulgaris)、黑曲霉(Asperillus
niger)和白念珠球菌(Candida albicans)。
1.1.3 培养基
(1)斜面种子培养基：NaCl 19.45g，MgCl2 5.9g，
Na2SO4 3.24g，CaCl2 1.9g，蛋白胨5g，酵母膏1g，复
合盐A液(KCl 27.5g，Na2CO3 8g，柠檬酸铁 5g，水
1000mL)20mL，复合盐B液(SrCl3 4g，KBr 80g，H3BO3
22g，Na2SiO3 4g，(NH4)2SO4 1.6g，Na2HPO4 8 g，水
1000mL)1mL，琼脂20g，水1000mL，pH7.5；(2)液体
种子培养基：葡萄糖15g，甘露醇5g，蛋白胨10g，
牛肉膏2g，CaCO3 1g，NaCl 20g，其它成分同斜面培
养基；(3)发酵培养基：葡萄糖20g，蛋白胨5g，大豆
粉5g，酵母膏1g，NaCl 20g，CaCO3 1g，复合盐A液
20mL，复合盐B液1mL，水1000mL，pH7.5；(4)营
养琼脂(nutrient agar，NA)：牛肉膏3g，蛋白胨10g，
NaCl 5g，琼脂20g，水1000mL，pH7.5。
1.2 抗菌活性初筛
将保存的菌种经斜面活化后，刮取一支成熟的
斜面菌体，接种于装有80mL发酵培养基的500mL摇
瓶中，200r/min，28℃培养96h。发酵液5000r/min离
心10min，取上清液，采用标准的琼脂扩散法[17]测定
发酵上清液抗菌活性。每管加上清液20µL，每个样
品重复3次，28℃培养48h，记录抑菌结果并测量抑
菌圈直径。
1.3 抗菌活性复筛
经初筛后有抗菌活性的菌株进行复筛。复筛菌
株发酵采用复发酵法：250mL摇瓶装液体种子培养
基50mL，经接种后液体种子培养基28℃，200r/min
振荡培养48h；再按10%接种量接入发酵培养基中，
200r/min，28℃培养96h。采用琼脂扩散法测定发酵
上清液抗菌活性，每个样品重复3次。
1.4 基于16S rRNA基因序列的系统发育分析
基因组DNA的提取、16S rRNA基因的PCR扩
增、PCR产物的纯化及对纯化后的产物测序均按
Key words Anthopleura xanthogrammica; Bacteria; Screening of antibacterial activity; Phylogenetic analysis;
Identifi cation
黄海葵相关细菌抗菌活性菌株的筛选及其初步分类鉴定 刘祝祥等
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Cui等使用的方法 [18]进行(测序过程由宝生物公司
完成)。扩增和测序用一对细菌通用引物：正向引
物PA(8-27f：5′-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3′)
和 反 向 引 物 P B ( 1 5 2 3 - 1 5 0 4 r ：
5′-AAGGAGGTGATCCAGCCGCA-3′)。所得序列提
交GenBank注册，获取序列号。根据测序结果，用
Blast搜索软件从GenBank、EMBL和DDBJ等公共数据
库中调出相似性较高的相关菌株的16S rRNA基因序
列，用CLUSTAL X[19]进行多序列比对，并用MEGA
4.0(Molecular Evolutionary Genetics Analysis)软件包
采用邻接法(Neighbor-Joining)进行聚类分析和构建系
统进化树[20]。重复取样1000次进行自展值(Bootstrap
value)分析以评估系统进化树的拓扑结构稳定性[21]。
1.5 生物学特性
按照文献[22]的方法进行形态特征和生理生化特
性实验。
2 结果与分析
2.1 抗菌活性物质产生菌的筛选
2.1.1 初筛
用管碟法对126个菌株进行抗菌活性初筛，统计
至少对一株指示菌有抗菌活性的菌株，发现有67株
菌的发酵产物具有抗菌活性，占供试菌株的53.2%。
126株菌分别对8种指示菌拮抗的结果见表1。
2.1.2 复筛
对67株抗菌活性阳性菌株进行复筛，发现9个菌
株的发酵产物抗菌活性较强、抗菌谱较广，占全部
供试126株菌的7.1%，具体结果见表2。从表2可以看
出：JSM 073124抗菌活性最强，对7种指示菌均有抗
菌活性；其它8个菌株也对4种以上指示菌有拮抗作
用；JSM 073032、JSM 073066和JSM 073124还对两
株供试真菌均显示了拮抗活性。
2.2 形态观察及生理生化特征
对9株抗菌效果较好的菌株进行了培养特征、显
微形态和生理生化特征等生物学特性的实验，结果
见表3。从表3结果发现：9株抗菌效果较好的菌株，
有5株为革兰阳性菌株，其余4株为革兰阴性菌株；9
个菌株的NaCl耐受范围广(0~25％ NaCl)，最适生长
盐浓度范围从2%~15%，均为中度嗜盐菌[23]；其它生
物学特征见表3。
2.3 部分活性菌株系统发育分析及初步鉴定
对9株抗菌活性较强、抗菌谱较广的菌株进行
基因组DNA提取、16S rRNA基因PCR扩增后送测序
