全 文 ：食 )l {菌学报 x 994 . l ( 2 ) : ; , 2~ : ;〔
A e t a E d u l i s 厂 “ n g i
裂褶菌发酵生产苹果酸的提取和鉴定
钱秀萍 杨庆尧
州二海饰范大宇 . 上海 2 0 02 3 4 )
摘 要 裂褶 1打 (S。· h i: ( ,夕协 [l“ , , : e o , n冲 : : ; , `。 )的液休绍 养基能发醉产·生苹果 酸 经 x o天振荡培
养后 , 发醉液 r }, 的苹果酸积累员为 16() o m g八 0() m l。 ’共月离子交换法设取的攀里峻 纤纸层析鉴定其
h R f值为 6 1 . 6 熔点为日7一 1 0 0 ℃ , 旋 尤 度 丁。 飞 、 二 一 5 , O , 幻 外谱的 吸 收高峰在 3 2 0 0 c m 一 ’ 、
1 7 0 O c m
` 、
1刁OU c m 弓 、 1 30 0口 n 一 , 、 1址QO小 n 一喻踢 6 OC 二 、 两少近 结果与红准苹果酸一致 -
关键词 裂褶菌 ; 发醉 ; 苹果酸 ; 提取 ; 鉴定
L 一苹果酸是 食品 一〔业和制药 j二业的 爪安原料 . 在食 !、六市场上有取代柠檬酸的趋势 , 脚 内
外制取苹果酸除 犷直接从果实中提取外 ` ’ 主妥采用酶法和化学合成法 f ’ 一 3飞。 近年来还升发 了
发酵法 , 国外已经对黄曲霉 ( A sP e gr : l l us / lat , : ` 。 )“ 、 米 曲霉 ( A . o yr 二:e) ` , 、 黑曲霉 ( A . ilr -
g e r)
￡` 〕、 寄生 I也霉 (八 . 尹a r a s i t i a u动“ l 、 出芽短梗霉 (八 、 ,·。 o b a s id i u , , : 刀 : 、 l l u l a n 、 ) f ` } 胶质 一 卜李万f省
协 f七r u l i u s t r e m e l l o s u s )〔 ” 、 拟青霉 ( P a e e i l o n妙 。 e s o a r i o t i梦’ 、 裂褶 菌 ( 5 . e o m o u n e )“ ` ” ” ’ ` ’ 等
发酵法生产苹果酸进行了研究 。 而国内只研究 了曲霖发酵生产苹果酸 : ’ ` ’ 。 : . 迄今未见报道利川
担子菌发酵生产苹果酸 . 本研究试图利川高等真菌裂褶菌发酵生产苹果酸 并对苹果酸进行提
取和鉴定 。
1
. 材料和方法
1 1 菌株
裂褶菌 (S c h讼 op 梅 “ “ m co m m u en )一 4由上海师范大学菌物研究室提供 .
L Z 培养基
1
.
2
.
] 斜面培养基 P D A士吝养纂 、
1
.
2
.
2 发酵培养基 葡萄糖 59 . 稍 酸钱 0 . 19 , 磷 酸二 氢 钾 0 . 19 , 硫酸镁 0 . 5 9 , 抓化钾
0
.
0 5 9
, 碳酸钙 3 9 (分消 ) . 水 l o o m l 。
1
.
3 培养条件 培养荃在 I O7 . 8 7K P a 一「灭菌3 0分钟 , 装量 2 5m l / 2 5 0m l , 接种量8 % , 2 7 OC振
荡培养 ,振荡频率为 15 0一 1 60r m/ i no
1
.
4 测定分析
1
.
4
.
1 生长童的测定 取发酸醒 I OOm l , 过滤 , 菌丝体在 1 05 ℃下烘干至恒重 ,称重 .
1
.
4
.
2 p H值 25 型酸度士l测 p H位 .
1
.
4
.
3 还原糖的侧定 于!{D N S法 ` 】” 。
1
.
4
.
4 纸层析法 以正 J一醉 : 8() %甲酸 `水 (4 : 1 : 1 . v/ v) 为展开剂 `” ’ , 0 . 5 % 澳酚兰的乙醇
收稿日期 : 19 94一 0 9一 1 2初稿 ;王99 4一 2 1一 0 7修改稿 .
DOI : 10. 16488 /j . cnki . 1005 -9873. 1994. 02. 007
2期 钱秀萍等 :裂褶菌发酵生产苹果酸的提取和鉴定
( 95 % )溶液为显色剂 ` ’ `土。
1
.
4
.
5 L一苹果酸的定量测定 用 2 .7一蔡二酚法 ` ” ’ 。
1
.
4
.
6 红外吸收光谱分析 采川滨化担tl压片法 , 使用 A l p h e C e n t u n r i (M a t t s o o I n
s t r u m e n t I n e
.
) 红外谱测定仪 。
1
.
4
.
7 旋光度的测定 ` ’ ` 1 使用W X G 一 4小型旋光仪 。
1
.
4
.