后，所得序列提交GenBank注册，序列号见系统发
育树(图1)。根据Blast结果和基于16S rRNA基因序列
的系统发育分析结果表明，9个菌株与其系统发育
关系最密切且有效发表典型菌株相似程度分别为：
JSM 073066为97.73%、JSM 073099为99.85%、JSM
073013为100%、JSM 073085为98.75%、JSM 073081
为99.86%、JSM 073095为97.99%、JSM 073032
为98.12%、JSM 073119为99.87%和JSM 073124
为98 .60%。这9个菌株分属于3个大的发育类群
(Firmicutes、Actinobacteria和Proteobacteria)中的6个科
(Bacillaceae、Dermabacteraceae、Nocardiopsaceae、
Halomonadaceae、Pseudoal teromonadaceae和
Vibrionaceae)的7个属(Bacillus、Brachybacterium、
H a l o b a c i l l u s、H a l o m o n a s、N o c a rd i o p s i s、
Pseudoalteromonas和Vibrio)。
按照图1系统发育树，综合分析9个菌株系统发
育关系，结合生物学特性，并和系统发育关系最近
且有效发表典型菌株生物学特性比较，可以初步
鉴定JSM 073066和JSM 073099为Bacillus属菌株；
JSM 073085为Brachybacterium属菌株；JSM 073095
和JSM 073032为Halomonas属菌株；JSM 073013为
Halobacillus属菌株；JSM 073081为Nocardiopsis属菌
株；JSM 073119为Pseudoalteromonas属菌株和JSM
073124为Vibrio属菌株。
3 讨论
首次对黄海葵相关原核微生物抗菌活性进行了
研究，经初筛和复筛发现126株黄海葵相关微生物
中有67个菌株发酵液具有至少抑制一种指示菌的抗
菌活性，占供试菌株的53.2%；在67株具抗菌活性
的微生物中，有9株具有较强的抗菌活性，占供试
菌的7.1%。在获得抗菌活性菌株中，抗白念珠球菌
(C. albicans)14株，占11.1%；抗黑曲霉菌(A. niger)29
株，占23.0%，显示了黄海葵相关微生物具有较重要
的利用价值。
根据已有的报道，海洋抗菌活性物质产生菌
株主要集中在交替单胞菌属(Alteromonas)、节杆
菌属(Arthobacter)、芽孢杆菌属(Bacillus)、黄杆菌
属(Flavobacterium)、微球菌属(Micrococcus)、莫
拉菌属(Moraxella)、假单胞菌属(Pseudomonas)、
交替假单胞菌属(Pseudoalteromonas)，小红卵菌
属(Rhodovulum)，玫瑰杆菌属(Roseobacter)，红细
菌属(Ruegeria)，希瓦菌属(Shewanella)，葡萄球
菌属(Staphylococcus)，弧菌属(Vibrio)，着色菌属
中国抗生素杂志2011年6月第36卷第6期
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表1 黄海葵相关微生物抗菌活性筛选结果
Tab. 1 Screening result of antimicrobial strains isolated from Anthopleura xanthogrammica
Indictor microoganisms S. lutea S. aureus E. coli P. vulgaris B. subtilis C. albicans A. niger E. aerogenes
No. of positive strains 37 21 12 16 26 14 29 8
表2 黄海葵相关微生物抗菌活性复筛结果
Tab. 2 Secondly screening results of antimicrobial strains isolated from Anthopleura xanthogrammica
Strains
Indicator microorganisms (diameter of inhibition zone/mm)
S .lutea S .aureus E. coli P. vulgaris B. subtilis C. albicans A. niger E. aerogenes
JSM 073013 8 9 8 - 8 - - -
JSM 073032 - - - 9 8 9 10 8
JSM 073066 8 - - - 8 8 9 -
JSM 073081 8 - - 8 9 8 - 8
JSM 073085 9 8 - 8 9 - 11 -
JSM 073095 12 9 - 9 - - 8 -
JSM 073099 9 - - 8 8 8 - 9
JSM 073119 8 8 - - 10 - 9 8
JSM 073124 9 9 - 10 8 9 9 9
“-”: negative.
表3 9株抗菌活性菌株的生物特性表
Tab. 3 Biological characteristics of the 9 antimicrobial strains
Characteristics 1 2 3 4 5 6 7 8 9
Cell morphology Rod Short rod Rod Ovoid Filamentous Short rod Short rod Rod Curved rod
Gram stain + + + + + - - - -
Growth conditions:
NaCl concentration (%, w/v):
Range 0.0-20.0 0.0-20.0 0.5-25.0 0.0-10.0 0.0-15.0 0.5-20 0.0-20.0 0.0-25.0 0.0-25.0
Optimum 5.0-10.0 3.0-5.0 10.0-15.0 2.0-5.0 5.0 5.0-10.0 5.0-10.0 5.0-10.0 10.0-15.0
pH for growth:
Range 6.5-10.5 6.0-10.0 6.0-11.0 6.0-10.0 6.0-10.0 6.0-10.0 6.0-10.0 5.0-11.0 6.0-11.0
Optimum 7.0-7.5 7.0-8.0 7.0-8.0 7.5-8.0 7.0-8.0 7.0-8.0 7.0-8.5 7.5-8.0 6.5-7.5
Oxidase + + - - - + + + +
Peroxidase + + + + + + + + +
Nitrate reduction + + + + - + + - -
Methyl-red + + + + - - - - +
V-P reaction + - - + + - - + -
Hydrolysis of :
Casein - - + - - - - - -
Starch + + - - - - - - +
Glutin + + - - - - - - +
Urease - - - - - - - - -
Tween 20 - - - - - - - - -
Tween 40 - - - - - - - - +
Tween 60 - - - - - - - - +
Tween80 - - - - - - - - +
Chitin + + + - - - - - -
“+”: Positive; “-”: negative. “1”: JSM 073066; “2”: JSM 073095; “3”: JSM 073013; “4”: JSM 073085; “5”: JSM 073081; “6”: JSM 073099; “7”: JSM
073032; “8”: JSM 073119; “9”: JSM 073124.
黄海葵相关细菌抗菌活性菌株的筛选及其初步分类鉴定 刘祝祥等
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(Chromatium)等属的菌株[24-25]；而本文鉴定的9株抗
菌活性菌株分别属于芽孢杆菌属(Bacillus)、盐芽孢
杆菌属(Halobacillus)、短杆菌属(Brachybacterium)、
拟诺卡菌属 ( N o c a r d i o p s i s ) 、盐单胞菌属
(Halomonas)、交替假单胞菌属(Pseudoalteromonas)
和弧菌属(Vibrio)，其中只有芽孢杆菌属、交替假单
胞菌属和弧菌属是常见的抗菌活性物质产生菌属，
而另外4个属为不常见抗菌活性物质产生菌属，这
扩展了海洋抗菌活性物质产生菌株在分类学中所占
的范围。9株菌的系统发育分析表明，它们分属3个
门、6个科和7个属，反映了黄海葵相关微生物抗菌
活性菌株具有一定类群多样性。
此外在9株具有较强抗菌活性菌株中，属于弧菌
属的JSM 073124，由于其生长速度快，适应环境的
能力强，产生的抗菌活性物质抗菌谱广，具有很好
的开发价值，其确切抗菌机制值得进一步研究。
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nucleotides.
图1 根据16S rRNA基因序列构建的9株具有抗菌活性菌株的系统发育树
Fig. 1 Neighbor-Joining tree constructed based on 16S rRNA gene sequence analysis showing the phylogenetic relationships of the 9
antimicrobial strains and their closely related taxa.
(下转第425页)
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