8 熔点的汉lJ定 采月3T h i e l o s管法 ` ” J。
2
. 结果和讨论
2
.
1 裂褶菌生长及产苹果酸的发酵动力学
裂褶菌菌株经过种 子培养后 , 转接于液体培养基中进行振荡发酵 。 发现裂褶菌发酵能产生
苹果酸 (图 i) , 并且随着发酵时问的延长 ,苹果酸产量连续增加 ,最高产量出现在第 10 天左右 , 每
1 0 Om l发酵液产苹果酸 16 Oi0 n g 。 卜1寸测定裂侣菌菌丝体的生长量以及发酵液中 p H和残糖的变
化 , 发现菌丝体的报大生 长星出现在第 7天左右 , 培养纂 中残糖含量从第3夭起急剧下降 , 到第
10 天基本耗尽 , 而发酵液日` p H彼动下大 始终稳定在p H 6左右 。
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图1 裂褶菌生长及产苹果酸的发醉动力学
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.
1 M y
e e l i u m g r o w t h a n d m a l a t e 一 p r o d u e i” 9 fe r m e n t a t i o n d y n a m ie s o f 5
.
co m m
“ ne
1
. 苹果酸 M a l a t e ;
2
. 菌丝休 于正 D r y w o i g h t o f m y e e l in m ;
8
.
P H
4
. 残糖 · R e s i d u a l s u g a r ·
以上结果表明 :在发酵初期 (0 ~ 3天) . 裂褶菌利用葡萄糖主要进行细胞的构建 , 以后进人次
级代谢过程 , 第10 天苹果酸产量达到最高值 , 以后产量下降. 产量的下降可能是由于作为碳源
的葡萄糖耗尽 , 以及担负生产苹果酸的系统衰弱所致 “ 1 .
2
.
2 发酵液中苹果酸的提取
根据参考文献 「” ” , 裂褶菌发酵液中的苹果酸以可溶性钙盐的形式存在 . 将发酵液加人 7 3 2
3 4 食 用 菌 学 报 】卷
强酸性阳离子交换树脂柱 , 用蒸馏水洗脱 , 收集p H 3 , O一 4 . 0的流出液 , 洗脱液在旋转蒸发器中
于 5 0一 60℃ 真空浓缩至原体积的 1 / 2 0 , 浓缩液以 1 ’ 1加冲5 % 酒精 , 除去絮状沉淀 , 滤液蒸发后 , 用乙醚萃取 , 除去乙醚 ,得粉末状白色苹果酸粗制品 .
2
.
3 样品鉴定
2
.
3
.
1 纸层析 分别将 I Om g延胡索酸 、 城拍酸 、 标准苹果酸和样品溶于 2m l 95 %的乙醇
中 。 用毛细管 (图 2) 在新华层析滤纸 ( n x 14 c m )上点样 , 于正丁醇 : 8 0沁甲酸 : 水 (4 : 1 : l) 溶剂系
统中展开 , 滤纸干燥后用0 . 5 %嗅酚兰乙醉溶液显色 , 结果在兰紫色背景上斑点呈黄色 . 延胡索
酸 、 珑拍酸和苹果酸的h R唯分别为 94 . 3 、 82 . 1和 61 . 5。 样品中主要是苹果酸 , 也含有少量墟拍
酸和延胡索酸 .
.
二 ,…,一沼ù二
图 2 样品与标准品的纸层析图谱
F i g
.
2
’
P a p e r e h r o m a t o g r a m o f t h e s a m P l e a n d t h e s t a n d a r d s a m p l e s
1
. 延胡索酸 F u m a ir e a e i d ;
2
,珑拍酸 S u e e i n i e a e i d ;
3
.苹果酸 M a l i a e i d ;
4
.样品 S a m p l e ;
5
. 样品 + 苹果酸 S a m p l e + M a l i e a e i d ,
2
.
3
.
2 红外吸收光语分析 采川澳化钾压片法 , 在 A lp h e C e n t u n r i (M a t t s o n I n s t r u ·
m en t nI c
.
) 红外侧定仪上检测样品与标准苹果酸的红外谱 , 结果如图3 , 样品与标准苹果酸均
在 3 2 0 0 e m弓 、 1 7 0 o em 叶 、 i 4 o o e m 月 、 l s o o e m 月 、 12 0 0 e m 一` 和6 6 O em 曰附近有吸收高峰 , 此结果与
S e i T a e h ib a n a的报道 ￡` ” 基本一致 。
2
.
3
.
3 旋光度的侧定 采用钠光谱的D 线 (589 . 3召m ) , 在W X .G 4旋光仪上测 定样 品 旋
光 度 。 测 定 管 长 度 为 Zd m , 样品浓度为8 0m g八 Oo m l , 温度为2 5 ℃ . 结 果 偏 振 光 向 左 旋 转 ,
〔 : 〕言 二 一 .5 .0 而文献 ` ” ’也报道 L 一苹果酸的水溶液为左旋 (浓度小于 34 % ) 。
2期 钱秀萍等 :裂褶菌发酵生产苹果酸的提取和鉴定
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图 3标准苹果酸 (上)和样品(下)的红外光谱图
F i g
.
1 3” fr are d spe e t r ao f D L一 m al ie e ai d( u pP e r) an dt h e s amP le ( l ow e r)
2
、
3
.
4 熔点的测定 采用T h ie l郎管法 ` ” 〕 测定样品的熔点 , 熔点为 97 ~ 10 ℃ , 与S h of ,
e h i T a k a o 的报道 `” (m p 9 7~ x00℃ )一致 .
根据以上结果 , 我们认为裂褶菌在适宜的培养基和培养条件下能产生苹果酸 , 采用纸层
析 、 红外光谱 、 旋光 度和熔点等方法鉴定 ,提取样品的主要成分是 L 一苹果酸 .
参 考 文 献
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T h 。 吕t im u l a t i o n o ift o t s o f a e o t i e a e id a n d g ly e o l i e a e i d
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C o n v e r o i o n o f fu m a r i e a e id fe抽 e n t a眨o n t o L一m a l i e a e i d fe r m e n t a t i o n b y
36 食 用 菌 学 报 ,卷
t h e a吕s o c i a t三o n o f 左 h i之O p u s a J· r h i之“ 5 o n d rP o t e “ s t,“ 烤a r i 3 . J F e r m e n t ’ I毛` 1飞:飞0 1, 1 976
5 4 (4 )
: 1 9 7~
,
204
.
7 T a k a o S
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o r g a n i e a e i d p r od u e t i o n 衍 b a s i d i o m y e e t e s l . s e er e n i n g o f a e i d一 p r o ( iu e 一n g s t r a i n s .
A即 I M i e r o b i o l . 19 65 . 1 3 (5 ) : 7 3 2一 73 7
8 T a k a o S
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T a n i d a M
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K u w a b a r a H
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L 一m 往l i e a e i d p r ( ) d u e t io n fr o m no n 一su g a r e a r h o n 。。世 c e s b y
尸翻 i l o n勺. Ces 四 r i o 艺1 . J F e r me n t 吸 e h n o 王, 19 77 . 6 5 (2 ) : 1 96~ 1 9 9 .
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1 3 T a e h i b a n a 5
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S t u d i o s o n C O
一if x in g 纯 r m e n t a t i o n ( I ) L 一m a l i ` a o i d p r o d u e t i o n b y
SC h坛op 勺 l l u m e o m 琳 u n e . H a k k o K o g a k u Z a s s h i , 1邻 6 . 4 4 (2 ) : 12 9一 1 3 2 .
1 4 T a s址h i k o H a n a i . C R C H a n d b o o k o f C h r o m a t o g r a p l 、 y : P h o n o l s a n d o r g a n i e A e i d s F l o r i d a :
C R C W e s s
,
1 9 82
.
V o l u m e l : 139一 20 0 .
15 G o o d b a n E
,
S t a r k J B
.
R a p i d m e t h o d fo r d e t
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T h e E x t r a e t i o n a n d I d e n t i if C a t i o n o f M
a l a t e P r o d u e e d
b y F e r m e n t a t i o n o f S e h i之op 勿 l l u m e o m m u n e
Q i a n X iu p i n g Y a n g Q i n g y a o
(S h
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ng h
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a e h e尸 5 U n i v e玛 i妙 , S h a ng h a f 2 C0 23 4 )
A b s t r a e t T h o l i q u l d m e d i 、 l m o f S e h i之op l:夕[ l“ 川 e o m 功 u , ; ` e a n b e 几 r xn o n t e d t o p or d u e e ln a [a t e .
A ft e r hs a k i n g e u l t i v a t i o n fo r 1 0 d a y s
,
t l , e a e e u m u 支a t c d a m o u n t o f m a 丈跳 t c i n t b o f C r m e n t e d l i q u o r i。
1 60 0 m g八 0 0 n z l . T h e n l执 l认 et
p a P e r c hr o m a t o g r a P ll y
.
t il 。
仁“ ]尝 ,
1 70倪 m气
m a l a扭 .
一 5 . 0 , a n d t h e
、
14 00 e m 愧 , 130 0 c zn 一 ,
元5 e x t r 认 c t c d by 孟o n 一 e x c h a n g c m e t h o d . T l飞r o u g h t il e 生d e n t i n e a t i o n by
h R于、 f v a l u e 1 5 G I . 5 , 元t s fu s i n g p o i n t 15 9 7~ 10 0℃ , i t s o p t i e a l a e t i v i t y 15
a b s o r P t i o n p 。 ;叉k s o f t h e i n fr a er d s P o e tr u m a r e n e a r 3 20 )` e m
` 省、
12 0() e m
一 , a n d 6 0 o n l
一 , T h e r e s u l t e o r r e s P o n d s w i t h t h e s t a n d a r d
K e y w o r d s cS h i之op g3’ l l u m e o 琳m “ n c ; F e r m e n t a t i o n ; M a l是夏t c : E x t r a e t i ( Jl l , Id e n t i 6 c a t i o n .